Departamento de Química

Métodos Instrumentais de Análise | Ano letivo 2022 – 2023

Folha de exercícios nº 3
Cromatografia e Eletroforese

1. Duas substâncias, A e B, têm tempos de retenção de 16,40 min e 17,63 min, respetivamente,
numa coluna de 30,0 cm de comprimento. As espécies não retidas pela coluna atravessam-na
em 1,30 min. As larguras das bases dos picos dos compostos A e B são de 1,11 min e 1,21 min,
respetivamente. Determine:
a) A resolução da coluna para os analitos em causa;
b) O número médio de pratos teóricos considerando os dois analitos;
c) A altura do prato teórico;
R.: a) Rs = 1,06; b) N = 3445; c) H = 8,70 x 10-3 cm;

2. Numa coluna de partição de fase normal, um analito apresenta um tempo de retenção de 29,1
min e os constituintes da amostra não retidos pela coluna apresentaram tempo de retenção de
1,05 min, para uma fase móvel constituída por 50% clorofórmio e 50% tolueno.
a) Calcule o fator de capacidade do analito nas condições descritas. Comente o resultado.
b) Calcule a composição do eluente que dá origem a um fator de capacidade de 10. Comente a
escolha destas condições de análise relativamente às apresentadas na alínea a).
Dados: P’ (clorofórmio) = 4,1; P’ (tolueno) = 2,4
R.: a) k = 26,7; b) 100% clorofórmio

3. Considere uma separação por cromatografia de partição para os analitos A e B.

a) Se o coeficiente de partição (K) do analito A é superior ao do analito B, qual o analito a ser
detetado em primeiro lugar?
b) Nas circunstâncias descritas em a), se a fase estacionária for polar, qual dos dois analitos tem
maior polaridade?
c) Se a coluna utilizada na separação fosse substituída por uma mais longa, o que esperava que
acontecesse ao tempo de retenção dos analitos? E ao tempo morto?
d) Se a coluna utilizada na separação fosse substituída por uma mais curta o que seria de esperar
relativamente ao valor da largura na base do pico B? E ao valor da altura do prático teórico do
analito B, assumindo que as restantes condições de separação eram mantidas?

4. Preencha os espaços com as opções apresentadas de forma a obter afirmações verdadeiras.

a) O alargamento dos picos numa coluna cromatográfica _________________(aumenta/diminui)

com o aumento da altura de prato teórico. A existência de múltiplos caminhos ________ (é/não
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é) um dos fatores que contribui para o alargamento dos picos em colunas tubulares abertas de
parede revestida (WCOT) usadas em cromatografia ___________ (líquida/gasosa).

b) Em cromatografia gasosa o método de injeção mais aplicado em análises de rotina é o

___________________ (“split”/”splitless”). Neste método, a maioria da amostra que entra no
injetor é _________________ (descartada/injetada). Este método é mais adequado para
amostras em que a concentração do analito é _____________ (alta/muito baixa).

c) O índice de polaridade de uma mistura de 20% de n-propanol, 60% de dietiléter e o restante

de tetracloreto de carbono é ________________. Esta mistura seria adequada para utilizar como
fase móvel num processo de cromatografia líquida de fase ________________ (normal/reversa),
adequada para a separação de analitos ______________ (polares/apolares).

Dados: Índices de polaridade – n-propanol: 4,0; dietiléter: 2,8; tetracloreto de carbono: 1,6.
R.: 2,8

5. Pretende separar 20 analitos utilizando uma separação cromatográfica por HPLC. Utilizando
uma fase móvel constituída por 50% metanol e 50% água, uma coluna de fase reversa e um
fluxo de 0.7 mL/min, separou os primeiros 15 analitos com uma resolução adequada. No entanto,
os 5 analitos mais retidos pela coluna apresentaram tempos de retenção demasiado longos e
um alargamento dos picos muito elevado. O que propõe para melhorar o desempenho do método
relativamente aos 5 analitos mais retidos sem afetar a resolução obtida para os 15 analitos
menos retidos?

