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Cromatografia2014,1, 141-158; doi:10.3390/cromatografia1030141

ACESSO LIVRE

cromatografia
ISSN 2227-9075
www.mdpi.com/journal/chromatography
Artigo

Um método HPLC de exclusão de tamanho para avaliar os impactos

individuais de açúcares e ácidos orgânicos no sabor global da bebida
por meio de valores calculados de dose acima do limite

Luís G. Dias1,*, Cédric Sequeira1,†, Ana CA Veloso2,3,†, Jorge Sá Morais1,†, Mara EBC Sousa1,†
e António M. Peres4

1
CIMO—Centro de Investigação de Montanha, Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de
Bragança, Campus Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301-855 Bragança, Portugal;
E-Mails: cedric.bs@hotmail.com (CS); jsamorais@ipb.pt (JSM);
mebsousadias@gmail.com (MEBCS)
2
Instituto Politécnico de Coimbra, ISEC, DEQB, Rua Pedro Nunes, Quinta da Nora, 3030-199
Coimbra, Portugal; E-Mail: anaveloso@isec.pt
3
CEB—Centro de Engenharia Biológica, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, 4710-057 Braga,
Portugal
4
LSRE—Laboratório de Engenharia de Separação e Reacção, Laboratório Associado LSRE/LCM, Escola
Superior Agrária, Instituto Politécnico de Bragança, Campus Santa Apolónia, Apartado 1172,
5301-855 Bragança, Portugal; E-Mail: peres@ipb.pt

† Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho.

* Autor a quem a correspondência deve ser endereçada; E-Mail: ldias@ipb.pt ;

Tel.: +351-273-303-323; Fax: +351-273-325-405.

Recebido: 22 de agosto de 2014; na forma revisada: 11 de setembro de 2014 / Aceito: 15 de setembro de 2014 /
Publicado: 19 de setembro de 2014

Abstrato:Neste trabalho, foram determinados os principais ácidos orgânicos (cítrico, málico e

ascórbico) e açúcares (glicose, frutose e sacarose) presentes em bebidas comerciais de frutas
(refrigerantes de frutas, néctares de frutas e sucos de frutas). Foi desenvolvido um novo método
isocrático de cromatografia líquida de alto desempenho com exclusão de tamanho, com detectores de
ultravioleta e índice de refração acoplados em série. Esta metodologia permitiu a quantificação
simultânea de açúcares e ácidos orgânicos sem qualquer pré-tratamento da amostra, mesmo quando
ocorreram interferências de pico. O método foi validado internamente, apresentando boa linearidade (R
> 0,999), limites de detecção e quantificação adequados (20 e 280 mg L−1, respectivamente), precisões
instrumentais e de método satisfatórias (desvios padrão relativos
Cromatografia2014,1 142

inferior a 6%) e precisão aceitável do método (erro relativo inferior a 5%). Perfis de açúcares e ácidos
orgânicos foram usados para calcular os valores de dose acima do limite, com o objetivo de avaliar seu
impacto sensorial individual na percepção global do sabor da bebida. Os resultados demonstraram que
sacarose, frutose, ácido ascórbico, ácido cítrico e ácido málico têm o maior impacto sensorial individual
no sabor geral de uma bebida específica. Além disso, embora os ácidos orgânicos estivessem presentes
em concentrações menores que os açúcares, sua influência no sabor foi significativa e, em alguns casos,
maior que a contribuição dos açúcares para a percepção sensorial global.

Palavras-chave:cromatografia liquida; validação interna do método; bebidas de frutas; valor de

dose acima do limite; análise do componente principal

1. Introdução

O consumo de bebidas à base de frutas tem aumentado nos últimos anos,

principalmente devido aos seus atributos sensoriais apreciados. Estes tipos de bebidas
incluem refrigerantes (percentagem mínima de sumo adicionado inferior a 25%), néctares
de fruta e bebidas à base de sumos de fruta (percentagem mínima de sumo adicionado
superior a 25%) [1]. O sabor geral bem equilibrado de uma bebida específica é
influenciado pela percepção do gosto doce e ácido, que pode ser avaliado usando os
teores de açúcares e ácidos orgânicos da bebida [2-5]. Além disso, conhecer o teor de
açúcares permitiria o cálculo de importantes índices saudáveis, como carga glicêmica e
taxa de intolerância à frutose, conforme descrito em um trabalho recente de nossa equipe
de pesquisa [6]. Portanto, considerando o impacto desses parâmetros sensoriais e
saudáveis na aceitabilidade de uma bebida específica pelo consumidor,

As concentrações de açúcares e ácidos orgânicos em bebidas são geralmente quantificadas usando cromatografia
líquida em uma única execução [8-11] ou execuções separadas [12-20]. O uso de detectores ultravioleta (UV) ou arranjo de
fotodiodos (DA) e um detector de índice de refração (RI) ou um detector de dispersão de luz evaporativa (ELSD) permite
quantificar ácidos orgânicos e açúcares, respectivamente. No entanto, a ocorrência de interferências, como picos
sobrepostos, foi relatada durante a análise de suco de frutas. Péreze outros[12] observaram a coeluição de frutose/ácido
málico e glicose/ácido tartárico, quando uma eluição isocrática (8,5 mN H2ENTÃO4aquosa) foi realizada usando uma coluna
de polímero de troca catiônica de hidrogênio. A análise foi feita em corridas separadas, após as etapas de pré-tratamento da
amostra de limpeza ou fracionamento. Chinnicie outros[13] observaram a coeluição de ácidos málico/quínico, ácidos
succínico/chiquímico e frutose/ácido quínico, usando uma eluição isocrática (solução aquosa de ácido fosfórico 1 mN) com
uma coluna à base de resina de troca catiônica de forma de hidrogênio Aminex. Corridas separadas foram realizadas após a
etapa de limpeza de uma amostra. Eyeghé-Bickonge outros[11] relataram picos de separação não resolvidos entre ácido
málico e frutose para a análise de bagas de videira, usando também uma coluna de troca catiônica Aminex com H aquoso 5
mM2ENTÃO4, como a fase móvel isocrática. A mesma interferência também foi encontrada por Carballoe outros[20], para
uma análise de duas execuções, usando uma coluna de troca aniônica polimérica (com solução aquosa de NaOH 80 mM
como eluente) e uma coluna de exclusão iônica na forma de hidrogênio (usando
Cromatografia2014,1 143

solução aquosa 5 mM de H2ENTÃO4como eluente). No entanto, poucos desses trabalhos relatam a validação do método

analítico de HPLC [11–13,20] e apenas um relata a quantificação simultânea de açúcares e ácidos orgânicos em uma única

execução [11].
Assim, no presente trabalho pretendeu-se desenvolver um método de HPLC isocrático simples utilizando, pela
primeira vez, uma coluna de exclusão por tamanho, para a rápida separação e quantificação dos ácidos e açúcares
orgânicos majoritários em refrigerantes e bebidas de fruta. Uma única corrida cromatográfica, usando um eluente à
base de água, foi considerada. Para superar possíveis problemas de interferência (por exemplo, sinais de pico
sobrepostos), uma abordagem multivariada para quantificar esses compostos foi considerada para manter a
metodologia experimental o mais simples possível, evitando qualquer etapa demorada de pré-tratamento da
amostra ou injeções cromatográficas separadas [21]. O método foi validado internamente considerando linearidade,
limites de detecção e quantificação, repetibilidade, precisão e/ou exatidão. Finalmente, com base nos teores de
açúcares e ácidos orgânicos, sua contribuição individual para a percepção global do sabor foi avaliada por meio de
valores de dose acima do limite (DOT) calculados como a razão entre a concentração de cada composto no suco de
fruta e o respectivo limite de sabor [3,7]. Esse atributo sensorial foi posteriormente utilizado com o objetivo de avaliar
seu potencial para entender como as bebidas comerciais de frutas podem ser agrupadas em grupos considerando o
impacto de compostos individuais na percepção geral do sabor.

