Biotecnicas Apuntes

Apuntes de clase Ângelo Sena Silva 2018.
Biotecnologia da Reprodução – Aula 21/05/18
1ª prova: 16/07/2018
2ª prova: 20/08/2018
3ª prova: 03/09/2018
4ª prova: 17;18;19/09/2018
- O espermograma faz parte do exame andrológico

- Se não consegue saltar: impotentia ceundi;
- Se não consegue fecundar: impotentia generandi.
Critérios a serem avaliados no exame andrológico:

 Saúde geral;
 Saúde hereditária;
 Saúde genital;
 Capacidade de realizar salto (potentia ceundi);
 Capacidade de fecundação (potentia generandi);
 Padrões raciais;
 Capacidade de transmitir características
Indicações:
 Seleção e comercialização;
 Avaliação do potencial reprodutivo pré-estação de monta;
 Diagnóstico de subfertilidade ou infertilidade;
 Pós-estação de monta;
 Diagnóstico de ocorrência de puberdade;
 Criopreservação do sêmen.
O exame andrológico tem validade de 60 dias, pois o espermatozoide produzido tarda 60 dias
para maturar e estar na cauda do epidídimo. Logo um touro alcança a maturidade sexual aos 2
anos de vida e sai de reprodução entre 8 – 10 anos de vida.
 Exame andrológico:
- Identificação;
- Exame clínico geral e específico;
- Espermograma;
- Diagnóstico;
- Conclusão
1) Identificação:
Deve estar incluído o proprietário, propriedade, animal, brinco, tatuagem, número, endereço,
tudo que venha a identificar o animal, seu proprietário e o local de origem desse animal.
Durante a anamnese perguntas como: o motivo do exame; regime sexual (MN/DS); frequência
de uso; número de fêmeas cobertas/gestantes; descendentes; desempenho da progênie;
manejo sanitário; alimentação; presença de alterações; tratamentos anteriores
2) Exame clínico geral:
Deve-se examinar o animal por todos os métodos semiológicos descritos, inspeção, palpação e
percussão. Deve-se inspecionar o animal em marcha e em estação, bem como sua condição
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Apuntes de clase Ângelo Sena Silva 2018.1
corporal, presença de testículos, avaliação dos linfonodos, temperatura, FC, FR, mucosas,
presença de anomalias.
Aprumos, cascos e mandíbula (retrognatismo/prognatismo); desvios de coluna (C, L, E).
- @ mochos naturais devem ser descartados.
3) Exame clínico específico:

Anorquidismo;
Monorquidismo.
 Avaliação dos testículos

a. Escroto;
Deve-se avaliar o escroto do animal em estação, nisso avaliar: pele, mobilidade,
sensibilidade, aderências, temperatura e espessura.
A bolsa testicular bipartida é comum em raças nativas, não sendo característica de
desclassificação ou descarte, embora em raças especializadas sejam.
b. Testículos;
Deve-se avaliar, forma, simetria, consistência, mobilidade, temperatura, sensibilidade,
tamanho, posição e se são pendulares.
Vale ressaltar que a biometria testicular deve ser realizada pela altura, largura e
espessura, além do volume testicular.
A consistência testicular ideal é a mesma da mão fechada.
Ruminantes: Alongados
Equinos, caninos e felinos: arredondados.
A biometria testicular pode ser interpretada como: não aceitável, médio e excelente.
c. Epidídimo;
Avaliar corpo, cauda e cabeça.
d. Cordão espermático;
Palpar. Pode haver agenesia segmentar do ducto deferente podendo levar a formação de
um granuloma ou ruptura do ducto deferente.
Tuerperella
Brucella;
Corynebacterium.
e. Prepúcio;
Fimose, comum em animais de raças pequenas (Lhasa/York/Maltês/Shi-Tzu), nessas
espécies deve ser realizada a tosa higiênica pois leva ao acúmulo de sujidades, bem como
pode haver o enroscamento nos pelos.
f. Pênis;
Avaliar a presença do frênulo peniano.
Integridade do apêndice vermiforme.
Herpes vírus pode levar a presença de ulceras na região da mucosa peniana.
g. Genitália interna (glândulas anexas)
a. Vesícula seminal;
b. Próstata;
c. Bulbo uretrais
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OBS: Animais alimentados com torta de algodão diminuem a capacidade reprodutiva por conta
do Gossipol, o qual tem a capacidade de interferir diretamente sobre a espermatogênese.
Avaliar comportamento sexual:

- Verificar a libido ( Classificado de 0 -10)
- Execução da cópula
- Excitação das fases da cópula;
- Ereção e protusão;
- Monta e introdução;
- Propulsão e ejaculação;
- Descida e conclusão
- Índole:
- Temperamento com o homem e outros animais;
- Classificação: Linfático; dócil; violento.
Biotecnologia da Reprodução - Aula 28/05/18
Aumento de volume testicular pode ser: Inflamação, varicocele e cisto.
O encurtamento dos cordões espermáticos pode levar a falhas na termorregulação.
 Exame clínico especial:

o Genitália interna
 Palpação transretal;
 US
 Indicativos no sêmen
 Pus / Sangue
o Comportamento sexual
 Verificação da libido
 Execução fases da cópula
 Excitação/aproximação;
 Ereção/ protrusão;
 Monta/ introdução
 Propulsão / Ejaculação;
 Descida / Conclusão
Requisitos para colheita de sêmen:
- O ejaculado completo deve ser obtido sem perdas ou contaminações;
- A sobrevivência dos sptz não pode ser comprometida;
- A concentração deve ser semelhante à de ejaculado produzido por monta natural;
- A saúde e a libido do animal devem ser mantidas;
- Métodos de fácil execução.
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No Espermograma avalia-se as características físicas do ejaculado, como:
Volume, aspecto, turbilhonamento, motilidade, vigor, concentração e morfologia espermática.
Tempo de
Espécie Volume (mL) Local de deposição
ejaculação
Touro 2-10 1” Vagina
Carneiro/bode 0,2-2,2 1” Vagina
Varrão 150-500 10-20’ Útero
Garanhão 20-250 10-15” Útero
Cão 2-16 30-40’ Vagina
Gato 0,01-0,2 1” Vagina
Galo 0,2-0,5 1” Vagina
Alterações espermáticas:
a) Primárias b) Secundárias: c) Terciárias
- Origem intra-gonadal; - Origem extra-gonadal - Após ejaculação;
- Falhas na - Transporte e maturação - Manipulação do sêmen;

espermatogênese;
- Epidídimo. - Choque térmico
- Indicam processos
- Colheita e diluição.
patológicos
Exames complementares não são obrigatórios, estes possuem a finalidade de ressaltar uma
característica ou qualidade do sêmen para sua comercialização.
Exames complementares (microbiológicos, testes de termo-resistência e sorológicos) podem

ser utilizados para elucidar distúrbios reprodutivos, evidenciar a presença de microorganismos
e anticorpos, além de comparar resultados.
Diagnóstico:
Quem está apto/questionável/inaptos
O exame andrológico tem validade de 60 dias, pois o espermatozoide produzido tarda 60 dias
para maturar e estar na cauda do epidídimo. Logo um touro alcança a maturidade sexual aos 2
anos de vida e sai de reprodução entre 8 – 10 anos de vida.
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Tecnologia do sêmen animal
 Etapas:
o Colheita do sêmen;
o Avaliação do sêmen;
o Processamento do sêmen;
 Diluição;
 Criopreservação;
o Deposição no trato genital da fêmea (IA).
1) Vagina artificial (VA):
- Há dois modelos de vagina artificial: Colorado e Francês;
- Ruminantes e equinos;
- Animais treinados
2) Eletroejaculador (EE):
- Animais muito jovens: Ainda não descolaram a bainha prepucial ou para fins experimentais.
- Animais impossibilitados de realizar salto: Animais com dor ou alterações adquiridas.
- Animais muito ariscos: Fazer sedação antes
- Animais selvagens: Animais não possuem o costume da lida com humanos
- Animais que acabaram de vir a óbito e seu material genético é de grande importância.
3) Manipulação digital (MD):
- Suínos, cães, aves e répteis;
Em aves e répteis deve-se massagear a região da cloaca
Colheita de sêmen: Vagina artificial
Materiais:
1. Termômetro e garrafa térmica 6. Manequim

