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TEMPORIZAÇÃO CIRCADIANO.
Orientador:
São Paulo
2007
RESUMO
que gera e mantém ritmos que ciclam em período aproximado de 24 horas é denominado
serotonérgicas da rafe, sendo que a função da serotonina neste circuito seria a modulação de
resultam na expressão rítmica dos então chamados genes do relógio ou “clock genes”. Estes
incluem, entre outros, os genes Per, o Clock, os genes Cry e o Bmal1. Embora homólogos
destes genes tenham sido identificados em várias espécies incluindo humanos, pouco é
conhecido sobre seus padrões de expressão no NSQ de primatas. O presente estudo analisa as
mostra que dentre os núcleos analisados, somente os núcleos obscuro e linear apresentam
HT-IR do NSQ de primatas e roedores e mostra que a distribuição das fibras 5-HT-IR e NPY-
com pouca sobreposição aos terminais do TRH sugerindo diferentes funções para estas
comparação ao que já foi descrito em roedores. Além disso, o presente estudo demonstra o
padrão de expressão dos genes Per1, Per2, Cry1 e Bmal1 no NSQ ao longo do período de
atividade do primata Cebus apella. Observou-se que o padrão de expressão do gene Bmal1
apresenta diferença em relação ao de roedores com pico máximo no ZT 2. Não foi encontrada
expressão do gene Cry1 no NSQ nos horários analisados. O padrão de expressão do gene
serotonergic innervation arriving from the raphe nuclei. SCN has pacemaker cells that
produce rhythmic expression of clock genes. This study investigates the levels of 5-HT in the
raphe nuclei and SCN in free running rats and shows endogenous rhythms in the obscurus and
linear raphe nuclei, which is regulated by the daily light: dark cycle rhythms. The comparative
analysis of the intrinsic structure of the SCN of primates and rodents shows a different
organizational pattern of serotonergic and GHT terminals and the RHT terminals, suggesting
primates. Moreover, the pattern of the clock genes SCN expression along the awaken period
in the primates show that BMAL1 and Per1 RNAm peaks of expression occur around ZT2 and
Per2 around ZT7. These data suggest that the neural organization of the circadian timing
system in the studied primate differ from those of the most commonly studied rodents.
1. INTRODUÇÃO
1.1 Atributos básicos dos ritmos circadianos
menos regulares e geralmente mantendo relação de fase constante com eventos periódicos do
1997).
Terra, não é surpresa que mecanismos evolutivos de adaptação tenham desenvolvido ciclos
contém algum componente cíclico, pois o organismo criou maneiras de coordenar sua
fisiologia de forma que diferentes funções ocorram em diferentes horários do dia (Dunlap et
al., 2004).
Os ritmos biológicos podem ser classificados de acordo com diversos critérios, o mais
períodos maiores do que 28 horas, como por exemplo, o ciclo menstrual; enquanto que os
ritmos ultradianos ou oscilações de repetições rápidas têm períodos menores que 20 horas,
como por exemplo, a secreção de insulina e glucagon (Kern et al., 1996; Marques, Menna-
Barreto, 1997).
que sincroniza ou ajusta um ritmo circadiano. Como a maioria dos ritmos é sincronizada por
ciclos ambientais, cronobiologistas referem-se ao tempo definido por estes ciclos ambientais
como “zeitgeber time” (ZT). Quando um organismo é mantido em um ciclo de 24-horas (12
horas de claro seguidas por 12 horas de escuro), o “zeitgeber time” zero ou ZT0 corresponde
ao acender da luz ou início do claro, enquanto que o ZT12 ao apagar da luz ou início do
escuro. Desta maneira, todos os pontos de tempo entre ZT0 e ZT12 referem-se à fase de claro,
enquanto aqueles entre ZT12 e ZT24 (ou ZT0) referem-se à fase de escuro (Sehgal, 2004).
definido como fase de um ritmo. Sendo assim, por exemplo, animais diurnos e noturnos
exibem fases opostas em seus ritmos de sono e vigília (Marques, Menna-Barreto, 1997;
Uma mudança na medida de tempo do “Zeitgeber”, causada, por exemplo, por uma
conhecido como “jet lag”. Durante o processo de ajuste ao novo ciclo, um ritmo demonstra
1997).
Em mamíferos, a enucleação ou a secção dos nervos ópticos e a concomitante
curso de alguns ritmos circadianos, sendo que, a natureza endógena de um ritmo e sua
periodicidade devem ser determinadas sob esta condição. O padrão de um ritmo em livre
curso na maioria das vezes é diferente daquele apresentado sob influência do ciclo claro-
endógena. Sob esta condição nós utilizamos para determinar o tempo o termo “tempo
circadiano” (circadian time) (CT), o qual representa o tempo interno do organismo, gerado
por seu oscilador interno. Tendo em vista que a periodicidade endógena é frequentemente um
pouco diferente de 24 horas, o CT na maioria das vezes não é o mesmo que ZT (Sehgal,
2004).