2. Seção Experimental

2.1. Reagentes

Todos os reagentes eram de grau analítico e usados conforme adquiridos. As soluções foram preparadas com
água deionizada. Para análise por HPLC, o eluente foi preparado com ácido ortofosfórico da Panreac. A solução
padrão de trabalho foi preparada usando padrões de açúcares e ácidos orgânicos comumente encontrados em
bebidas não alcoólicas: frutose, glicose, ácido málico e ácido acético da Fluka; sacarose e ácido ascórbico de Panreac;
ácido cítrico mono-hidratado da Fisher Scientific e ácido tartárico da Riedel-deHaën.

2.2. Amostras

Trinta amostras de bebidas foram adquiridas em fornecedores comerciais na cidade de Bragança, Portugal, incluindo

refrigerantes (15 bebidas carbonatadas açucaradas à base de frutas) e bebidas de frutas (13 néctares de frutas e 2 sucos de

frutas). A Tabela 1 apresenta informações detalhadas sobre as amostras estudadas com base nos respectivos rótulos.

Amostras com as mesmas características eram de marcas diferentes.

2.3. Preparação de padrões e amostras

Para calibração e avaliação de desempenho do HPLC, soluções padrão contendo açúcares (frutose, glicose e
sacarose) e ácidos orgânicos (ácidos acético, ascórbico, cítrico, málico e tartárico) foram preparadas dissolvendo a
quantidade necessária de cada padrão em água deionizada. Antes da análise por HPLC, todas as soluções padrão
foram filtradas através de um filtro de nylon de 0,2 μm (Whatman, Buckinghamshire, Reino Unido). Concentrações
padrão variando de 0,1 a 8,4 g L−1para ácidos orgânicos e de 0,3 a 5,2 g L−1para açúcares foram analisados em uma
única execução. As amostras de bebidas foram analisadas conforme compradas, exceto refrigerantes, que foram
desgaseificados durante 5 minutos em banho ultrassônico (Elma Transsonic 460/H, Singen, Alemanha).
Cromatografia2014,1 144

Quando necessário, amostras de bebidas foram diluídas com água deionizada. Todas as amostras de bebidas foram filtradas através

de um filtro de nylon de 0,2 μm (Whatman, Buckinghamshire, Reino Unido) e armazenadas a -5 °C até a análise.

Tabela 1.Detalhes sobre as amostras de bebidas analisadas de acordo com as informações do rótulo.

Amostra Bebida Bebida Mínimo

Principais Frutas na Composição
Número Marca Tipoa Suco %
1 A laranja, manga Néctar 45
2 A Laranja, maçã, maracujá Néctar 50
3 A Laranja Néctar 50
4 A morango, maçã Néctar 45
5 B Laranja, cenoura, manga Néctar 50
6 B Pêssego Néctar 50
7 B Cenoura, manga, tomate, maçã, maracujá, kiwi, limão Drinque suave 25
8 B Manga Néctar 30
9 B Maçã Suco 100
10 B frutas vermelhas Néctar 40
11 B Laranja Suco 100
12 B abacaxi, coco Néctar 43
13 B Pera Néctar 50
14 B Frutas uva e romã e chá verde Laranja, Drinque suave 20
15 A maçã, abacaxi, manga, damasco Drinque suave 20
16 A Abacaxi, maçã, laranja, banana Drinque suave 20
17 A Maçã, laranja, abacaxi, manga, goiaba, banana Drinque suave 20
18 C Morango Drinque suave 14
19 C Laranja, abacaxi, maracujá, damasco, goiaba, Drinque suave 20
manga, banana
20 C Abacaxi Drinque suave 20
21 C Laranja Drinque suave 20
22 D Laranja Drinque suave 10
23 D Abacaxi Drinque suave 8
24 E Laranja Drinque suave 8
25 F Laranja Drinque suave 11
26 E Abacaxi Drinque suave 6
27 F Frutas tropicais Drinque suave 12
28 B Cenoura, manga, tomate, maçã, maracujá, kiwi, limão Néctar 32
29 B Maracujá Néctar 25
30 B morango, maçã Néctar 45
Classificação de bebidas de acordo com os regulamentos legais [1].
a

2.4. Sistema de HPLC, separação e avaliação de desempenho

Um HPLC Varian ProStar equipado com uma bomba 220 (Varian, Inc., Walnut Creek, CA, EUA), um injetor manual
7725i Rheodyne, fornecido com um loop de 20 μL, um forno de coluna de cromatografia 7981 Jones (Lakewood, CO,
EUA), com um detector UV (Varian, modelo 9050, Walnut Creek, CA, EUA) acoplado a um detector RI (Varian, modelo
RI-4, Minato-K u, Japão), foi usado para separar e quantificar simultaneamente ácidos e açúcares orgânicos. Uma taxa
de fluxo de 1 mL min−1foi aplicado em uma coluna de exclusão de tamanho Supelcogel
Cromatografia2014,1 145

(SEC: modelo C-610H, 30 cm × 7,8 mm di), termostatizado a 45 °C, que foi, no melhor conhecimento dos autores, usado pela
primeira vez para análise de açúcares e ácidos orgânicos em bebidas. Foi utilizada uma eluição isocrática, com uma fase
móvel constituída por uma solução aquosa de ácido ortofosfórico a 0,1%. O software Star Chromatography Workstation
(versão 6.4, Varian Inc., Walnut Creek, CA, EUA) foi usado para aquisição de dados e integração de pico. Os ácidos orgânicos
foram detectados com o detector UV a 210 nm, enquanto os açúcares foram detectados com o detector RI. Picos
cromatográficos de açúcares e ácidos orgânicos foram identificados comparando-se os tempos de retenção de soluções de
um único composto puro com aqueles registrados para misturas padrão contendo todos os compostos analisados ou
amostras de bebidas diluídas. Os picos foram quantificados com um método de calibração padrão externo baseado em
áreas. O desempenho do HPLC foi avaliado considerando parâmetros de linearidade, precisão do instrumento e do método
(incluindo ensaios de repetibilidade e precisão intermediária) e exatidão.