2. Vagina artificial a. Modelo
3. Cone b. Fêmea
4. Tubos graduados i. Em cio natural
5. Proteção para tubo ii. Em cio induzido
(Ciprionato de Estradiol 48h antes da coleta para induzir o cio nas fêmeas)
Para pequenos ruminantes o tubo deve haver graduação acima de 2mL
Em cavalos devem ter um tubo com agua morna ao final da vagina artificial, envolvendo o tubo
que receberá o sêmen, para não ocorra choque térmico.
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Recomenda-se o uso de uma membrana ou camisinha sem lubrificante para evitar o contato
do pênis com a mucosa e otimizar o tempo de coleta.
Preparação da vagina artificial:
A vagina artificial por dentro é um tubo rígido ou pouco maleável, a qual contém uma mucosa
de látex evertidas, e deve-se encher com água morna e ar, através de uma válvula na parte
superior da vagina artificial. Ao final é acoplado o cone e a este acoplado o tubo coletor
graduado.
Deve-se encher com água morna e ar, para que dê a sensação de pressão semelhante a uma
vagina natural.
Evitar que a vagina molhe.
Preparação do reprodutor:
Deve-se realizar a limpeza do prepúcio com água morna e corte dos pelos do prepúcio.
Enxugar com papel toalha ou compressa, afim de evitar contaminação.
Preparação da manequim:
Garantir que a fêmea esteja no cio e contida de maneira adequada a fim de evitar acidentes
com o animal e técnico.
Apresentar o macho a fêmea
Existem manequins artificiais.
Frustação:
A frustração é uma técnica que se pode realizar em ruminantes é utilizado para obter um
volume de sêmen maior. Na hora que o animal for saltar você afasta e no segundo ou terceiro
salto você colhe, afim de aumentar o volume espermático. Deve ser em local adequado,
protegido do sol e com piso adequado.
Não se deve fazer frustração em bubalinos, pois os animais são bem temperamentais.
O garanhão pode saltar até 5 vezes por dia, porém não é bom realizar vários saltos / dia.
O piso para suínos deve ser emborrachado, na sala de coleta.
Colheita de sêmen: Eletroejaculador
- Uso criterioso;
- Contenção física e química
Bovinos não necessita contenção química.
- Higienização do pênis e prepúcio;
- Material adequado
Cuidados com sêmen
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Evitar incidência do sol e a temperatura do tubo (na EE demora 5 -10’)
Passos:
1) Conter animal;
2) Higienização do pênis e prepúcio;
3) Higienizar o reto;
4) Colocar eletrodo com lubrificante;
5) Aplicação dos choques;
6) Colheita do sêmen.
Na cabeça do epidídimo o epitélio é com células colunares e ciliadas com camada muscular
fina e na cauda a musculatura é mais grossa e as células mais curtas, por isso que a contração
consegue levar os sptz até o ducto deferente.
(Não faz parte de eletroejaculação – ela apenas começou a falar)
No cão:
A primeira fração do sêmen é sem SPTZ;
A segunda fração é rica em SPTZ - Se usar essa fração dilui-se para 1:200;
A terceira tem bem pouco SPTZ, há mais plasma do que células;
Se utilizar o sêmen inteiro: dilui-se 1:40
No suíno:
Evita-se a fração gelatinosa do sêmen.
O sêmen de ruminantes não é fracionado.
Colheita de sêmen: Manipulação manual
 Suíno e cão;
 Técnica da mão enluvada;
 Higiene do local e do reprodutor
o Limpeza adequada do prepúcio
o Secagem antes de iniciar a colheita
 Material apropriado
o Recipiente térmico
o Desprezar a primeira fração do ejaculado ou usar tela no recipiente de colheita
(suíno)
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Avaliação do sêmen: PARÂMETROS
Macroscópicos
 Volume (mL)
 Aspecto
o Cor
o Normal
 Característica de cada espécie:
 Bodes: amarelados
 Carneiros: perolados
 Bovinos: esbranquiçado
 Equino: branco acinzentado
o Anormal
 Avermelhado: presença de sangue
 Marrom: presença de sangue hemolisado;
 Cinza escuro: presença de sujeira
o Consistência - refere a concentração espermática

 Aquosa – Normal em suínos
 Leitosa – Equino e Cão;
 Cremosa – Ruminantes.
Microscópicos:
 Turbilhonamento ou movimento massa;

 Motilidade (%)
 MIP ou Vigor
 Concentração espermática
 Patologias espermáticas
 Turbilhonamento ou movimento de massa;

o Só é realizada para RUMINANTES – No aumento de 40x
o Movimentos em forma de ondas
 Motilidade + concentração
o Sêmen puro;
o Aumento de 40x
o Classificação de 0-5.
 Motilidade (%);
o AUMENTO DE 100x
o Percentual 0 -100%;
 Total: Conta todos – com movimentos progressivos ou não;
 Progressiva - Só conta SPTZ em motilidade progressiva;
o É uma avaliação subjetiva.
o Avaliar em um campo homogêneo (sem artefatos)
o Diluído ou não – depende da espécie
 Observação em lâmina sob lamínula
o Para uso in natura: Não aceitar com <70%
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o Para congelar: Não aceitar com <80%.

 Motilidade individual progressiva – MIP ou Vigor;
o Velocidade de movimentação dos sptz
o Avaliar indivíduos (SPTZ) correndo em linha reta – movimento flechante;
o Sêmen diluído
 Observação da lâmina sob lamínula
o Aumento de 100x;
o Classificação de 0 -5
 0: Ausência de movimento
 5: Movimento vigoroso e veloz, geralmente progressivo
 Concentração espermática;
o Número de SPTZ/mm³ ou cm³ (mL);
o Câmara de Neubauer ou espectrofotômetro ou fotômetro
o Diluição do sêmen em proporção conhecida
o Fórmula
o ______A______
1/B * N/25 * 0,1
 Morfologia espermática
o Investigar anormalidades morfológicas;
o Esfregaços corados ou preparação úmida
o Aumento de 1000x
o Contagem de no mínimo 200 xcélulas
o Anormalidades podem estar em cabeça, peça intermediária e cauda
Características morfológicas
Defeitos maiores:
 Acrossoma; Defeitos menores:
 Gota citoplasmática proximal;
 Cabeça subdesenvolvida;  Cabeça delgada;
 Estreita na base;  Cabeça gigante;
 Isolada patológica;  Curta;
 Pequena anormal;  Larga;
 Contorno anormal;  Pequena normal;
 Pouch formation (diadema);  Cabeça isolada normal
 Cauda enrolada na cabeça;  Abaxial;
 Piriforme;  Retroabaxial;
 Formas teratológicas;  Oblíqua;
 Patologias de peça intermediária;  Cauda dobrada ou enrolada
 Cauda fortemente dobrada;  Gota citoplasmática distal
 Cauda fortemente enrolada e
cauda dobrada com gota distal
Interpretação da morfologia espermática