Morin, 1976; Moore, 1983). Demonstrou-se desde 1972 que tanto o ritmo de liberação da
animais (ratos) eram suprimidos pela lesão nos NSQ (Moore, Eichler, 1972; Stephan, Zucker,
1972), Além disso, o transplante de células do NSQ de um doador para um animal lesionado
restabelece os ritmos circadianos que o animal havia perdido, sendo que, o período dos ritmos
temporização capaz de gerar oscilação pela qual o organismo mede o tempo, mesmo na
ritmos circadianos endógenos (Inoue, Kawamura, 1979; Green, Gillete, 1982; Newman,
Hospod, 1986; Lehman et al., 1987; Ralph et al., 1990) que podem ser sincronizados pelo
ciclo de luz ambiental e ou por estímulos não fóticos (Johnson et al., 1988).
característica fundamental dos ritmos circadianos é a de seus períodos não serem dependentes
da temperatura externa, ou seja, permanecem constantes sob uma ampla gama de temperatura.
Isso evidencia que as bases que regem os ritmos são mecanismos bioquímicos mais
complexos do que mudanças nas funções de proteínas sob diferentes temperaturas que
2004).
específicos regulam sua própria expressão. Auto-regulação essa que consiste de proteínas
oscilações circadianas dos níveis de proteína e RNAm (Reppert, Weaver, 2001; Dunlap et al.,
2004).
1.2 Aferências e eferências do oscilador circadiano
central, vias de entrada que transmitem sinais ambientais para o oscilador central, e vias de
saída que levam as informações deste e resultam na manifestação dos ritmos circadianos. Na
prática existem múltiplas vias de entrada e saída para cada oscilador, além disso, o sistema
não funciona de maneira linear, as saídas podem retro-alimentar o oscilador ou até mesmo as
NSQ, ou seja, trazidos de outros grupamentos neuronais que aferentam o NSQ (Rusak,
Zucker, 1979; Van den Pol, Tsujimoto, 1985; Rusak, Bina, 1990; Klein et al., 1991; Rietveld,
1992).
Assim, o oscilador central é apenas parte de um sistema maior e mais complexo que
oscilador. Se os ritmos são gerados por osciladores endógenos, então as propriedades destes
ritmos devem vir de características inerentes aos osciladores que os produzem. Segundo a
trazidos por estruturas e vias de entrada (Reppert, Weaver, 2001). Assim, apesar da maioria
dos osciladores, não terem contato direto com o meio externo, eles recebem informações do
meio ambiente por vias distintas. Como a luz é a principal pista ambiental para o oscilador
central (Reppert, Weaver, 2001), a identificação de fotorreceptores, bem como de suas vias de
entrada fótica, constitui importante área de pesquisa em organismos usados para estudos
cronobiológicos.
Os sinais gerados pelo oscilador e modulados pelas informações que lhe aferentam
devem ser transmitidos para outras partes do organismo, de forma a determinar a expressão
sinais do relógio para outras partes do organismo são chamadas vias de saída e podem ser
Sehgal, 2004).
oscilador central, o principal marcapasso do sistema, está sob influência de fatores de entrada
como o ciclo claro-escuro e impõe a expressão de ritmos em vários aspectos fisiologicos via
estruturas e vias de saída “outputs” que podem representar conexões neurais diretas e/ou
Em roedores, o NSQ recebe informações tanto do meio interno como externo através
de três principais vias (Figura 3). A via retinohipotalâmica, ou trato retinohipotalâmico (TRH)
principal via de sincronização fótica dos ritmos circadianos (Moore, Lenn, 1972), manda
retinianas e dão origem a uma via que se dirige ao NSQ, o trato geniculohipotalâmico (TGH)
cujo principal neurotransmissor é o NPY, que está relacionado a modulação dos estímulos
fóticos e estímulos não fóticos. Deste modo, os neurônios do NSQ recebem informação, sobre
a iluminação ambiental, diretamente da retina e também indiretamente através do TGH. O
terceiro maior sistema aferente para o NSQ é formado pelas projeções serotonérgicas das
células da rafe (Azmitia, Segal, 1978; Van de Kar, Lorens, 1979; Moore, 1983) cuja função
embora não totalmente esclarecida parece ser a modulação dos efeitos da luz, além de
participar da modulação de estímulos não fóticos (Levine et al., 1986; Smale et al., 1990).
Figura 3. Esquema simplificado das vias de entrada fóticas para o NSQ. O ciclo claro-escuro
ambiental é detectado pelas células ganglionares da retina. Este sinal fótico é transmitido para
o NSQ por duas vias principais. A primeira via, direta, conecta a retina ao NSQ via trato
(FIG), o qual por sua vez conecta-se ao NSQ via trato geniculohipotalâmico (TGH). Há ainda
uma terceira via, que conecta primeiramente a retina com a rafe (demonstrada em algumas
espécies), a qual por sua vez conecta-se ao FIG e ao NSQ. Adaptado de Sehgal (2004).