2.4.1. Linearidade, Limites de Detecção e de Quantificação

A linearidade do método foi avaliada usando cinco soluções padrão mistas com diferentes concentrações dos três
açúcares e cinco ácidos orgânicos. Cada mistura padrão foi preparada independentemente medindo a massa
apropriada de cada composto para obter as faixas de concentração relatadas na subseção anterior. Devido a
problemas de coeluição relatados na literatura [11–13,20], entre alguns açúcares e ácidos orgânicos, ensaios
adicionais foram realizados. Para estudar possíveis interferências entre ácido tartárico e glicose ou ácido málico e
frutose, novas soluções padrão, com diferentes concentrações, foram preparadas misturando sete dos oito
compostos em análise, cada solução sem um dos dois ácidos orgânicos ou dois monossacarídeos acima
mencionados. Cada solução foi analisada separadamente, e as respostas em ambos os detectores (UV e RI) foram
comparadas com as concentrações conhecidas. As mesmas rodadas de calibração foram usadas para determinar os
limites de detecção e quantificação (LD e LQ, respectivamente), que foram calculados a partir dos parâmetros das
curvas de calibração, sendo definidos como 3,3 e 10 vezes o valor do erro de interceptação dividido pela inclinação,
respectivamente [22,23]. Nos casos de coeluição, foram estabelecidas curvas de calibração multivariadas levando em
consideração os dois componentes coeluídos.

2.4.2. Precisão (Repetibilidade e Precisão Intermediária)

A precisão instrumental foi avaliada por meio de ensaios de repetibilidade e precisão intermediária usando uma
solução de controle de qualidade contendo uma mistura de todos os açúcares e ácidos orgânicos estudados. A
solução de controle de qualidade foi injetada, em triplicata, no mesmo dia, nas condições de trabalho para avaliar a
repetibilidade do sistema instrumental (ou seja., variação intradiária, considerando apenas as variações intradiárias).
A precisão intermediária do sistema também foi avaliada determinando a variabilidade das respostas das injeções da
solução padrão de referência em três dias consecutivos (ou seja., variação interdia considerando variações intradias e
intradias).
A precisão do método também foi inferida com a avaliação da repetibilidade e precisão intermediária,
utilizando uma amostra de bebida para estudar possível influência da matriz. A amostra escolhida foi injetada
3 vezes no mesmo dia e 3 vezes ao dia em três dias consecutivos.
Cromatografia2014,1 146

2.4.3. Precisão

A precisão instrumental foi avaliada usando os dados de repetibilidade e precisão intermediária obtidos para a
solução de controle de qualidade. A concentração conhecida de cada composto padrão (obtida a partir dos valores
de massa utilizados) foi comparada com a concentração de cada composto calculada a partir das curvas de
calibração previamente estabelecidas.

2.5. Cálculo de valores de dose acima do limite

A contribuição do sabor de cada composto individual foi avaliada por meio do valor de dose acima do limite
(DOT), que permite classificar o impacto sensorial individual. Os valores de DOT foram calculados como a razão real
(em mol L−1) e limiar gustativo (em mol L−1) concentração para o composto em questão, sendo a concentração de
limiar de sabor na água obtida da literatura [7]: glicose: 0,090 mol L−1; frutose: 0,052 mol L−1; sacarose: 0,024 mol L−1;
ácido ascórbico: 0,00070 mol L−1; ácido cítrico: 0,0026 mol L−1; ácido málico: 0,0037 mol L−1. Valores de DOT maiores
que 1 indicam uma influência significativa de um composto específico na percepção global do sabor de um suco.

2.6. Análise Estatística

O teste de ajuste de Mandel foi aplicado para avaliar a falta de ajuste linear das curvas de calibração, com base na
suposição de que desvios relativamente grandes dos valores medidos de uma linha reta poderiam ser reduzidos por um
modelo de regressão melhor, neste caso uma função de segunda ordem [24].

Para verificar se havia diferenças significativas entre os parâmetros químicos analisados nas amostras, foi
aplicada a análise de variância de Welch (Welch's ANOVA). Esta técnica é utilizada quando os dados não apresentam
um desenho balanceado, ou seja, o número de observações não foi o mesmo em cada grupo (composto químico) e
apresentam heterocedasticidade (desvios padrão diferentes nos diferentes grupos). A ANOVA é a técnica mais
comumente usada para comparar as médias de grupos de dados de medição, seguida de umapost hocteste
considerando o método de Holm para comparações múltiplas, que permite verificar quais médias dos grupos são
estatisticamente diferentes [25].
Uma análise de componentes principais (PCA) foi aplicada, como uma técnica não supervisionada,
para reconhecer padrões nos dados DOT calculados plotando-os em um espaço multidimensional,
usando as novas variáveis derivadas como dimensões (escores fatoriais). O scree plot estimou o
número de fatores retidos no tratamento dos dados levando em conta os autovalores [26]. O PCA foi
implementado sem escalonamento variável permitindo levar em consideração o impacto sensorial de
cada composto (açúcares e ácidos orgânicos) na percepção global do sabor de cada bebida estudada,
que foi acessada por meio dos valores DOT (valores maiores que 1 indicam influência significativa no
sabor). Todas as análises estatísticas dos dados foram realizadas utilizando o pacote “stats” que faz parte
do R; uma linguagem e ambiente para computação estatística (versão 2.15.
Cromatografia2014,1 147

3 Resultados e discussão

3.1. Validação interna de HPLC

3.1.1. Linearidade, Limites de Detecção e de Quantificação

Um cromatograma típico de uma solução de mistura padrão de açúcares e ácidos orgânicos é mostrado na Figura
1. O perfil foi registrado usando uma coluna SEC operando com 0,1% de solução aquosa de ácido fosfórico como fase
móvel a 45 °C. De acordo com o conhecimento dos autores, esta é a primeira vez que tal coluna foi usada para
analisar simultaneamente açúcares e ácidos orgânicos em bebidas.

Figura 1.Cromatogramas de HPLC da Amostra 16 obtidos por um detector RI e um detector UV:

sacarose (A), Ácido Cítrico (B), glicose (C), frutose (D); Ácido Cítrico (B'), ácido málico (E'), ácido
ascórbico (F').
Cromatografia2014,1 148

Um método de execução única foi usado para amostras brutas ou diluídas, dependendo das concentrações de açúcares.

O método permitiu separar todos os analitos estudados, exceto ácido málico/frutose e ácido tartárico/glicose, que

coeluiram, mas puderam ser detectados por detectores de RI ou UV.

A Tabela 2 mostra os parâmetros gerais referentes à análise de HPLC de uma mistura de soluções padrão de
calibração preparadas para determinar a curva de calibração para cada analito, evitando problemas de coeluição. Os
resultados mostram que para cada composto avaliado obteve-se uma boa linearidade, sendo todos os coeficientes
de correlação (R) maiores que 0,999 ep-valores para o teste F de falta de ajuste (teste de ajuste de Mandel) maiores
que 0,05. A única exceção foi obtida a partir da curva de calibração do ácido tartárico, pois verificou-se que a curva de
calibração deveria ser representada por uma equação polinomial de segundo grau (p- valor de 0,002).
Os limites de detecção e quantificação de açúcares e ácidos orgânicos variaram entre 20–91 mg L−1e 60-280
mg L−1, respectivamente, que são comparáveis aos relatados na literatura [11–13,20], como pode ser inferido
pela análise da Tabela 3.