 Defeitos maiores o 25% totais
o 5%: individuais;  Para soma de defeitos maiores e de
o 20%: totais menores (Totais)
 Defeitos menores o 30%
o 10% individuais  Outros elementos
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o Medusas o Células gigantes;

o Células primordiais o Leucócitos, hemácias e células
primordiais
Anormalidades da cabeça:
5% é o aceitável
A alta frequência pode representar degeneração testicular e hipoplasia testicular;
- Cabeça piriforme, globosa e estreita na base
Anormalidades de acrossoma:
5% é aceitável
Está relacionado com as alterações primárias (falha durante espermatogênese, podendo ser
causado por: doenças, reação vacinal, constipação ou carências vitamínicas no período) e
terciárias (coleta, diluição e armazenamento, podendo ser causado por envelhecimento,
congelamento e descongelamento, variações de ºC, pH e osmolaridade)
- Acrossoma difuso, deformado, contorno irregular e destacado
É considerado um defeito grave pois causa a perda da capacidade fecundante
Anormalidades de peça intermediária e cauda

Peça intermediária: 5% Cauda: 10%
Sua alta frequência está relacionado com problemas em:
a) Epidídimo:
b) Glândulas acessórias
c) Terciárias
- Cauda dobrada, em laço, dobrada, fortemente dobrada e fortemente enrolada.
- Gota citoplasmática proximal e distal
Outros elementos que podem comprometer a morfologia espermática:

1. Medusas
Significa degeneração testicular grave, visto em lâmina corada e preparações úmidas
2. Células primordiais
Deg. Testicular grave – prep. úmidas.
3. Células gigantes
Deg. Testicular grave.
4. Leucócitos
Inflamação
5. Hemácias
Hemorragia no sistema genital
6. Células epiteliais
Descamação do sistema genital, não tem significado patológico
Cuidados com sêmen:
 Ambiente limpo;
 Material limpo e livre de resíduos de substâncias químicas;
 Lâminas e lamínulas aquecidas:
o Uso de placa e platina aquecedora.
 Microscópio óptico – aumentos de 40, 100, 400 e 1.000x;
 Mircropipetadores - volumes fixos ou variados;
 Ponteiras;
 Tubos: 15mL, 50mL e tipo eppendorf.
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Cauda enrolada representa que os espermatozoides entraram em contato com placa fria ou
lâmina fria ou o diluente frio – choque térmico. Interfere no MIP, os SPTZ andam em círculos.
Espécie Volume Tempo de ejaculação Local de deposição

Touro 2 – 10mL 1” Vagina
Peq. ruminantes 0,2-2,2mL 1” Vagina
Varrão 150- 10-20’ Útero
500mL
Garanhão 20-250mL 10-15” Útero
Cão 2-16mL 30-40’ Vagina
Gato 0,01-0,2mL 1” Vagina
2ª Aula – Tecnologia do sêmen 04/06/2018 #RJ
Sêmen fresco ou in natura:
 Puro ou diluído;
 34 – 37ºC -> até 1:30h
 Utilização imediata
o Necessidade de fêmeas no cio no momento da colheita
 Taxa de diluição mais alta que a de sêmen resfriado ou congelado - dose menor
o 50 a 100 milhões de sptz por dose
 Diluição após avaliação
o Sêmen e diluidor devem estar na mesma temperatura
 Diluidores orgânicos ou sintéticos
 Sobra não pode ser aproveitada
Sêmen Resfriado
 Diluído;
 15 a 4ºC -> até 48h
 Dose: 100 – 150 milhões de sptz/palheta
 Acréscimo de substâncias crioprotetoras ao diluidor
 Conservação de sêmen em temperatura de geladeira (4 – 15ºC)
 Transporte refrigerado
 A diluição deve ser feita em banho maria a 35-37ºC
o Sêmen e diluidor na mesma temperatura
 A temperatura deve ir diminuindo gradativamente 1 -1,2ºC/min
 Manter entre 4 – 15ºC até o uso
 O diluidor mais utilizado para bovinos é o CITRATO DE SÓDIO (2,2g)+H2O bidestilada
(75mL)+ gema de ovo 25mL + antibiótico.
Sêmen congelado
 Diluído;
 -196ºC por tempo indeterminado
 Dose de 100 – 200 milhões de sptz/palheta;
 Permite planejamento no momento da IA;
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 Armazenar em botijões criogênicos

 Deve-se usar crioprotetores no diluente
 Processo de congelação em etapas
o Resfriamento
o Congelamento propriamente dito
 Deve-se realizar uma pré-diluição e resfriamento com metade do volume final
o Fração sem crioprotetor + palhetas identificadas;
 Adição da 2ª fração com crioprotetor após alguns minutos
 Equilibrio-> 2 -4h a 4ºC
o Única ou mais frações – 3 frações com intervalos de 5 -10’
 Envase;
 Rampa de congelação : Vapor de N líquido -60ºC
 Transferir e manter em botijão criogênico
 Viável por tempo inderterminado
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Criopreservação
Vantagens:
 Aumento do volume seminal;

 Viabilidade dos gametas por muito tempo;
 Possibilidade de fecundar fêmeas distantes;
 Banco de germoplasma;
 Aumento do ganho genético
 Preservação de espécies ameaçadas
Desvantagens
 Custo dos equipamentos e manutenção;