6. Considere uma experiência cromatográfica em que dois componentes com fatores de retenção
k1 = 4,00 e k2 = 5,00 são injetados numa coluna com 1,00 x 103 pratos teóricos. O tempo de
retenção do composto menos retido é tR1 = 10,0 min. Calcule o tempo morto, o tempo de retenção
do composto 2 e a largura na base do composto 1.
R.: tM = 2,00 min; tR2 = 12,0 min; w1 = 0,400 min

7. A mobilidade electro-osmótica de uma solução num capilar de sílica é 1.3 x 10-8 m2 V-1 s-1 a
pH 4 e 8.2 x 10-8 m2 V-1 s-1 a pH 12. Quanto tempo irá demorar um soluto neutro a percorrer a
distância de 52 cm do injetor ao detetor, aplicando um potencial de 27 kV num capilar com 62
cm de comprimento?
R.: pH 4, ~15.3 min; pH 12, ~2.4 min
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8. Duas proteínas (P1 e P2) foram analisadas por eletroforese capilar. Para esta análise, foi
aplicada uma diferença de potencial de 2,50 × 104 V num capilar de sílica não modificado de 84,0
cm, com 64,0 cm da entrada até ao detetor, a pH 8,3. Uma molécula neutra necessitou de 308 s
para chegar ao detetor, e os tempos de migração de P1 e P2 foram 343 s e 355 s,
respetivamente. Determine:
a) A velocidade e a mobilidade electro osmótica;
b) A mobilidade aparente e a mobilidade electroforética de P1 e P2.
R.: a) 20,8 × 10-4 m/s e 6,98 × 10-8 m2 V-1 s-1 ; b) P1: 6,27 × 10-8 m2 V-1 s-1 e -0,710 × 10-8 m2 V-1
s-1; P2: 6,06 × 10-8 m2 V-1 s-1 e -0,920 × 10-8 m2 V-1 s-1.

9. Considere que a proteína P2 do exercício 8 tem um coeficiente de difusão de 0.059 × 10-9 m2

s-1. Nas mesmas condições de separação, quantos pratos teóricos espera atingir?
R.: 9,8 × 106 pratos teóricos

10. Utilizando um capilar de sílica não modificado com um comprimento total de 62 cm e 52 cm

até ao detetor, uma solução de eletrólito apresenta uma mobilidade electro-osmótica de 1,3 × 10-
8 m2 V-1 s-1 a pH 2 e de 8,1 × 10-8 m2 V-1 s-1 a pH 12, aplicando uma voltagem de 27 kV.
Nestas condições, um determinado anião tem uma mobilidade electroforética de -1.6 × 10-8 m2
V-1 s-1 . Assumindo que a mobilidade electroforética do anião não se altera com o pH, determine
o tempo necessário para este chegar ao detetor a pH 2 e a pH 12.
R.: pH = 2: nunca chega ao detetor; pH = 12: 3,1 min

11. Para analisar uma mistura de moléculas carregadas e neutras por electroforese capilar
utilizando um capilar de sílica não revestido, um agente surfactante (dodecilsulfato de sódio) foi
adicionado ao eletrólito de separação (pH 9). Indique se são verdadeiras (V) ou falsas (F) as
seguintes afirmações.
_____ Apenas micelas negativamente carregadas podem ser usadas para separar moléculas
neutras em cromatografia micelar eletrocinética.
_____ As moléculas neutras irão migrar mais rápido devido à sua interação com as micelas em
comparação com o seu tempo de migração na ausência de micelas.
_____ As micelas geradas por este agente surfactante vão influenciar o tempo de migração dos
analitos neutros mas os catiões e aniões terão os seus tempos de migração inalterados.
_____ As moléculas neutras são separadas na presença de micelas devido à sua partição
diferencial entre as micelas e o eletrólito de separação.