A anatomia das conexões serotonérgicas com as estruturas do sistema de temporização
circadiano assim como sua função na ritimicidade circadiana, continua a ser estudada nas
et al., 1978; Card, Moore, 1984; Morin et al., 1992). Alguns autores relatam ainda, projeções
do núcleo dorsal da rafe (DR) para o FIG, o qual é a origem do TGH (Mantyh, Kemp, 1983;
encurtamento do período nestas condições. Já animais noturnos, por outro lado, diminuem sua
freqüência espontânea com aumento na intensidade de luz, expressando assim períodos mais
ambiental de 24 horas (Repert, Weaver, 2001). Isto significa que todos os dias o relógio
repetidamente faria com que esses organismos, em questão de poucos meses, invertessem a
fase de seus ritmos em relação ao meio ambiente, o mesmo acontecendo com um ritmo de
ciclo ambiental, se colocados em condição de claro-escuro (12:12 h). Nestes organismos esses
ritmos desaparecem em situação de livre curso, além disso, o animal perde a capacidade de
antecipar as transições dos ciclos ambientais. Este efeito de pistas ambientais sobre ritmos
Menna-Barreto, 1997).
ganglionar da retina que agiria na detecção da luz e transmitiria esta informação ao relógio?
fazem sinapse com neurônios do NSQ (Provencio et al., 2000; Repert, Weaver, 2001).
NSQ. Por ter estações intermediárias, estas vias certamente não transmitem apenas
transmitindo também sinais não fóticos para o NSQ. Este fenômeno ocorre principalmente nas
vias provenientes da rafe e do TGH. Por exemplo, atividade física forçada pode mudar a fase
de um ritmo circadiano do animal, e o FIG foi demonstrado como necessário para que ocorra
Finalmente, outra importante via de entrada para o NSQ são hormônios, dos quais o
serotonina, 5-HIAA e NA nos núcleos da rafe, glândula pineal e no NSQ em ratos (capítulo I).
interespecíficas dos mesmos realizamos: estudo comparativo entre primatas e roedores, dos
(capítulo II), a caracterização química do NSQ no primata Cebus apella (capítulo III) e o
padrão de expressão dos “genes relógio” no NSQ nesta espécie (capítulo IV).
2. CAPÍTULO I
ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO TEMPORAL DO CONTEÚDO DE SEROTONINA,
Sob ciclo claro-escuro ambiental, os núcleos da rafe, principal fonte de serotonina encefálica,
ambiental, com os menores níveis as 17:00h e 5:00h e os maiores níveis as 13:00h e 21:00h,
sendo este último o horário de pico máximo. Para avaliarmos se estes ritmos representam
ritmos endógenos circadianos, estudamos a variação no conteúdo de 5-HT nos núcleos da rafe
em ratos em situação de livre curso (ausência de pistas ambientais). Além disso, com o intuito
do mesmo conteúdo nas áreas de projeção destes núcleos, onde estão os terminais dos
dos ritmos biológicos circadianos. Tão importante quanto conhecermos o padrão do ritmo
ritmicamente nestas áreas, para isso, realizamos também a dosagem do metabólito da 5-HT o
ritmos biológicos, nos núcleos da rafe, pineal e no NSQ, assim como a relação destes
conteúdos com as fases de atividade e repouso dos animais. Os resultados mostram que os
núcleos da rafe Obscuro (ROb) e Linear (Li) apresentam ritmo endógeno circadiano no
conteúdo de 5-HT e que este ritmo difere daquele previamente demonstrado em situação de
conteúdo de serotonina dos núcleos da rafe. O NSQ não apresentou ritmo endógeno
variações significativas no conteúdo de 5-HT com queda acentuada do inicio para o final da
fase de atividade. O NSQ também apresentou alta taxa de metabolização durante a fase de
atividade e baixa durante a fase de repouso dos animais, o que indica maior atividade
gerado por osciladores internos e sincronizado por fatores fisiológicos internos (organização
2002).
modelo de livre-curso, situação onde as oscilações externas são eliminadas, como por
tanto pelo ciclo de luz ambiental quanto por estímulos não-fóticos (Johnson et al., 1988).
sistema, embora ainda não totalmente esclarecida, parece ser mediar os efeitos da luz sobre a
temporização (Zatz, Herkenham, 1981) e também mediar estímulos não fóticos (Mistlberger
nervoso central, produzida pelos neurônios serotonérgicos, cujos corpos celulares localizam-
se principalmente ao longo da linha média do tronco encefálico, nos núcleos da rafe (Tork,
liberador de tirotrofina e encefalina) e óxido nítrico (Fort et al., 1990; Törk, 1990; Dun et al.,
transportado para dentro da célula por um mecanismo carreador neutro para aminoácidos.
Pycock, 1991, Frazer, Hensler, 1994), essa enzima também está localizada em células da
glândula pineal, onde a 5-HT produzida vai ser convertida em melatonina (Figura 4B) (Frazer,
em vista que é a primeira enzima da cadeia de síntese e atua como uma etapa regulatória de
todo o processo, muito embora uma estimulação neural seja necessária (Kruk, Pycock, 1991).
1991). Isso ocorre tanto dentro do neurônio como fora dele, na fenda sináptica (McGeer et al.,
— CH2— C — COOH
H
L-triptofano
N
O
2 triptofano-hidroxilase (Tr-OH)
BH 4
NH2
HO — — CH2— C — COOH
H 5-hidroxitriptofano
N
L-aminoácido aromático
decarboxilase (AADC)
síntese.