 Mão de obra especializada;
 Diminuição da capacidade fecundante.
Danos causados
 Danos celulares por mudança da temperatura podem levar a danos no DNA e

alteração da membrana celular;
 Injúrias oxidativas;
 Formação de cristais de gelo.
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Características de um bom diluente
 Ausência de toxicidade para os sptz;

 Osmolaridade semelhante à do sêmen;
 Impedir mudanças de pH – solução tampão;
o O metabolismo espermático produz íons H+, esses acidificam o meio e
diminuem a motilidade espermática, para evitar a produção de H+, pode-se
usar:
 TES
 TRIS
 Citrato de Sódio
 Ácido nítrico
 Fornecer energia
o Colabora com a viabilidade espermática
o Ação crioprotetora e osmótica
 Glicose;
 Sacarose;
 Dextrose;
 Frutose;
 Galactose.
 Impedir a proliferação bacteriana
o Penicilina/Estreptomicina/Gentamicina/Lincomicina/Tilosina/Espectinomicina
o Previne contaminações
o Utilizado em sêmen resfriado e congelado
 Oferecer crioproteção;
 Baixo custo e fácil preparo.
Crioprotetor
 Oferecer proteção contra os efeitos da criopreservação

o Criprotetores exta-celulares
 Oferecem estabilidade à membrana (Ex: Gema de ovo).
o Crioprotetores intra-celulares
 Evita a formação de cristais de gelo (Ex: Glicerol, DMSO, etilenoglicol).
a) Orgânicos:
Gema de ovo: É a mais utilizada e fosfolípideos
Água de coco: Baixo custo e é estéril;
Leite desnatado: Fervido 92C/10’
Elimina componentes tóxicos:
Sêmen caprino: fosfolípideos + Fosfolipase A = Isolectinas
Porque no leite de cães há uma maior necessidade de gema de ovo?
3ª aula: Tecnologia do sêmen – Inseminação Artificial
Detecção do estro:
Cabra: Abana a cauda rapidamente, diminui PL, inquietação, vocalização, duração de ±30h.
Ciclo estral ± 21d.
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Ovelha: Vulva edemaciada, difícil detecção, ±24h com ciclo de ±17d.
Vaca: Inquietação, mugido, reflexo clitoriano com duração de ± 18h com ciclo de ±21d.
Porca: Posição de lordose, vulva edemaciada, orelhas levantadas e paralelas, duração de ±50h
com ciclo também de ±21d.
Égua: Reflexo clitoriano, movimento de cauda, duração de ±7d com ciclo de ±21d.
Suínos: + ao teste da pressão lombar
IA acessos/locais:
Não se faz na vagina
Cervical Intrauterina
1. Superficial (Até dois anéis) 3. Transcervical

2. Profunda (depois do 2º anel) 4. Laparotomia
Requisitos para IA
A. Treinamento
B. Inseminador
a. Observador, metódico, organizado, higiênico, ético e calmo.

C. Auxiliares
a. Cuidado com os animais.
1. Técnica de IA em BOVINOS
HIGIENIZAR PERINEO COM ÁGUA E PAPEL TOALHA, não limpar a ampola retal com as
mãos. Fazer com pipeta angulada para o teto da vagina, a inseminação deve ser feita no
corpo do útero.
2. Cabras
 Contenção
o Conforto para o animal e inseminador
 Limpeza da vulva;
 Lubrificar espéculo;
 Preparar inseminador;
 Passagem do espéculo com fonte de luz;
 Visualizar a entrada da cérvix;
 Passar os anéis
 Massagear vulva.
3. Ovelhas
 Principal entrave é a anatomia da cérvix
 Maior treinamento;
 Instrumento adequado
 Uso de sêmen congelado
Etapas:
 Lubrificação e introdução do espéculo
 Visualização da cérvix
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o Observar formato
 Pinçamento
o Allis 25cm
o Pozzi 24cm
 Pinçamento e tracionamento da cérvix
 Exposição da cérvix
 Passagem do aplicador-dilatador
 Tirar o êmbolo e colocar a palheta de sêmen (0,25mL)
 Colocar êmbolo mais fino na palheta e fazer a aplicação do sêmen
 Retirar o aplicador
 Massagem na vulva
Cuidados após a IA:
 Colocar fêmea em local calmo;

 Fornecer alimento, água fresca e limpa, sal mineral;
 Não estressar
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Cálculo concentração espermática e dose inseminante

Aula prática
N
[ ] espermática=
n
∗1
25
∗1
10
b
Onde:
N: Número de sptz contatos
B: Fator de diluição
n: Número dee quadrantes contados
1/10: Altura da câmara
1) Esperar 2’ para que os sptz fiquem decantados para que haja uma contagem uniforme
2) Escolher o ângulo de contagem
3) Contagem, se tiver bolhas, contar o do lado, porém se tiver muitas, refazer a lâmina
4) Aplicação na fórmula:
Iremos utilizar o resultado de 5,200,000 sptz/mm³ = 5,2 x 10 6sptz/mm³.