Mesa 2.Detector HPLC, faixa de concentração padrão e parâmetros da curva de calibração usando uma
solução padrão mista de açúcares e ácidos orgânicos em uma coluna de exclusão de tamanho usando
solução aquosa de ácido ortofosfórico a 0,1% como eluente.

Teste de Mandel
Detector Composto Alcance, gL−1 Inclinação ± SD, L g−1 Interceptar ± SD R
(p-valor)
sacarose [0,326–5,02] (171 ± 2) × 104 (-4 ± 5) × 104 0,9995 0,287
RI Glicose [0,321–5,02] (1950 ± 5) × 103 (-3 ± 1) × 104 0,99998 0,944
Frutose [0,348–5,13] (2060 ± 6) × 103 (10 ± 2) × 104 0,99996 0,274
Ácido Cítrico [0,114–4,62] (1055 ± 8) × 103 (−5 ± 2) × 104 0,9995 0,088
Ácido tartárico * [0,691–8,34] (1340 ± 6) × 103 (9 ± 3) × 104 0,9991 0,002
ultravioleta ácido málico [0,330–5,02] (754 ± 2) × 103 (14 ± 7) × 103 0,99995 0,256
Ácido ascórbico [0,105–1,03] (258 ± 3) × 104 (-7 ± 2) × 104 0,9994 0,372
Ácido acético [0,128–1,06] (484 ± 5) × 103 (4 ± 3) × 103 0,9992 0,069
* Curva de calibração polinomial de segundo grau: = −8,61 × 10 × + 1,42 × 10 × − 1,89 × 10 ,
R = 0,99994. Abreviaturas: SD, desvio padrão; R, coeficiente de correlação.

Tabela 3.Limites de detecção e quantificação do método HPLC proposto neste trabalho e valores
relatados na literatura para métodos cromatográficos semelhantes.

Análise de HPLC de execução única Análise HPLC de execuções separadas

Eyeghé-Bickong Pérez Chinnici carballo
Este trabalho
Composto e outros[11] e outros[12] e outros[13] e outros[20]

LD, mg LD, mg
LD, mg L−1 LQ, mg L−1 LD, mg L−1 LD, mg L−1 eu−1 eu−1
sacarose 90 270 --- 0,74 80 97
Glicose 24 74 160 1.51 70 67
Frutose 26 77 70 6.56 70 93
Ácido Cítrico 48 150 30 18.6 3.3 0,08
Ácido tartárico 77 230 20 --- --- ---

ácido málico 32 98 20 28,7 1.8 co-eluído

Ácido ascórbico 22 68 --- 8.29 --- 0,003
Ácido acético 20 60 --- --- --- ---

Abreviaturas: LD, limite de detecção; LQ, limite de quantificação.

Cromatografia2014,1 149

Com relação aos açúcares analisados, os limites de detecção obtidos foram superiores aos apresentados por
Péreze outros[12], mas inferiores aos relatados por Eyéghé-Bickonge outros[11], Chinnicie outros[13] e Carballoe
outros[20]. Em relação aos ácidos orgânicos, os limites de detecção do método proposto foram sempre superiores
aos citados em trabalhos anteriores [12,13,20], mas da mesma magnitude [11], quando empregada uma análise de
corrida única.
Portanto, globalmente, o método analítico green single-run desenvolvido neste trabalho é uma técnica
prática e adequada para a análise simultânea de açúcares e ácidos orgânicos em bebidas.

3.1.2. Quantificação de analitos coeluídos

Para superar problemas de quantificação devido à coeluição de ácido málico/frutose e ácido tartárico/glicose,
uma abordagem linear multivariada foi aplicada. Para isso, soluções de mistura padrão, com e sem esses analitos,
foram preparadas e as áreas de pico registradas com ambos os detectores. Os sinais registrados mostraram que
problemas de coeluição (picos sobrepostos) foram observados apenas para o detector RI, de forma semelhante ao
relatado por Castellarie outros[29]. Portanto, as concentrações de ácidos málico e tartárico foram calculadas usando
a resposta UV e, portanto, as concentrações de frutose e glicose, respectivamente, com base na resposta RI, foram
corrigidas de acordo com as seguintes equações (R > 0,9999):

( ) − 1,44 × 10 × , (1)
, =
1,93 × 10
( ) − 2,07 × 10 × ,
, = (2)
2,06 × 10
Nenhuma dessas duas equações tem um valor de interceptação, pois não foi estatisticamente significativa (p
-valor >0,05) e, portanto, pode ser igual a zero. Quanto aos valores do slope calculados para frutose ou glicose, eles
são semelhantes aos valores obtidos usando soluções de mistura padrão sem ácidos málico ou tartárico (Tabela 2).
Este fato mostra que as áreas sobrepostas são aditivas e, portanto, a correção proposta pode ser utilizada. Como o
ácido tartárico não foi detectado nas bebidas analisadas, não foi necessária a correção para quantificação da glicose
e, portanto, não são apresentados os dados de validação interna desse composto.

3.1.3. Precisão (Repetibilidade e Precisão Intermediária)

A precisão instrumental foi avaliada por meio de ensaios de repetibilidade e precisão intermediária usando uma
solução de controle de qualidade contendo uma mistura de todos os açúcares e ácidos orgânicos normalmente
presentes em amostras de bebidas de frutas (Tabela 4). Para ensaios intradiários, o desvio padrão relativo percentual
(RSD%) da concentração obtida para cada açúcar e ácido orgânico, por análise de HPLC, variou entre 0,7%–0,8% e
0,4%–1%, respectivamente. Para ensaios entre dias, o RSD% variou entre 0,6%–1,5% e 0,2%–2,2% para açúcares e
ácidos orgânicos, respectivamente.
A repetibilidade e precisão intermediária do método também foram estudadas usando uma amostra de bebida
selecionada aleatoriamente (Amostra 2, que corresponde a um néctar de fruta com 50% mínimo de suco adicionado).
Globalmente, para açúcares e ácidos orgânicos detectados na amostra analisada, o RSD% variou de 0,3%–2,2% e
0,2%–4,9% para ensaios de repetibilidade e precisão intermediária, respectivamente. Portanto, a precisão do método
proposto de HPLC de execução única é aceitável (RSD% inferior a 5% [22]) e semelhante à precisão da análise de
execução separada relatada na literatura (valores de RSD% variando de 0,2% a 6,6% para ensaios intra e/ou interdias
[12,13,20]).
Cromatografia2014,1 150

3.1.4. Precisão

A precisão instrumental foi avaliada usando a concentração de cada composto calculada no estudo de repetibilidade e

precisão intermediária para uma solução de controle de qualidade. A concentração conhecida de cada composto padrão

(obtida a partir dos valores de massa utilizados) foi comparada com as calculadas a partir das curvas de calibração

previamente estabelecidas. O erro relativo percentual (ER%) para todos os compostos analisados foi inferior a 5% (Tabela

4), mostrando uma precisão aceitável para o método de HPLC de execução única proposto.

Tabela 4.Avaliação de precisão e exatidão em termos de repetibilidade e ensaios intermediários usando uma

solução de controle de qualidade contendo uma mistura de todos os açúcares e ácidos orgânicos e uma

amostra de bebida.