HO — — CH2— CH2 — NH2
serotonina (5HT)
monoamina-oxidase (MAO)
HO — — CH2— C — OH
ácido 5-hidroxindolacético
(5HIAA)
N
O N--Acetil serotonina
N
5-hidroxindol-O-metiltransferase
O
N Melatonina
entre as quais está a modulação do ciclo sono/vigília (Jouvet, 1973). Essa modulação é o
diferentes sítios neuronais, compondo complexa rede anatômica (Portas et al., 1998). Estudos
tronco cerebral (5-HT e NA) apresentam atuação predominante na fase de alerta enquanto a
ratos e gatos. Em ambas espécies, a taxa de disparo dos neurônios serotonérgicos e os níveis
extracelulares de 5-HT no núcleo dorsal da rafe (DR) são altos durante a vigília, diminuem
sono (Jacobs, Fornal, 1991; Portas et al., 2000). Este mesmo padrão de mudanças na
concentração extracelular de 5-HT e na taxa de disparo dos neurônios serotonérgicos pode ser
nos núcleos da rafe durante o ciclo sono/vigília ainda não estão claros, no entanto há
Além da relação com o ciclo sono/vigília, o nível extracelular de 5-HT nos núcleos da
rafe também é associado com o estado comportamental e a atividade motora dos animais. Em
Uma das evidências da relação entre a 5-HT, núcleos da rafe e a modulação de ritmos
circadianos é o substrato anatômico nas conexões entre a retina e a rafe (Shen, Semba, 1994,
Frazão et al., 2007), e entre rafe e o NSQ (Morin, 1992; Morin, Meyer-Bernstein, 1999;
A via rafe-NSQ se origina no núcleo mediano da rafe (MnR), (Morin, 1999; Morin,
1978; Van de Kar, Lorens, 1979). Neste circuito, a 5-HT exerce efeito inibitório, modulando
os efeitos da luz na ritimicidade circadiana (Rea et al., 1994; Shibata, Moore, 1998). Além de
foram realizados em estruturas como: locus coeruleus (LC) (Kaehler et al., 2000; Ase et al.,
2000), amígdala (Viana et al., 1997), núcleo accumbens, medula espinal, bulbo olfatório,
substância negra (Ase et al., 2000) e núcleo vestibular medial (Cransac et al., 1996) para se
espalhados por todo o encéfalo, o locus coeruleus (LC), principal fonte deste
Valentino, 1994; Aston-Jones et al., 1999; Berridge, Waterhouse, 2003), em especial, áreas
Jones et al., 1999; Berridge & Waterhouse, 2003). O LC recebe aferências de várias estruturas
longo do dia. As concentrações mais altas estão na fase de escuro, período considerado como
de atividade dos animais, com nível máximo às 21:00h e mínimo às 5:00h, sendo que, as
19:00h, imediatamente antes do apagar das luzes, há aumento significante do nível de 5-HT
rafe ao longo do dia representam ritmos circadianos endógenos o presente trabalho analisou a
variação no conteúdo da 5-HT nos núcleos da rafe ao longo do período circadiano dos animais
Os resultados são discutidos quanto à relação entre as variações nos conteúdos das
atividade dos animais sugerem que a atividade dos sistemas serotonérgico e noradrenérgico
seja modulada pela transição do ciclo de atividade e repouso, ou ainda que estes dois sistemas
• O NSQ não apresenta ritmo endógeno circadiano nos conteúdos de 5-HT e 5HIAA
em animais em livre-curso, sendo que, a atividade serotonérgica, neste núcleo, é maior na fase
realizados em horários diferentes do dia tanto para 5-HT como para a NA podem levar a
estas características levam a duas subdivisões do NSQ, uma dorsomedial e outra ventrolateral,
do NSQ dos primatas Cebus apella e Callithrix jacchus e roedores Rattus norvegicus (Wistar
e Long Evans) foram investigados e comparados com os descritos para outras espécies. Os
resultados mostram o NSQ do Cebus apella como um grupamento celular de 0.118 ± 0.008
e Wistar). Além disso, a distribuição das fibras 5-HT-IR no Cebus apella, assim como no
observado em roedores, sugerindo que a função das aferências serotonérgicas no NSQ nesta
como marcapasso central neural endógeno responsável pela geração e manutenção dos ritmos
circadianos (Moore, 1983; Turek, 1985; Rusak, 1989; Meijer, Rietveld, 1989; Klein et al.,
ambiental é possível graças a projeções diretas das células ganglionares da retina via trato
retinohipotalâmico (TRH) (Moore, Lenn, 1972; Johnson et al., 1988, Morin, 1994) e por
projeções retinianas indiretas, tais como o trato geniculohipotalâmico (TGH) e a via rafe-NSQ
(Card, Moore, 1982; Hay-Schmidt et al., 2003). As projeções do TRH são formadas
principalmente por axônios glutamatérgicos (De Vries et al., 1993) enquanto o TGH utiliza
axônios contendo neuropeptídeo Y (NPY), e a via rafe é constituída por axônios contendo
serotonina (5-HT) (Albers, Ferris, 1984; Biello et al., 1994; Meyer-Bernstein, Morin, 1996;
(VIP) ou peptídeo liberador de gastrina (GRP) co-localizados com ácido gama aminobutírico
(GABA) e, (2) A concha, externa ao cerne, caracterizada por uma grande população de
neurônios contendo arginina vasopressina (AVP) em sua porção dorsomedial e também co-