Para saber em mL, multiplica por 1000 = 5,200,000,000 sptz/mm³, porque nesse
exemplo o animal ejaculou 1mL, se tivesse ejaculado 1,5mL iria multiplicar por 1500.
5) Lembrar que a palheta fina tem 0,25mL e média 0,5mL e que para caprinos e ovinos sempre
utilizar a palheta fina. E QUE A DOSE COMERCIAL É DE 100 MILHÕES DE SPTZ.
6) Resgatar dados do exame macro e microscópico do exame de andrológico
Nome: Salvianinho
Volume: 1mL
Motilidade: 90%
Palheta: Fina
Dose: 100,000,000 sptz
[ ]: 5,200,000,000sptz/mL. (Aceitável é > 3 bilhões)
7) Deve-se multiplicar a [ ] x motilidade, que nesse caso foi de 90% = 0,9, logo teremos
4,680,000,000 sptz/mm³;
8) Deve-se dividir esse valor pela dose inseminante
¿ 4,680,000,000
100,000,000
SINCRONIZAÇÃO DO ESTRO: PRINCÍPIOS E TÉCNICAS – EDILSON LOPES JR 18/06/18
117
Sincronização: Agrupar estros e ovulações em um curto período de tempo ou até mesmo em

um dia, para que se agrupe, IAS, montas, gestações e partos.
Vantagens:
 Diminuir o custo da IA;

 Fornecimento racional da alimentação;
 Partos programados: Reduz a mortalidade pós-natal, aumenta a produção de leite
A lactação chega ao pico de lactação com 45 – 60 dias caindo posteriormente, deste modo com
a sincronização do estro, tende-se a concentrar e aumentar a produção de leite por período. Utiliza-se
a divisão de lotes na propriedade. Quando o custo da produção se igualar ao lucro, deve-se programar
partos do próximo lote, neste momento, para que não haja queda da produção de leite.
 Uniformidade e aumento de kg/leite por lactação;

 Uniformidade do lote, para animais de corte.
Princípios Fisiológicos da Reprodução
O hipotálamo é responsável por produzir hormônios liberadores, como o GnRH, que este vai
via sistema porta-hipofisário (sistema que liga a hipófise ao hipotálamo), para a hipófise, que
por sua vez apresenta 3 partes: adenohipófise (anterior), neurohipófise (posterior) e hipófise
intermédia. Especificadamente, a adenohipófise, apresenta células gonadotróficas ou
gonadotrófos, que na sua membrana apresentam receptores para GnRH, e essas, quando o
GnRH se liga aos seus receptores sintetizam LH (hormônio luteinizantes) e FSH (hormônios
folículo estimulantes), que vão para corrente sanguínea até o ovário.
Quando o LH e o FSH chegam aos ovários, esses se ligam a receptores de membrana nos
folículos secundários. Quando o FSH se liga aos folículos secundários (pré-antrais)
transformando-os em folículos antrais, estes produzirão liquido folicular e 17 β-estradiol,
fazendo feedback + com o EHH, aumentando a produção de GnRH, produzindo mais LH e FSH,
mais moléculas de E2 são produzidas. Quando LH chega a seu pico (pico pré-ovulatório de LH)
ocorre a ovulação em 12-20h, elevando e caindo abruptamente, mesmo assim com níveis
ainda altos irão exercer agora a função luteinizante, formando o CL. Quando o estradiol está
em níveis crescentes irão se ligar a receptores no hipocampo (centro do comportamento),
levando a fêmea a cio, enquanto há receptores livres há cio, quando todos os receptores estão
ocupados pelo E2 a fêmea sai do cio. Após o folículo ovulatório, vira CH e CL, que irá produzir
P4 que irá assumir o papel inibitório do E2. Enquanto a P4 estiver alta o EHH estará bloqueado.
Para que ocorra o desbloqueio, deve haver a luteólise pela PGF2α.
Lembrar que a ocitocina é produzida no hipotálamo e armazenada na neurohipófise. E que

estradiol em excesso inibe o EHH.
Os estros se repetem.
Bovina, caprina, suína, equina: ±21d e na ovelha são 17d.
A fase folicular não existe CL no ovário e fase luteal tem corpo lúteo no ovário
No ciclo de 21d:
Fase folicular: 5-7d. Fase luteal: 14-16d
Princípios da sincronização do estro e ovulação
118
Sincronização pode ser por encurtamento ou alongamento (Só existem esses dois princípios).
- Morfologia ovariana/perfil hormonal
- Situação hormonal
Podemos sincronizar o estro dos animais por dois princípios:
1) Encurtamento do ciclo estral;
NÃO USAR EM CAPRINOS PELO CICLO CURTO DA CABRA
O ciclo estral é encurtando a fase luteal, com a aplicação de PGF2α.
Só existem receptores para PGF2α, a partir de 3-4 dias de ovulação, ou seja, um CL de 3-4d
ainda não apresentam receptores, não sendo luteolizados por esta.
Logo o princípio se dá pela lise do CL e o animal entra em estro, com agentes luteolíticos
(substâncias que mimetizam a ação da PGF2α) em no mínimo 2 aplicações em 10 dias.
A primeira desvantagem é que para que esse protocolo dê certo ele necessita estar ciclando (é
entrar em estro, formar um CL e ter luteólise).
Logo, em condições de baixa pluviosidade, desnutrição e de alterações bioclimatológicas o

animal não cicla, logo, esse protocolo só deve ser utilizado em animais que estejam CICLANDO.
Podemos avaliar a ciclicidade através da anamnese, exames físicos e métodos diagnósticos