Solução de controle de qualidadea Amostra nº 2

Composto
Média ± DP (g L−1) RSD% RÉ% Média ± DP (g L−1) RSD%
Repetibilidade
Glicose 0,719 ± 0,005 0,8 0,8 1,142 ± 0,004 0,3
Frutose 1,42 ± 0,01 0,7 2.1 2,361 ± 0,009 0,4
sacarose 0,786 ± 0,007 0,8 1.1 0,92 ± 0,01 1.4
Ácido acético 0,085 ± 0,002 2.3 3.4 d --
Ácido ascórbico 0,692 ± 0,006 1,0 2.7 0,342 ± 0,008 2.2
Ácido Cítrico 0,702 ± 0,002 0,4 1.4 2,51 ± 0,01 0,4
ácido málico 0,834 ± 0,006 0,8 1.6 2,55 ± 0,04 1.8
Precisão intermediária
Glicose 0,73 ± 0,01 1,5 1.8 1,13 ± 0,02 2.0
Frutose 1,438 ± 0,004 0,3 1.3 2,29 ± 0,02 1,0
sacarose 0,782 ± 0,005 0,6 1.6 0,913 ± 0,006 0,6
Ácido acético 0,083 ± 0,003 4.6 4.3 d --
Ácido ascórbico 0,679 ± 0,004 0,5 4.5 0,34 ± 0,02 4.9
Ácido Cítrico 0,784 ± 0,002 0,2 1.9 2,51 ± 0,006 0,2
ácido málico 0,83 ± 0,02 2.2 2.4 2,47 ± 0,07 2.9
aTrês réplicas. Abreviaturas: SD, desvio padrão; RSD%, desvio padrão relativo percentual; RE%, erro
relativo percentual; d, detectado.

3.2. Análise HPLC de Amostras de Bebidas

O método foi aplicado para avaliar bebidas de frutas comerciais (refrigerantes de frutas, néctares de frutas e sucos de

frutas) e permitir a quantificação simultânea de todos os compostos de interesse em uma análise única. Os picos dos

principais açúcares e ácidos orgânicos, nas amostras de bebidas, foram identificados comparando seus tempos de eluição

com os obtidos com padrões. O procedimento de identificação permitiu a detecção de três açúcares (glicose, frutose e

sacarose) e apenas quatro ácidos orgânicos (acético, ascórbico, cítrico e málico), sendo as concentrações médias

apresentadas na Tabela 5 para todos os compostos, exceto o ácido acético, que foi detectado apenas em seis amostras, mas

abaixo do limite dos níveis de quantificação. Os resultados mostraram que o ácido tartárico não foi detectado em nenhuma

bebida e que o ácido málico não foi detectado em nove bebidas. Todos os ácidos orgânicos foram quantificados usando as

curvas de calibração estabelecidas a partir da detecção UV e sacarose usando a resposta RI. A quantificação da frutose foi

realizada por meio da Equação (1), levando em consideração a correção da resposta do IR, conforme discutido

anteriormente. Para fins de análise estatística, quando um composto foi

Cromatografia2014,1 151

detectado em uma amostra, sua concentração foi igualada ao respectivo limite de detecção. Nos casos em que um
determinado composto não foi detectado, sua concentração na amostra foi igualada a zero.
No estudo da variabilidade dos resultados analíticos, a ANOVA de Welch indicou uma diferença média significativa
entre os parâmetros químicos (p-valor inferior a 0,001). Os resultados gerais mostraram que os açúcares têm
concentrações maiores que são estatisticamente diferentes das obtidas para os ácidos. Não houve diferenças
significativas entre os açúcares e também entre os compostos de ácido cítrico e málico (Tabela 5).

Tabela 5.Concentrações médias de açúcares e ácidos orgânicos de cada bebida analisada.

sacarose Glicose Frutose, Ácido Cítrico ácido málico Ácido ascórbico

Amostras
(g L−1) (g L−1) (g L−1) (g L−1) (g L−1) (g L−1)
1 14.2 11.3 16.1 4,96 nd 0,202
2 9.69 11.6 22.6a 2.20 2.04 0,235
3 13,0 12.9 15,0a 5.41 1.08 0,144
4 1.49 10,0 19,0a 2.76 2.31 0,140
5 14.7 13,0 20,5a 3,55 1,79 0,136
6 74,0 17.8 16.2a 1.39 2.43 0,197
7 11.6 32,0 56.3a 2.07 0,342 0,138
8 60,3 19.2 25.9 2.62 nd 0,275
9 13,0 29,7 69.3a 1.19 4,70 0,150
10 d 14.4 16.5a 2,94 1.06 0,217
11 35,0 25,0 30.2 7,85 nd 0,374
12 15.9 16.9 16.7a 2.02 1.43 0,145
13 47,5 11.7 26,5 1.22 nd 0,144
14 d 11.8 13.6 3.44 nd 0,214
15 57,0 24.2 27,8 3.23 nd 0,189
16 72,4 19.5 22.1 3.17 nd 0,212
17 42,0 32.4 38,6 3.26 nd 0,184
18 35,0 28.6 31.7 2.45 nd nd
19 42.4 28.1 33.6 3,65 nd 0,141
20 67,0 20.4 23.1 2.20 nd 0,169
21 68,5 17.9 21.5 3,74 nd 0,180
22 32,7 32.4 23.1 1,74 nd 0,157
23 38.4 36,0 30.4 1.27 nd 0,147
24 30,5 42,7 28,5 1,88 nd 0,135
25 25.2 11.5 13.1 2.61 nd 0,152
26 9.73 57,5 44,5 1.81 nd nd
27 19.3 22.2 27.1 3,65 nd 0,163
28 31.6 54.1 84,3 3.71 nd 0,201
29 76,8 26.1 29.1 7.35 nd 0,205
30 2.45 10,0 17.2 1,67 nd 0,159
ANOVAb a a a b b c
a Concentração corrigida devido à interferência do ácido málico;bAs letras (a, b e c) representam quais parâmetros são
diferentes pelopost hocteste com significância dep=0,05. Abreviaturas:nd, não detectado; d, detectado.
Cromatografia2014,1 152

3.3. Valores DOT: Contribuição para Classificação Não Supervisionada de Amostras de Bebidas

Os valores de DOT foram calculados para cada amostra de bebida de acordo com Keutgen e Pawelzik [3] e são
apresentados na Tabela 6, permitindo avaliar a contribuição de cada composto para a percepção global do sabor da
bebida. Os compostos com valores de DOT superiores a um têm um impacto sensorial individual significativo. A
análise dos valores de DOT mostra claramente que, com exceção da glicose, todos os outros compostos, quando
presentes em uma bebida específica, têm influência sensorial significativa (valores de DOT superiores a um). Além
disso, deve-se notar que a utilização dos valores de DOT permite verificar a real influência de cada composto na
percepção global do sabor de uma bebida específica, revelando que um composto presente em baixa concentração
pode ter maior impacto no sabor da bebida do que um composto mais concentrado, que é o caso dos ácidos
orgânicos. Por exemplo, o ácido cítrico está presente nas bebidas de frutas estudadas em concentrações menores do
que qualquer um dos açúcares (2 < (ácido cítrico, g L−1) < 8; 1,4 < (açúcar, g L−1) < 85), mas na maioria das amostras, o
ácido cítrico tem uma maior influência sensorial individual na percepção global do sabor da bebida (2,1 < DOTÁcido
Cítrico< 14,5; 0,2 < PONTOaçúcar< 9,5).

