1.

A conservação in vitro envolve o uso de duas principais técnicas: crescimento lento e

criopreservação. Faça uma busca na literatura (sugiro o Google Scholar e a utilização de língua
inglesa) por um artigo que descreva a metodologia de uma das duas técnicas citadas e responda as
seguintes questões:

a) Cite no mínimo duas vantagens e duas desvantagens de cada uma das técnicas citadas acima.
(2,0 pts)

Na conservação de espécies vegetais sob a técnica de crescimento lento, temos como vantagens:

- Manutenção mais barata quando comparada a criopreservação (sem custos com nitrogênio
líquido ou ultrafreezers por exemplo)
- Resposta dos tecidos mais rápida e com maior viabilidade quando alocada novamente para
condições favoráveis ao crescimento
- Alternativa para preservação de espécies com sementes recalcitrantes (que não resistem a
secagem ou congelamento), e portanto são difíceis de serem armazenadas em bancos de
semente por exemplos.

E como desvantagens:

- Depende muito das características fisiológicas de cada espécie

- Exige mão de obra especializada para manutenção e recultivo constante do material
armazenado.
- Tempo limitado pelo qual cada espécie pode ser preservada de maneira adequada por esse
método, por fatores fisiológicos e de estabilidade genética.

Já para a criopreservação temos como vantagens:

- técnica com menor requerimento de espaço por exemplar preservado.

- preservação por longos períodos de tempo, sendo teoricamente ilimitado.
- alta estabilidade genética, o que é importante em muitos casos

E como desvantagens:

- custo de mão de obra, métodos de congelamento (ultrafreezers ou nitrogênio líquido),

crioprotetores, etc.
- redução da viabilidade devido aos desafios de realizar o congelamento sem danificar as
estruturas celulares pela formação de cristais de gelo.

b) Sobre o artigo, qual foi o tipo de explante utilizado para o cultivo em crescimento lento ou
criopreservação? (1,0 pt)

No artigo “Cryopreservation and Optimization of In Vitro Germination of Handroanthus

serratifolius” (Souza et al., 2013), os autores objetivaram testar diferentes técnicas de recuperação de
sementes de ipê-amarelo conservadas in vitro por criopreservação.

c) Descreva em linhas gerais a metodologia específica utilizada para o tipo de conservação in vitro
testada no trabalho (se crescimento lento, composição de meio de cultura e frequência de
subcultivo. Se criopreservação, se foi congelamento rápido ou lento, qual composição de solução
crioprotetora e etc.) (3,0 pts)

O método utilizado no congelamento para a criopreservação foi de congelamento rápido,

utilizando nitrogênio líquido. Os autores não relatam o uso de crioprotetores para as sementes, mas
sim um método de dissecação prévia, reduzindo significativamente a umidade, evitando assim a
formação de cristais de gelo que poderiam inviabilizar as amostras. O descongelamento variou entre
1, 3 e 5 minutos das amostras submersas em água a 40°C.

2. Os biorreatores de imersão temporária podem otimizar de forma expressiva o cultivo in vitro de

plantas, existindo dois principais modelos: RITA e frascos duplos/gêmeos. Escreva uma resenha
curta (máximo de 1 página) apontando os principais usos para cada um desses modelos, indicando
seu funcionamento básico, prós e contras e ao menos um trabalho científico que tenha utilizado
um desses modelos para o cultivo in vitro de uma determinada espécie. (4 pts)

A aplicação de biorreatores para cultura vegetal in vitro trás diversas vantagens, juntamente
com novos desafios, à aplicações comerciais e de pesquisa que almejam o cultivo de plantas em
ambiente controlado e estéril. Os fatores que tornam essa técnica interessante são diversos,
incluindo, por exemplo, a ampliação de escala com possibilidade de automação, redução dos custos e
otimização do controle de fatores relevantes como pH, temperatura, taxas de transferência de
oxigênio, entre outros. Dito isso, trataremos dos biorreatores de imersão temporária, que tem
diversas aplicações relevantes, como obtenção de metabólitos secundários, proteínas e outros
compostos de interesse e propagação de plantas com interesse científico/comercial. Nessa classe de
biorreatores, temos dois principais tipos.
O primeiro deles, denominados RITA (Teisson & Alvard, 1995), funciona com o meio de cultivo
líquido na porção inferior do frasco do biorreator, com as plantas suspensa em um suporte perfurado.
Em determinados intervalos de tempo, ar estéril é injetado com pressão e liberado dentro do frasco
na região onde se encontra o meio, borbulhando-o e o fazendo entrar em contato com as plantas ali
crescendo, além de renovar assim a atmosfera interna. Tem como vantagens a possibilidade de serem
montados em série (vários frascos ligados na mesma linha de injeção de ar), promoverem boa
oxigenação e renovação da atmosfera, e poderem ser escalonados de maneira relativamente fácil.
Porém, tem custo elevado pelos materiais que devem ser resistentes aos métodos de esterilização,
custos de importação e produção, e limitado ciclos de uso. No artigo “Influence of spermine and
nitrogen deficiency on growth and secondary metabolites accumulation in Castilleja tenuiflora Benth.
cultured in a RITA ® temporary immersion system” (Rubio-Rodríguez, 2019), os autores investigam a
influência de stress causado pela deficiência de nitrogênio aliada a administração da poliamina
Espermina, e relatam que essa combinação pode ser benéfica para obtenção de compostos de alto
valor agregado produzidos pelas células de uma planta nativa das Américas, a Castilleja tenuiflora.
O segundo tipo, denominado sistema de frascos duplos/gêmeos ou BIT, consiste em dois
frascos conectados por um tubo, tipicamente um cano de silicone. Em um deles, se encontra o meio
de cultura líquido e no outro os explantes. Cada recipiente é conectado a um sistema pressurizado e
controlado por timers. Semelhantemente, os explantes são imersos no meio de cultura
temporariamente em intervalos de tempo definidos, por maio da variação da diferença de pressão
entre os recipientes e injeção de ar; com o meio líquido fluindo de um dos frascos para o outro nos
períodos de imersão, e posteriormente retornando. Uma das principais desvantagens desse modelo
é o custo da automação, pois necessitas de timers e válvulas solenoides a serem controladas. Uma das
vantagens é a possibilidade de se usarem frascos descartáveis, facilmente esterilizáveis (como garrafas
PET) e com baixíssimo custo se comparado a outros modelos, podendo inclusive serem cortadas para
facilitar a manipulação do material vegetal após o tempo de cultivo. Na publicação “Uso de
biorreatores na organogênese de eugenia uniflora (Myrtaceae)” (Franco, 2022) o autor buscou
otimizar um método de cultivo de pitangueira, utilizando biorreatores de imersão permanente e
temporária. Foram obtidos resultados positivos na regeneração de segmentos nodais da planta em
meio de cultura específico, e os biorreatores de imersão permanente foram eficientes no acúmulo de
biomassa e desenvolvimento das folhas, enquanto os biorreatores de imersão temporária foram mais
eficientes para o enraizamento das plantas.