localizado com GABA. O cerne, ou porção ventrolateral recebe fibras aferentes visuais e da
rafe; enquanto que, as projeções para a concha, ou porção dorsomedial provêm de regiões
subcorticais e corticais (Moga, Moore, 1997; Moore et al., 2002). As subdivisões cerne e
espécies já estudadas. Em ratos, essas fibras formam um denso plexo na sua porção ventral
sobrepondo o campo dos terminais do TRH (Moore et al., 1978; Steinbusch, 1981; Ueda et
al., 1983; Van den Pol, Tsujimoto, 1985). Em hamsters, camundongos e gatos, estas fibras
também formam um plexo na região ventral com expansão para lateral e principalmente
medial nas porções média e caudal do NSQ (Ueda et al., 1983; Card, Moore, 1984;
periventricular esparso no NSQ e, em porquinhos da índia estas estão distribuídas por toda
extensão do núcleo (Cassone et al., 1988). No Octodon degus, as 5-HT-IR estão localizadas
espécies de primatas. Por exemplo, no Callithrix jacchus, um denso plexo de fibras preenche
este núcleo, principalmente, nas áreas dorsal e central, sendo que, estas fibras são
praticamente ausentes na porção ventral (Costa et al., 1998; Cavalcante et al., 2002). Já no
no NSQ do primata diurno Cebus apella são descritos neste estudo, bem como, comparados
aos dados obtidos no também primata diurno Callithrix jacchus e em roedores noturnos
parâmetros medidos entre os primatas, porém estes apresentam valores maiores do que
• No NSQ do Cebus apella, a área dos corpos celulares é cerca de 15 % maior do que
• O NSQ do Cebus apella apresenta baixa densidade das fibras aferentes 5-HT-IR em
• O padrão de distribuição das fibras serotonérgicas não coincide com a parte ventral
diferentes espécies.
4. CAPÍTULO III
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO NÚCLEO SUPRAQUIASMÁTICO DO
ventrolateral, também chamada cerne e outra dorsomedial também chamada concha. Esta
organização intrínseca pode apresentar diferenças interespecíficas, sendo que, até o momento,
a maioria dos estudos de caracterização neuroquímica deste núcleo foi realizada em roedores
e pouco se sabe sobre a organização neural do NSQ em primatas. O presente estudo avalia a
com as distribuições das três principais aferências para este núcleo, o trato retinohipotalâmico
demonstram que, nesta espécie, o NSQ apresenta organização complexa caracterizada por
calretinina e substância P, entre outros que ainda não foram identificados) que na maioria dos
roedores. A análise dos terminais retinianos mostrou que o TRH projeta-se bilateralmente
para o NSQ, sendo que, a projeção contralateral é predominante. Além disso, há sobreposição
Zucker, 1972; Moore, Lenn, 1972; Hendrickson et al., 1972; Ralph et al., 1990; Silver et al.,
1996a). Resultados mais recentes demonstram que o NSQ não é um grupo homogêneo de
células capazes de gerar ritmos de maneira uniforme. Ao invés disto, diferentes tipos de
e/ou localização (Schaap et al., 2001; Saeb-Parsy, Dyball, 2003; Quintero et al., 2003;
NSQ devido às implicações que tal organização pode ter na regulação funcional do sistema de
temporização circadiano.
em consideração a extensão a qual ela varia entre espécies já estudadas. Por exemplo,
hamsters têm um subnúcleo central dentro do NSQ caracterizado pela presença de células
calretinina (CalR) (Morin et al., 1992; Miller et al., 1996; Silver et al., 1996b; LeSauter et al.,
2002). Contrariamente, não existe tal subnúcleo ou equivalente presente no NSQ de ratos e do
peptídeo intestinal vasoativo (VIP) geralmente localizados na porção ventral do NSQ (Moore
et al., 2002; Morin, Alen, 2006). Outros tipos celulares, tais como colecistoquinina ou
somatostatina, também foram demonstrados no NSQ de algumas espécies (Silver et al., 1999;
LeSauter et al., 2002; Moore et al., 2002). Em adição, células imunoreativas ao ácido gama
Além dos vários fenótipos celulares intrínsecos ao NSQ, esse núcleo também pode ser
caracterizado pela localização de seus terminais aferentes. Destes, os três principais são: o
serotonérgicas da rafe (Morin, Alen, 2006). Cada uma destas projeções tem distribuição
específica dentro do núcleo, muitas vezes apresentando sobreposição entre elas. Em roedores,
ambos, TRH e TGH projetam-se para os núcleos NSQ, onde há grande sobreposição de seus
terminais na região ventral do NSQ (Muscat et al., 2003; Morin et al., 2003, Morin, Alen,
2006).
NPY (NPY-IR) no folheto intergeniculado (FIG), estrutura esta que divide o núcleo
geniculado lateral (NGL) em regiões dorsal e ventral (Allen et al., 1983) e se projeta para o
informação fótica para o NSQ (Lall, Biello, 2002), além de estar envolvido no processo de
sincronização não-fótica dos ritmos endógenos gerados pelo NSQ (Biello et al., 1994).
meio ambiente, chega diretamente ao NSQ através de terminais do TRH, que se originam de
(Ebling, 1996).