Tabela 6.Valores calculados de dose acima do limite para cada açúcar individual e ácido orgânico
presente em cada bebida.

Amostra Valores DOT

Número sacarose Glicose Frutose Ácido Cítrico ácido málico Ácido ascórbico
1 1.7 0,7 1.7 9.1 -- 1.6
2 1.2 0,7 2.4 4.0 4.1 1.9
3 1.6 0,8 1.6 9.9 2.2 1.2
4 0,2 0,6 2.0 5.1 4.7 1.1
5 1.8 0,8 2.2 6.5 3.6 1.1
6 9,0 1.1 1.7 2.5 4.9 1.6
7 1.4 2.0 6.0 3.8 0,7 1.1
8 7.3 1.2 2.8 4.8 -- 2.2
9 1.6 1.8 7.4 2.2 9.5 1.2
10 -- 0,9 1.8 5.4 2.1 1.8
11 4.3 1,5 3.2 14.4 -- 3.0
12 1.9 1,0 1.8 3.7 2.9 1.2
13 5.8 0,7 2.8 2.2 -- 1.2
14 -- 0,7 1,5 6.3 -- 1.7
15 6.9 1,5 3.0 5.9 -- 1,5
16 8.8 1.2 2.4 5.8 -- 1.7
17 5.1 2.0 4.1 6.0 -- 1,5
18 4.3 1.8 3.4 4.5 -- --
19 5.2 1.7 3.6 6.7 -- 1.1
20 8.2 1.3 2.5 4.0 -- 1.4
21 8.3 1.1 2.3 6.8 -- 1,5
22 4.0 2.0 2.5 3.2 -- 1.3
23 4.7 2.2 3.2 2.3 -- 1.2
24 3.7 2.6 3.0 3.4 -- 1.1
25 3.1 0,7 1.4 4.8 -- 1.2
26 1.2 3.5 4.8 3.3 -- --
Cromatografia2014,1 153

Tabela 6.Cont.

Amostra Valores DOT

Número sacarose Glicose Frutose Ácido Cítrico ácido málico Ácido ascórbico
27 2.4 1.4 2.9 6.7 -- 1.3
28 3.8 3.3 9,0 6.8 -- 1.6
29 9.4 1.6 3.1 13.5 -- 1.7
30 0,3 0,6 1.8 3.1 -- 1.3
ANOVAa ade bc abd abe bcde bc
a As letras (a, b, c, d e e) representam quais parâmetros são diferentes pelopost hocteste com significância de p
=0,05. Abreviaturas: DOT, os valores de dose acima do limite calculados têm a razão da concentração real (em
mol L−1) e o limiar de sabor (em mol L−1) para o dado composto relatado na literatura [7].

A ANOVA de Welch mostrou que havia diferenças significativas entre os valores de DOT dos compostos (p
-valor inferior a 0,001). O teste de comparação múltipla permitiu revelar quais compostos tinham valores de
DOT com diferenças significativas (Tabela 6). Os resultados mostraram que houve mais diferenças médias
observadas nos valores de DOT dos compostos do que aquelas encontradas nos resultados analíticos.
Além disso, neste estudo, os valores de DOT dos principais compostos detetados nas amostras de bebidas
(glicose, frutose e sacarose; ácidos ascórbico, cítrico e málico) foram utilizados na tentativa de verificar a existência
de semelhança entre diferentes bebidas de fruta de seis marcas portuguesas, contendo diferentes quantidades de
sumo adicionado de uma ou mais frutas (por exemplo, maçã, banana, uva, kiwi, manga, laranja, maracujá, pêssego,
pêra, ananás e/ou morango, entre outras). Este objetivo foi alcançado através da técnica estatística não
supervisionada PCA, após a divisão em dois grupos principais: bebidas contendo uma ou duas frutas (17 amostras,
incluindo dois sumos de fruta, oito néctares de fruta e sete refrigerantes) e bebidas multifrutas (13 amostras,
incluindo quatro néctares de fruta e nove refrigerantes), contendo uma mistura de quatro a nove frutas.
A PCA aplicada a bebidas contendo uma a duas frutas mostrou que as quatro primeiras funções explicam
98,9% da variância total dos dados (48,9%, 24,3%, 19,8% e 5,9%, respectivamente). Na Figura 2, é apresentada a
distribuição da amostra espacial bidimensional considerando a primeira e a segunda funções de componentes
principais.
Como pode ser observado, as amostras não foram supervisionadas e agrupadas em quatro grupos principais. O primeiro grupo (situado no primeiro quadrante, nas regiões positivas de PC1 e PC2) inclui quatro

amostras dos três tipos de bebidas, principalmente de fruta laranja, para as quais o ácido cítrico tem um impacto significativo no sabor global da bebida (valores DOT variando de 6,3 a 14,4). Pelo contrário, os açúcares têm

uma contribuição média a baixa para a percepção geral do sabor (valores DOT entre 0,7 e 4,3). No segundo quadrante (regiões negativa e positiva de PC1 e PC2, respectivamente), o grupo formado contém cinco amostras

de bebidas de abacaxi, maçã e/ou morango, também dos três tipos de bebidas, sendo caracterizadas por valores DOT médios a altos de ácidos cítrico e/ou málico (de 2,2 a 9. 5) e média a baixa contribuição de açúcares

para o sabor (valores DOT variando de 0,2 a 4,8), com exceção da Amostra 9, para a qual a frutose tem alto impacto sensorial individual (DOT igual a 7,4). No terceiro quadrante (regiões negativas de PC1 e PC2), para as

cinco amostras (néctares de frutas e refrigerantes) de uma fruta (pêssego, pêra, abacaxi ou laranja), a sacarose tem uma alta contribuição individual de sabor (valores DOT variando de 3,7 a 9,4) e o ácido cítrico tem um

impacto sensorial médio (valores DOT entre 2,5 e 3,5). Por fim, duas amostras estão no quarto quadrante (regiões positiva e negativa de PC1 e PC2, respectivamente) para as quais, embora a sacarose também tenha forte

influência no sabor (valores DOT iguais a 7,3 e 9,4), como no quadrante anterior, o ácido cítrico tem uma influência sensorial individual significativa com exceção da Amostra 9, para a qual a frutose apresenta alto impacto

sensorial individual (DOT igual a 7,4). No terceiro quadrante (regiões negativas de PC1 e PC2), para as cinco amostras (néctares de frutas e refrigerantes) de uma fruta (pêssego, pêra, abacaxi ou laranja), a sacarose tem

uma alta contribuição individual de sabor (valores DOT variando de 3,7 a 9,4) e o ácido cítrico tem um impacto sensorial médio (valores DOT entre 2,5 e 3,5). Por fim, duas amostras estão no quarto quadrante (regiões

