PROTOCOL FOR RNA CLEANUP AND PURIFICATION OF IN VITRO TRANSCRIPTS KIT QIAGEN RNA/DNA

KITS

Ao longo deste protocolo:

• Texto simples denota QIAGEN-tip 20 ou Mini Kit
• texto Single-sublinhado denota QIAGEN-tip 100 ou Kit Midi
• textos de duplo sublinhado denota QIAGEN-tip 500 ou Kit Maxi
Este protocolo é adequado para não mais do que 40 mg, 200 mg ou 1000 mg de RNA que correspondem ao
capacidades da QIAGEN-dicas 20, 100 ou 500 não mais que 0,5 ml, 3 ml ou 8 ml de ligação pode ser
processado por prep. Para volumes maiores, ampliar a quantidade de buffer QRL1 e amortecedor QRV2 nas
etapas 2 e 3, e carregar a amostra na QIAGEN-tip no passo 4, tomando cuidado para que a ponta não
transborde.

Notas importantes antes de iniciar

• Se estiver usando QIAGEN RNA Kits / DNA, pela primeira vez, por favor leia "Pontos importantes antes de
usar QIAGEN Kits RNA / DNA "(página 10).
• A amostra não deve conter SDS ou NaCl superior a 500 mm.
• Tampão QRL1 pode formar um precipitado em armazenamento. Se necessário, aquecer até dissolver.
• β-mercaptoetanol (β-ME) deve ser adicionado ao tampão de QRL1 antes da sua utilização (ver página 16).
Adicionar 10 β-ME ul por
1 ml de tampão QRL1. Tampão QRL1 é estável por um mês após a adição de β-ME.
• A solução de trabalho de tampão QRUR deve ser preparada por dissolução de 29 g de ureia em 60 ml de
Tampão QRU (ambos fornecidos com o kit). Basta deitar Tampão QRU dentro da garrafa que contém o pó e
ureia dissolver em 45 ° C. Este tampão para pronta utilização é estável durante 2 semanas à temperatura
ambiente. Se armazenado por mais tempo períodos, o pH do tampão de QRUR deve ser ajustado com HCl a
pH 7,0, imediatamente antes de usar. não autoclave.
• Calor Tampão QRUR a 45 ° C.
• Aquecer num banho de água ou bloco de aquecimento a 60 ° C.
1. pipeta de 1 ml, 3 ml ou 10 ml de Tampão QRE para o QIAGEN-tip-se equilibrar, e permitir que o
tamponar a entrar na coluna de fluxo por gravidade.
Coloque QIAGEN-dicas ou sobre os tubos utilizando os detentores de ponta fornecidos (veja a Figura 2,
página 15) ou em um QIArack sobre a bandeja de resíduos. O buffer começará a fluir automaticamente
devido a detergente na tampão de equilíbrio, que reduz a tensão superficial. Permitir que a QIAGEN-tip para
drenar completamente. a fluxo de tampão irá parar quando o menisco atinge a frita superior na QIAGEN-tip.
Isto impede a secagem de modo QIAGEN-dicas podem ser deixados sozinhos. Não force o tampão restante.
2. Mistura-se a 0,5 ml, 3 ml ou 8 mL de amostra com 0,15 ml, 1 ml ou 2,5 ml de tampão QRL1. misture
completamente em vortex ou agitação.
Adicionar 1,35 ml de 3, 9 mL, ou de 22,5 ml de tampão QRV2. Misturar bem em vortex ou agitação, e
centrifugar a 5000 x g durante 5 min a 4 ° C.
A diluição com tampão QRV2 cria condições ideais para o RNA se ligar a QIAGEN Resin.
Nota: as partículas não dissolvidas tem de ser removido por centrifugação antes do carregamento do
QIAGEN-tip
caso contrário, os baixos rendimentos de ARN e / ou o entupimento da coluna pode ocorrer.

4 Aplicar a amostra para o QIAGEN-tip, e deixe-o entrar na resina por gravidade.

Se os volumes de amostra, tampão QRL1, ea solução tampão QRV2 foram ampliados, tomar cuidado para
que o
QIAGEN-tip não transborde. Coloque a amostra em vários passos, e deixe-o entrar na resina por
fluxo de gravidade.
5. pipeta 2 ml (2 x 1 ml), 12 ml ou 28 ml de tampão QRW para o QIAGEN-tip. Permita que ele se insira
a resina por fluxo de gravidade.
Os QIAGEN-dicas são quase completamente preenchido por estes volumes. Ácidos nucleicos permanecem
ligadas à
QIAGEN resina, enquanto que contaminantes, tais como proteínas, polissacarídeos, hidratos de carbono, e
celular
metabolitos são lavados. Não forçar a saída de tampão de lavagem residual. Traços de buffer não afetará o
passo de eluição.
6. pipeta de 1 ml (ou 2 x 1 ml), * 6 ml ou 15 ml de pré-aquecido (45 ° C) Tampão QRUR para o QIAGEN-tip,
e eluir o ARN por fluxo por gravidade para um tubo de recolha de 2 ml (fornecido), ou um de 12-15 ml ou
30 mL (ou maior) o polipropileno isento de RNase ou do tubo de centrífuga de vidro.
Usando um suporte QIArack ou dica, coloque o QIAGEN-tip sobre o tubo de coleta. O RNA é
especificamente
eluído, enquanto DNA permanece ligada ao QIAGEN Resin.
Nota: Uma solução de trabalho de QRUR deve ser preparada por dissolução de 29 g de ureia em 60 ml de
Tampão QRU
(ambos fornecidos com o kit). Consulte "Notas importantes antes de iniciar".
7 Adicionar 1 volume gelada isopropanol. Misturar bem em vortex ou agitação, e incubar
em gelo durante 10 min. Centrifuga-se a 15000 xg durante 30 min a 4 ° C para precipitar o ARN.
Remova cuidadosamente o sobrenadante.
Pellets de precipitação com isopropanol pode ser difícil de ver. É útil para marcar o local esperado
do sedimento no tubo antes da centrifugação.
Nota: Se a concentração de RNA total deverá ser inferior a 2 ug / ml, a adição de 5-10, 20-30, ou
É recomendado 50-100 mg de um portador tal como tRNA ou um homopolímero RNA (não fornecido).
8 Adicionar até 0,5 ml, 2 ml ou 4 ml de etanol a 70% ao sedimento de ARN. Vortex, centrifugar a
15.000 xg durante 15 min a 4 ° C, e cuidadosamente remover o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
9 Secar o sedimento de ARN em cerca de 10 min à temperatura ambiente com o tubo
descansando de cabeça para baixo sobre uma toalha de papel.
Nota: o sedimento Overdrying tornará difícil de dissolver o ARN.
10 Dissolve-se o ARN em um pequeno volume de água livre de RNase, aquecendo o tubo durante 3 min a
60 ° C, seguido por vórtex durante 5 segundos e sacudindo o tubo fortemente. Repetir pelo menos duas vezes.
Ambos vórtex e sacudindo o tubo são importantes para dissolver completamente o ARN. As grandes
moléculas de ARN
não ser quantitativamente recuperada se o sedimento de ARN não está completamente dissolvido.
O ARN deve ser armazenado congelado a -20 ° C ou -70 ° C.