De importância comprovada na modulação do sistema circadiano em roedores
(Gamble et al., 2006; Yannielli et al., 2004), alguns autores sugerem que o TGH está ausente
(Chevassus-au-Louis, Cooper, 1998; Ueda et al., 1986). Entretanto, Cavalcante et al. (2002)
roedores.
do primata Cebus apella demonstra uma complexidade organizacional que vai além das duas
• Além disso, os resultados indicam que, nesta espécie de primata diurno, a 5-HT e o
NPY devem estar envolvidos na modulação dos estímulos não fóticos que sincronizam o NSQ
roedores para primatas e humanos deve ser feita com cautela, pois podem, além de confundir
a localização de tipos celulares, inferir falsas funções aos grupamentos neuronais do NSQ.
levando-se em conta que como tem sido relatado na literatura pode haver mudanças dinâmicas
expressão circadiano.
detalhes da distribuição dos vários tipos celulares, suas relações sinápticas e a anatomia das
parecem ser governados por princípios similares em todos os organismos já estudados. Não
importa o quão complexo seja o organismo, oscilações circadianas são geradas em cada uma
das células do oscilador, porém podem existir diferenças interespecíficas nos detalhes
translação que resultam na expressão rítmica dos chamados “genes relógio”. Estes incluem,
três genes da família Period (Per): Per1, Per2 e Per3, o gene Clock, os genes “cryptochrome”
Cry1 e Cry2 e o BMAL1. Embora homólogos destes genes tenham sido identificados em
primatas incluindo humanos, pouco é conhecido sobre seus padrões de expressão no NSQ.
Com a análise da expressão do RNAm dos genes mPer1, mPer2, mCry1 e mBMAL1 no NSQ
do primata Cebus apella ao longo de alguns horários da fase de atividade dos animais,
observou-se que há densidade moderada na expressão dos genes, mPer1, mPer2 e mBMAL1 e
não foi encontrada expressão do gene Cry1. O padrão de expressão do gene Per1 e do gene
expressão destes genes no NSQ de roedores. Os dados suportam a idéia de que deve haver
organismos vivos, a questão então é “como estes ritmos são gerados?” A primeira indicação
de que poderiam ser gerados dentro do próprio organismo, ao invés de serem criados pelo
meio ambiente cíclico, veio das observações de De Mairan em 1729, que notou que havia
periodicidade de 24 horas nos movimentos que as folhas de uma determinada planta faziam,
mesmo em situação de escuro constante. Entretanto, somente muito tempo depois a natureza
ritmos estão sob controle do oscilador endógeno circadiano, outros são dependentes de
diferentes fatores, tais como estado comportamental. Por exemplo, a liberação de alguns
hormônios aparenta ser rítmica por ser influenciada pelo sono, o qual normalmente ocorre de
Atualmente acredita-se que a maioria dos organismos multicelulares possui mais que
um oscilador biológico, sendo estes, específicos para diferentes sistemas, tecidos ou órgãos. O
corpo são denominados osciladores periféricos e seu grau de autonomia varia de oscilador
NSQ (Klein et al., 1991). Este núcleo pode manter a atividade marcapasso por extenso
mamíferos, com exceção do olho, que recebe informação fótica (Dunlap, 1999; Reppert,
Weaver, 2001).
Embora osciladores periféricos em mamíferos não percebam a luz, eles podem ser
sincronizados por outros estímulos fisiológicos, sendo os mais importantes: ciclos hormonais,
os quais podem ser controlados pelo NSQ ou agir independentemente nos osciladores
periféricos, e restrições alimentares que podem sincronizar o oscilador do fígado sem afetar o
NSQ.
Welsh et al., (1995) demonstraram que o NSQ apresenta ritmo circadiano na taxa de
disparo neuronal. A partir disto, outros estudos estabeleceram que a base para a geração de
sendo estas células autônomas na geração deste ritmo (Liu et al., 1997; Herzog et al., 1998;
Dunlap, 1999; Liu, Reppert, 2000). As células do NSQ expressam, em cultura, muitas
transplantadas em animais com o NSQ lesado e, portanto, arrítmicos (Welsh et al., 1995).
Fica claro que a linhagem de células do NSQ tem a capacidade de regular o ritmo de outras
questão sobre qual seria o mecanismo pelo qual estes osciladores atuam? Vários modelos
matemáticos tentam explicar este fato com um aspecto em comum: a presença de uma alça de
ausência de pistas ambientais (Dunlap, 1999; Jin et al., 1999; Reppert, Weaver, 2001).
Esse mecanismo básico dos osciladores (alça oscilatória) acontece intracelularmente
(Herzog et al., 1998; Liu, Reppert, 2000). Isto não quer dizer que um marcapasso é formado
por uma única célula, mas sim por um grupo de células, cada qual contendo uma alça que
oscila em sincronia com as alças das células vizinhas (Herzog et al., 1998). O NSQ é assim,
um grupamento celular que gera sinais rítmicos que vão determinar ritmos fisiológicos ou
A existência de ritmos circadianos foi demonstrada em vários filos, e pelo que foi
evolução (Darlington et al., 1998; Jin et al., 1999; Kume et al., 1999; Dunlap et al., 2004;
Sehgal, 2004).