positiva e negativa de PC1 e PC2, respectivamente) para as quais, embora a sacarose também tenha forte influência no sabor (valores DOT iguais a 7,3 e 9,4), como no quadrante anterior, o ácido cítrico tem uma influência

sensorial individual significativa com exceção da Amostra 9, para a qual a frutose apresenta alto impacto sensorial individual (DOT igual a 7,4). No terceiro quadrante (regiões negativas de PC1 e PC2), para as cinco

amostras (néctares de frutas e refrigerantes) de uma fruta (pêssego, pêra, abacaxi ou laranja), a sacarose tem uma alta contribuição individual de sabor (valores DOT variando de 3,7 a 9,4) e o ácido cítrico tem um impacto

sensorial médio (valores DOT entre 2,5 e 3,5). Por fim, duas amostras estão no quarto quadrante (regiões positiva e negativa de PC1 e PC2, respectivamente) para as quais, embora a sacarose também tenha forte influência

no sabor (valores DOT iguais a 7,3 e 9,4), como no quadrante anterior, o ácido cítrico tem uma influência sensorial individual significativa para as cinco amostras (néctares de fruta e refrigerantes) de uma fruta (pêssego, pêra, ananás ou laranja), a sacarose a
Cromatografia2014,1 154

impacto (valores DOT iguais a 4,8 e 13,5). Globalmente, os grupos não supervisionados que surgiram
considerando a contribuição sensorial individual de açúcares e ácidos orgânicos podem ser tentativamente
relacionados ao sabor equilibrado da bebida, resultante do equilíbrio entre sua doçura e acidez: bebidas de
alta acidez e baixa doçura; bebidas de acidez média e baixa doçura; bebidas de baixa acidez e alta doçura; e
bebidas de alta acidez e alta doçura. Como pode ser observado, os grupos naturalmente formados parecem
não estar relacionados com os tipos de bebida ou com o tipo de fruta presente na bebida.

Figura 2.Representação dos dois primeiros escores de componentes principais obtidos para bebidas
contendo uma a duas frutas usando os valores DOT de açúcares e ácidos orgânicos (as amostras são
identificadas pelo número e tipo de bebida de frutas: S, refrigerantes; N, néctares de frutas; J, sucos de
frutas).

O PCA também foi aplicado a bebidas multifrutas, contendo uma mistura de quatro a nove frutas. O scree-plot (dados não mostrados) permitiu verificar que apenas as três primeiras funções

deveriam ser selecionadas, o que explica 94,3% da variância total dos dados (58,8%, 28,2% e 7,3%, respectivamente). Na Figura 3, é apresentada a distribuição espacial bidimensional das amostras de

bebidas multifrutas, considerando a primeira e segunda funções de componentes principais. Como pode ser visto, as 13 amostras estão distribuídas nos quatro quadrantes considerando as funções

dos dois primeiros componentes principais, principalmente devido ao impacto sensorial individual da sacarose, frutose e/ou ácido málico. A primeira função do componente principal divide as

amostras (localizadas na região positiva ou negativa), levando em consideração a contribuição sensorial individual da sacarose para a percepção global do sabor da bebida (valores DOT variando de

4,3 a 8,8 e de 0 a 3,8, respectivamente). A segunda função separa as amostras de acordo com a influência da frutose na percepção sensorial geral da bebida, sendo seu impacto baixo ou alto para

amostras localizadas nas regiões positiva ou negativa, respectivamente. A significância do efeito sensorial individual do ácido málico permitiu refinar a distribuição espacial das amostras em cada um

dos quatro quadrantes. As amostras localizadas no primeiro e quarto quadrantes não contêm ácido málico, e aquelas localizadas no segundo e terceiro quadrantes têm ácido málico baixo a médio A

segunda função separa as amostras de acordo com a influência da frutose na percepção sensorial geral da bebida, sendo seu impacto baixo ou alto para amostras localizadas nas regiões positiva ou

negativa, respectivamente. A significância do efeito sensorial individual do ácido málico permitiu refinar a distribuição espacial das amostras em cada um dos quatro quadrantes. As amostras

localizadas no primeiro e quarto quadrantes não contêm ácido málico, e aquelas localizadas no segundo e terceiro quadrantes têm ácido málico baixo a médio A segunda função separa as amostras

de acordo com a influência da frutose na percepção sensorial geral da bebida, sendo seu impacto baixo ou alto para amostras localizadas nas regiões positiva ou negativa, respectivamente. A

significância do efeito sensorial individual do ácido málico permitiu refinar a distribuição espacial das amostras em cada um dos quatro quadrantes. As amostras localizadas no primeiro e quarto

quadrantes não contêm ácido málico, e aquelas localizadas no segundo e terceiro quadrantes têm ácido málico baixo a médio
Cromatografia2014,1 155

conteúdos, correspondendo a valores DOT baixos a médios ou valores baixos, respectivamente. De acordo com a discussão

anterior, pode-se perceber que, em geral, as bebidas localizadas no primeiro, terceiro e quarto quadrantes apresentam

sabor bem equilibrado, devido à contribuição sensorial significativa semelhante de açúcares e ácidos orgânicos, enquanto as

bebidas localizadas no segundo quadrante podem possuir maior acidez.

Figura 3.Representação dos dois primeiros escores de componentes principais obtidos para as bebidas
multifrutas contendo quatro a nove frutas usando os valores DOT de açúcares e ácidos orgânicos (as
amostras são identificadas pelo número e tipo de bebida de frutas: S, refrigerantes; N, néctares de
frutas; J, sucos de frutas).

4. Conclusões

Neste estudo, um novo método de HPLC de exclusão de tamanho verde foi desenvolvido, e seu
desempenho mostrou que pode ser aplicado com precisão para a análise simultânea, em um único
ensaio, dos principais açúcares e ácidos orgânicos presentes em bebidas de frutas comerciais. Os
resultados também demonstraram que sacarose, frutose, ácido ascórbico, ácido cítrico e ácido málico
são os compostos que detêm maior impacto sensorial individual na percepção geral do sabor de uma
bebida específica. Além disso, embora os ácidos orgânicos estejam presentes em concentrações
menores que os açúcares, sua influência sensorial na bebida global é bastante forte, com base em seus
valores DOT. Finalmente, foi mostrado que grupos de bebidas de frutas não supervisionadas formados
usando valores DOT podem estar relacionados com a percepção de sabor doce e azedo de diferentes
tipos de bebidas (refrigerantes,
Cromatografia2014,1 156

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente cofinanciado pela FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) e FEDER
(Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional) no âmbito do Programa COMPETE (Programa
Operacional Fatores de Competitividade) (Projeto PEst-C/EQB/LA0020/2013); pelo Projeto Estratégico
PEst-OE/EQB/LA0023/2013 e pelo Projeto Referência RECI/BBB-EBI/0179/2012 (Projeto Número
FCOMP-01-0124-FEDER-027462) financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia.

Contribuições do autor

Luís G. Dias e António M. Peres: montagem e desenho experimental, tratamento de dados

multivariados e preparação do manuscrito. Cédric Sequeira: ensaios cromatográficos e recolha de
amostras. Jorge Sá Morais: supervisor da análise cromatográfica. Mara EBC Sousa e Ana CA Veloso:
estado da arte, revisão dos dados e revisão do manuscrito.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Referências

1. Ashurst, PRQuímica e Tecnologia de Refrigerantes e Sucos de Frutas, 2ª ed.; Blackwell Publishing:

Hereford, Reino Unido, 2005.
2. Terry, LA; Branco, SF; Tigwell, LA A aplicação de biossensores a produtos frescos e à indústria alimentícia em
geral.J. Agric. Química Alimentar.2005,53, 1309–1319.
3. Keutgen, A.; Pawelzik, E. Modificações de compostos relevantes para o sabor em morangos sob salinidade
de NaCl.Química Alimentar.2007,105, 1487–1494.
4. Bordonaba, JG; Terry, LA Perfil bioquímico e análise quimiométrica de dezessete cultivares de groselha preta
cultivadas no Reino Unido.J. Agric. Química Alimentar.2008,56, 7422–7430.
5. Crespo, P.; Bordonaba, JG; Terry, LA; Carlen, C. Caracterização dos principais compostos relacionados ao sabor e à
saúde de quatro genótipos de morango cultivados em diferentes locais de produção na Suíça. Química
Alimentar.2010,122, 16–24.
6. Dias, LG; Sequeira, C.; Veloso, ACA; Sousa, MEBC; Peres, AM Avaliação de índices sensoriais e saudáveis
de bebidas açucaradas usando uma língua eletrônica.Anal. Chim. Acta2014, na Imprensa.
7. Scharbert, S.; Hofmann, T. Definição molecular do sabor do chá preto por meio de estudos quantitativos,
reconstituição do sabor e experimentos de omissão.J. Agric. Química Alimentar.2005,53, 5377–5384.
8. McFeeters, RF Análise de HPLC de Injeção Única de Ácidos, Açúcares e Álcoois em Fermentações de
Pepino.J. Agric. Química Alimentar.1993,41, 1439–1443.
9. Yuan, JP; Chen, F. Separação simultânea e determinação de açúcares, ácido ascórbico e compostos furânicos
por HPLC — detecção dupla. Química Alimentar.1999,64, 423–427.
10. Kelebek, H.; Selli, S.; Canbas, A.; Cabaroglu, T. Determinação por HPLC de ácidos orgânicos, açúcares,
composições fenólicas e capacidade antioxidante de suco de laranja e vinho de laranja produzidos a
partir de uma cv turca. Kozan.Microchem. j.2009,91, 187–192.
Cromatografia2014,1 157

11. Eyeghé-Bickong, HA; Alexandersson, EO; Gouws, LM; Jovem, PR; Vivier, MA Otimização de um
método de HPLC para a quantificação simultânea dos principais açúcares e ácidos orgânicos
em bagas de videira.J. Chromatogr. B2012,885–886, 43–49.
12. Pérez, AG; Olías, R.; Espada, J.; Olías, JM; Sanz, C. Determinação rápida de açúcares, ácidos não voláteis e
ácido ascórbico em morango e outras frutas.J. Agric. Química Alimentar.1997,45, 3545–3549.
13. Chinnici, F.; Spinabelli, U.; Riponi, C.; Amati, A. Otimização da determinação de ácidos orgânicos e açúcares
em sucos de frutas por cromatografia líquida de exclusão iônica.J. Food Comp. Anal.2005, 18, 121–130.

14. Wu, J.; Gao, H.; Zhao, L.; Lião, X.; Chen, F.; Wang, Z.; Hu, X. Caracterização da composição química de
algumas cultivares de maçã.Química Alimentar.2007,103, 88–93.
15. Nishiyama, I.; Fukuda, T.; Shimohashi, A.; Oota, T. Composição de Açúcar e Ácido Orgânico no Suco de
Frutas de Diferentes Variedades de Actinidia.Ciência Alimentar. Tecnol. Res.2008,14, 67-73.
16. Versari, A.; Parpinello, GP; Mattioli, AU; Galassi, S. Caracterização de sucos de damasco comerciais
italianos por análise de cromatografia líquida de alta eficiência e análise multivariada.Química
Alimentar.2008,108, 334–340.
17. Obando-Ulloa, JM; Eduardo, I.; Monforte, AJ; Fernández-Trujillo, JP Identificação de QTLs relacionados à
composição de açúcares e ácidos orgânicos em melão usando linhagens quase isogênicas.ciência Hortic.2009,
121, 425–433.
18. Muñoz-Robredo, P.; Robledo, P.; Manríquez, D.; Molina, R.; Defilippi, BG Caracterização de açúcares e
ácidos orgânicos em variedades comerciais de uvas de mesa.Chil. J. Agr. Res.2011,71, 452–458.
19. Mahmood, T.; Anwar, F.; Abbas, M.; Boyce, MC; Saari, N. Variação de composição em açúcares e ácidos orgânicos
em diferentes estágios de maturidade em frutas pequenas selecionadas do Paquistão.Int. J. Mol. ciência2012,13
, 1380–1392.
20. Carballo, S.; Zingarello, FA; Mestre, SE; Todoli, JL; Prats, MS Otimização de métodos analíticos para a
caracterização de laranjas, clementinas e híbridos cítricos cultivados na Espanha com base em sua
composição em ácido ascórbico, ácido cítrico e açúcares principais.J. Food Sci. Tecnol. 2014,49, 146–
152.
21. Sokullu, R.; Palabiyik, IM; Onur, F.; Boyaci, IH Métodos quimiométricos para quantificação simultânea
dos ácidos lático, málico e fumárico.Eng. Ciência da Vida.2010,10, 297–303.
22. Ermer, J.; McB. Miller, JHValidação de Método em Análise Farmacêutica: Um Guia para as Melhores
Práticas; Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.: Weinheim, Alemanha, 2005.
23. Snyder, LR; Kirkland, JJ; Dolan, JWIntrodução à Cromatografia Líquida Moderna, 3ª ed.; John
Wiley & Sons Inc.: Hoboken, NJ, EUA, 2010.
24. Funk, W.; Dammann, V.; Donnevert, G.Garantia de qualidade em química analítica: aplicações
em análise ambiental, de alimentos e materiais, biotecnologia e engenharia médica; Wiley-VCH
Verlag GmbH & Co.: Weinheim, Alemanha, 2007.
25. Dalgaarde, P.Estatística introdutória com R (estatística e computação); Springer: Nova York, NY, EUA,
2008.
26. Rencher, ACMétodos de análise multivariada; Wiley: Nova York, NY, EUA, 1995.
27. O Projeto R para Computação Estatística. Disponível online: http://www.r-project.org/ (acessado em 16 de
setembro de 2014).
Cromatografia2014,1 158

28. Venables, WN; Ripley, BDEstatística Aplicada Moderna com S; Springer-Verlag: New York, NY,
EUA, 2002.
29. Castellari, M.; Versari, A.; Spinabelli, U.; Galassi, S.; Amati, A. Um método melhorado de HPLC
para a análise de ácidos orgânicos, carboidratos e álcoois em mostos de uva e vinhos.J. Liq.
Cromatogr. Relat. Tecnol.2000,23, 2047–2056.

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