de oscilações de genes específicos regulam sua própria expressão. Estes genes são chamados
síntese de seus próprios RNA mensageiros (RNAms) (Sangoram et al., 1998; Shearman et al.,
destas proteínas garante que a retro-alimentação negativa na transcrição também seja rítmica,
a qual por sua vez garante a expressão rítmica do RNAm (Darlington et al., 1998; Jin et al.,
1999; Kume et al., 1999; Shearman et al., 2000). Embora certas características estruturais
mecanismo podem diferir de uma espécie para outra, (Todo et al., 1996; Shearman et al.,
Retro-alimentação
negativa
RNA
Proteína
Figura 24. Desenho esquemático simplificado dentro de um oscilador de 24h. Este modelo é
baseado em estudo de diversas espécies e consiste de uma alça regulatória de retro-
alimentação na qual um gene do relógio é transcrito de forma cíclica, oscilando seu RNA e
proteína que por sua vez regula negativamente a síntese de seu próprio RNAm. A alça leva
aproximadamente 24h para se completar. Adaptado de Sehgal (2004).
O número e também a natureza dos genes expressos de forma rítmica varia não
somente de espécie para espécie, mas também de um órgão ou tecido para outro dentro de um
mesmo organismo. Um gene expresso ritmicamente em um tecido, pode não ser expresso
ritmicamente em outro, talvez por servir para uma diferente função ou por que o processo no
qual está envolvido não se apresente ritmicamente neste outro tecido (Oishi et al., 1998;
função e de expressão de proteínas que por sua vez dão origem a ritmos na fisiologia e
comportamento.
Estudos genéticos e moleculares em uma variedade de organismos (cyanobacteria,
bases moleculares dos ritmos circadianos e dos mecanismos intrínsecos que estão por trás da
função circadiana. Estes estudos identificaram genes envolvidos em cada aspecto do sistema
circadiano (Honma et al., 1998; Zheng et al., 1999; Takumi et al., 1999).
Os métodos que têm sido utilizados para isolar os genes do relógio envolvem a análise
genética de animais mutantes e variam de espécie para espécie. Depois de isolado, o gene é
resultados de uma pequena seqüência podem ser comparados com dados de base existentes
para extrair a seqüência completa do gene, o que possibilita que pesquisadores rapidamente
A clonagem do DNA pode ser usada para expressar proteínas em bactérias ou cultura
de células, assim grandes quantidades de proteínas podem ser isoladas e usadas para estudos
bioquímicos.
A partir dos clones do DNA podemos obter sondas para análise do RNAm, enquanto
que os anticorpos podem ser usados para identificar proteínas. Usando anticorpos e sondas a
partir de genes clonados, podemos responder quando e onde os genes são expressos, e como
as funções dos múltiplos genes do relógio interagem para produzir ritmos circadianos (Dunlap
et al., 2004).
relógio pode ser feita pela quantificação dos níveis de RNA por técnicas como de Northen
Blot ou pela quantificação dos níveis de proteína por Western blot em tecidos coletados em
diferentes horários do dia. Já a análise espacial, ou seja, o padrão de expressão dos genes
tecido, ou no tecido como um todo, de espécimes biológicos, de tal forma que o gene pode ser
visualizado na estrutura celular e subcelular. Desta forma este tipo de experimento nos diz não
somente se e quando um gene é expresso, mas precisamente onde ele é expresso. Se um gene
é expresso nas células do oscilador, ele torna-se um candidato a gene relógio, embora ele
possa num próximo passo ser identificado como componente das entradas ou saídas do
oscilador e não necessariamente ser um gene relógio. Ao contrário, se ele não é expresso em
células do oscilador, então é quase certeza que ele não é um gene relógio (Sehgal, 2004;
A utilização da genética de insetos para o estudo do sistema circadiano tem sido bem
sucedida. Embora aparentemente (isto ainda não foi completamente provado) haja grande
conservação nas bases moleculares dos ritmos circadianos entre as espécies, o estudo destas
bases em mamíferos se justifica pela complexidade das vias e estruturas de saída, exclusivas
Dois genes, Period (Per) e Cryptochrome (Cry), são ciclicamente transcritos no curso
de 24 horas; em roedores, o pico dos níveis transcritos ocorre no meio do dia e o menor valor
aumentam durante o dia, mais e mais proteínas são produzidas. Com os níveis dessas
proteínas aumentando na célula, elas heterodimerizam e translocam para o núcleo. No núcleo
BMAL1, inibindo a transcrição de Per e Cry (Gekakis et al., 1998; Hogenesch et al., 1998;
transcrição dos genes Per e Cry (Gekakis et al., 1998; Hogenesch et al., 1998; Takahata et al.,
1998). Em outras palavras quando os níveis de PER e CRY são altos, a transcrição de Per e
Cry é bloqueada. Quando os níveis de PER e CRY diminuem na célula pela degradação
destas proteínas a transcrição é liberada e o ciclo recomeça (Jin et al., 1999; Kume et al.,
Per3; e dois homólogos de Cry: Cry1 e Cry2. As razões para se ter múltiplos homólogos
ainda não são completamente esclarecidas. Expressões cíclicas de Bmal1, Per e Cry são
encontradas no NSQ e também em órgãos tais como fígado e rins. Já a expressão do gene
Clock é constante tanto em órgãos periféricos como no encéfalo (Gekakis et al., 1998;
Hogenesch et al., 1998; Takahata et al., 1998). O gene Clock foi o primeiro dos genes do
relógio a ser clonado em mamíferos (Takahashi et al., 1994; King et al., 1997).
oposição de fase com o Per1 e Per2, tal fato consistente com a idéia de que BMAL1 se liga
ao CLOCK e juntos estes ativam a transcrição destes dois genes (Gekakis et al., 1998;
Hogenesch et al., 1998; Takahata et al., 1998). Além disso, o próprio BMAL1 funciona como
uma alça de retro-alimentação dele mesmo onde a proteína regula os níveis do seu RNAm
perdem a expressão rítmica de Per1 e Per2 no NSQ e em órgãos periféricos. Além disso,
esses animais têm dificuldades em responder a luz, o que sugere que BMAL1 têm função na
sincronização fótica. O mesmo acontecendo com a regulação das vias de saída do NSQ já que
três genes ciclam no NSQ, sendo o valor mais alto durante o dia, com valores mínimos à
noite. Uma primeira diferença entre esses genes envolve a resposta à luz. A expressão de Per1
e Per2 é induzida com a exposição à luz, entretanto, a indução de Per1 é muito mais forte e
mais rápida do que para o Per2. Camundongos que não possuem o Per1 não apresentam
começo da noite. Ao contrário, camundongos que não possuem o Per2 não apresentam atraso
de fase no ritmo locomotor em resposta a um pulso de luz aplicado no final da noite. Já o gene
Per3 não é induzido pela luz, o que sugere que ele não desempenha função na via de entrada
Outra diferença chave entre essas proteínas são seus padrões de expressão em vários
tecidos. Na verdade existe até mesmo, diferença na expressão dos três homólogos dentro do
próprio NSQ (Reppert, Weaver, 2001). No hamster, uma região do NSQ expressa Per1, Per2
e Per3 de maneira rítmica. Outra região apresenta expressão constante de Per3 e expressão de
Per2 e Per1 induzida pela luz. Este resultado também sugere diferenças funcionais entre os
homólogos. Além disso, existem diferenças de expressão entre tecidos não neurais. Cada um
tecidos. A razão para estas diferenças de expressão ainda não é conhecida, mas sugere-se que
os três homólogos de Per tenham funções específicas em cada tecido (Shearman et al., 2000).
Decifrar estas funções individuais seria um grande avanço no entendimento das funções dos
osciladores.
genes Cry são comprovadamente importantes para a manutenção dos ritmos circadianos (Jin
et al., 1999; Kume et al., 1999). A expressão dos genes Cry1 e Cry 2 apresenta ritimicidade
no NSQ sendo os maiores níveis de RNAm no final do dia, apresentando assim um atraso em
relação aos picos de expressão dos genes Per. A expressão das proteínas CRY1 e CRY2
também cicla no NSQ, sendo o pico aproximadamente 3 horas após o pico do RNAm. Dados
em animais “knockout” mostram que os genes Cry não são totalmente necessários para a
necessários para a geração dos ritmos endógenos circadianos (Kume et al., 1999; Okamura et
al., 1999), sendo que, CRY1 e CRY2 têm efeitos opostos no tempo do oscilador. Por
exemplo, animais “knockout” para Cry2 apresentam períodos mais longos em escuro
constante (Thresher et al., 1998; Van der Horst et al., 1999); já animais “knockout” para Cry1
apresentam períodos mais curtos em escuro constante (Van der Horst et al., 1999; Vitaterna et
al., 1999).
transcrição de Per1 pelo heterodímero CLOCK: BMAL1 através da interação direta do CRY
com o BMAL1 (Okamura et al., 1999; Vitaterna et al., 1999). Estes genes também podem
interagir com os três homólogos do Per formando heterodímeros que também acabam por
bloquear a atividade de CLOCK e BMAL1 (Kume et al., 1999; Okamura et al., 1999).
autônomos independentes uns dos outros e sincronizados pelo ciclo claro-escuro (plantas e
insetos), para um menos autônomo e mais acoplado sistema de osciladores (mamíferos) onde
os osciladores periféricos não são sincronizados por entradas fóticas, mas sim por outros
sinais neurais e por fatores humorais advindos principalmente do NSQ (Reppert, Weaver,
2001).
fisiológicas incluem vários passos intermediários partindo dos genes do relógio via outros
fatores de transcrição para genes efetores que estão envolvidos na fisiologia celular. Alguns
passos deste mecanismo são conhecidos em osciladores central e periféricos, mas ainda não
organismo.
Futuros estudos da expressão dos genes relógio e dos genes controlados pelo relógio
primatas incluindo humanos (Piggins, 2002), pouco é conhecido sobre seus padrões de
expressão no NSQ de primatas. O objetivo deste trabalho foi estudar o padrão de expressão
dos genes Per1, Per2, Cry1 e BMAL1 no NSQ do macaco Cebus apella.
• O presente estudo, embora não tenha avaliado o padrão de expressão dos genes
relógio ao longo de todo o período circadiano, mostrou algumas diferenças no padrão diurno
de expressão dos genes Per1 e Per2, os quais podem ser possíveis alvos de investigação da
• O padrão de expressão dos genes Bmal 1, Per1 e Per2 apresenta pico de expressão
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