seriados.
1º Avaliação ginecológica
2º Dosagem de P4
a) Dia 0, 7, 14, 21 e 28
Se vc coleta sangue e dosa P4 e há quedas na [P4] ente 0 a 7 dias e aumento entre os
dias 7 e 14, no dia 21 começa a cair e aumenta a partir do dia 28... o animal está
ciclando
b) Dia 0, 7, 14, 21 e 28
Se durante todas as coletas a P4 estiverem alta os animais estão em anestro

gestacional.
Caso haja um CL persistente, também irá resultar nesse padrão endócrino.
Separar o macho 35 dias antes da US diagnóstica e no dia que separar fazer logo a
primeira aplicação de PGF2nesse dia. Transabdominal 45 dias.
c) Dia 0, 7, 14, 21 e 28
Se durante todo o cio apresentar níveis baixos durante todo o ciclo o animal está em
anovulação.
3º US – Avaliação da dinâmica folicular – Folículos antrais.
a) Dia 0, 7, 14, 21 e 28
Dia 0: 1,7mm
Dia 7: 6,6mm
119
Dia 14: Estrutura circular, com uma parte central é hipoecoica (copiar do áudio)
b) Dia 0, 7, 14, 21 e 28
Em todos os US - CL persistente que pode ser, GESTAÇÃO OU CL persistente,
diferenciar de gestação pela presença do feto no monitor
c) Dia 0, 7, 14, 21 e 28
Todos as US o animal apresenta de folículos pequenos em todos os dias –
ANOVOLUTAÓRIO
4º PRESENÇA DE ESTRO
Principais fármacos e seus princípios ativos:
PGF2α e suas análogas IM
a) Luprostiol (PROSOLVIN®) - 75µg/animal;

b) Cloprostenol (CIOSIN®) - 75µg/animal) - 0,3mL IM;
c) d-Cloprostenol (PROLISE®) - 75µg/animal.
Ovelhas não abortam com mais de 70 dias de gestação, pois a placenta passa produzir
P4 e ela não tem receptores para PGF2α
Vantagens: Desvantagem:
- Baixíssimo custo; - Obrigatoriedade de se avaliar ciclicidade;
- Praticidade; - Ciclo curto da cabra – a cabra tem ciclo

curto, entra em estro e ao invés de entrar
em estro novamente com 21 dias ela entra
em estro com 5 dias, pois o corpo lúteo
morre antes dos 10 dias (LIBERAÇÃO
ENDÓGENA DE PGF-2α, por liberação
espontânea).
2. Alongamento do ciclo estral.
Base do princípio: Consiste em fornecer P4 ou progestágenos para bloquear o EHH e quando

me interessar retirar a fonte de P4, simulando o desbloqueio do EHH, fazendo com que todos
os animais entrem em estro ao mesmo tempo. Não havendo necessidade a avaliação de
ciclicidade, sendo essa a principal vantagem, pois os animais não precisam estar ciclando.
A partir do momento que eu forneço P4 ou progestágenos, não estamos alongando a fase

luteal e sim simulando essa fase, SEM aumentar a vida do CL, porém pode diminuir se ofertada
em animais com CL <3-4d, pelo bloqueio do EHH e diminuição da liberação de LH, fazendo com
que haja diminuição da fonte de luteína, levando a morte do CL. Logo em CL >4 dias não ocorre
porrísima nenhuma, pois este independe do LH.
Progestágeno: Substância sintética que mimetiza a ação da P 4
Progesterona: Hormônio propriamente dito.
120
Esse método pode ser utilizado em períodos de ciclicidade ou quando os animais não estão
ciclando, uma vez que agentes luteolíticos, uma vez que como elas não estão ciclando não
possuem CL logo não há sítios ativos de ligação para os agentes de luteolíticos.
Aula 4 – Biotecnologias da reprodução 25/06/2018

O áudio começa com a explicação do princípio do alongamento do ciclo estral.
Princípios do alongamento do ciclo estral:
1) Bloqueio do EHH, pelo uso de P4 ou Progestágenos, como:

2) MGA (Acetato de Melengestrol) na ração – Progestágenos – NÃO SE USA MAIS
a. Desvantagens do MGA:
i. Hierarquia no cocho;
ii. Descontrole de ingestão.
3) Nogestomet (Implante auricular) – Entre a pele e a cartilagem da orelha.
6mg/implante.
a. Desvantagem (Nogestomet)
i. Fácil retirada – Alto índice de perda na espécie caprina;
ii. Invasivo;
4) MAP/FGA (Esponja intravaginal)
a. MAP: Acetato de Medroxiprogesterona (60mg/esponja)
b. FGA: Acetato de Fluorogestona (45mg/esponja) – Não é vendida no BRASIL.
O saco vem com 25 esponjas.
Lembrar de aplicar antibiótico na esponja, a fim de evitar vaginites e cervicite. Sendo o mais
utilizando a Terramicina.
Deve-se empurrar o êmbolo até o final, caso não chegue ao final, deve se fixar o êmbolo e
puxa a cânula para trás, pois terá a certeza que a esponja estará dentro da vagina, uma vez
que animais possuem vaginas de diferentes comprimentos.
Deve-se cortar o excesso do cordão.
Quando for retirar a esponja, levar uma pinça Allis, pois caso o fio se parta você tem como
retirar. Para que isso não ocorra, puxar com os dedos pelo final dela e vir trazendo ao mundo
exterior.
c. Vantagens:
i. Praticidade;
ii. O custo é relativamente baixo, em relação aos outros dispositivos
progestágenos. Sendo o mais utilizado em pequenos ruminantes.
d. Desvantagens:
i. Casos de vaginite e cervicite associados ao uso da esponja;
5) Dispositivos intravaginais (CIDR®, DIB®, PRIMER®, TRIUB®) – PROGESTERONA
Dispositvo Interno de Liberação Controlada de P 4 – CIDR. Estes indicam quem está com
a esponja.
Estes permitem que o bloqueio e o desbloqueio do EHH mais eficiente, pois são mais potente
nestes caso, pois os dispositivos estão impregnados de progesterona e as esponjas com
progestágenos, sendo o melhor o dispositivo de sincronização de cio.
121
Para pequenos animais utiliza-se o (CIDR®, DICO®). Não se recomenda a utilização para
pequenos animais, pois o aplicador é muito curto, aumentando a probabilidade que caia após
a aplicação.
CIDR: 1g de P4 /Vaca ; 350mg de P4 /Cabras ou ovelhas. DICO: 300mg de P4/Pequenos ruminantes.
a. Vantagens
i. Melhor concentração de estros e ovulações, culminando com maior
fertilidade;
ii. Não retêm líquidos vaginais, propiciando um ambiente vaginal
saudável.
b. Desvantagem
i. Quando utilizado uma vez só, o custo é alto
O CIDR não deve ficar para fora, só apenas a anteninha.
Deve-se cortar o excesso da antena.
Associações hormonais Olhar no áudio o começo 1:15h +/-
- Luteolíticos / Progestágenos;
- Hormônios – Ovulação.
 GnRH
 eCG
Geralmente esses hormônios são liofilizados, e quando resuspender tem uma validade de
7d.
 hCG – Tem a mesma função do LH e FSH
Protocolos – BOVINOS
Encurtamento de cio:
IATF sem detecção de estro:
Geralmente quando se tem muitos animais e poucos manejadores.
D0 D7 D9 D10
GnRH PgF2α GnRH IA
Antes do D0: Selecionou-se animais vazios por três métodos: exame ginecológico, US e
aplicação de PgF2α.
Aplica-se GnRH em todas as vacas. Teremos vacas em fases folicular e fase luteal.
As fêmeas que estão na fase folicular, vai haver maturação folicular, ovulação e formação do
CL. As que estão na fase luteal terão corpos lúteos pequenos e grandes. Os pequenos com 3 –
122
4d são dependentes de LH, e vão se desenvolver e a população que tem CL’s grandes com >5d
eles permanecem. Com 7 dias todas as categorias de vacas em fase luteal. Aplica-se PgF2 α,
havendo luteólise, caindo P4, e havendo o pico de LH, sincronizando o estro do lote. Quando
não se tem o cio de referência utiliza-se um concentrador de cios 24-36h após a aplicação da
PgF2α, para concentrar picos pre-ovulatórios de LH, podendo realizar a IA 24- 36h após a
aplicação da 2ª dose.
A VACA É INSEMINADA NO ESTRO POR ESTAR MAIS DILATADA, E O ESTRO DEMORA 17-21H.
Aplica-se a PgF2α com 7 dias porque a fase luteal tem 14 dias e com 7 dias é uma data segura
que haverá CL’s no ovário.
IA pós-estro com detecção de estro
D0 D7 D12
GnRH PgF2α DE+IA
Quando se tem manejador e poucas matrizes. Propriedade de baixo poder aquisitivo
Aplica-se GnRH em todas as vacas. Teremos vacas em fases folicular e fase luteal. As fêmeas
que estão na fase folicular, vai haver maturação folicular, ovulação e formação do CL. As que
estão na fase luteal terão corpos luteos pequenos e grandes. Os pequenos com 3 – 4d são
dependentes de LH, e vão se desenvolver e a população que tem CL’s grandes com >5d eles
permanecem. Após a aplicação da PGF2α, com 24 horas começa a observação do cio, na
ordenha da manhã e na ordenha da tarde. Se ciar de manhã insemina de tarde, se ciar tarde
insemina de manhãzinha. Pois sem concentrador de ovulações, teremos cios mais espaçados,
ovulações mais espassadas, perdendo mais tempo
Alongamento do ciclo estral
IATF (muita fêmeas/ baixa mão de obra/ alto poder aquisitivo)
D0 P4 (CIDR®) D7 D9 D10
GnRH PgF2α GnRH IA
Dia 0 aplico GnRH, coloco o implante de CIDR. Há animais fase folicular e fase luteal. Como há
o bloqueio do EHH, caindo LH e FSH, os folículos pequenos vão entrar em atresia folicular, até
a progesterona baixar. Na fase luteal com CL pequenos 3-4d ocorre regressão por luteólise. CL
grandes >4dias, não vai ocorrer nada, pois eles não dependem de LH, para evitar que isso
ocorra (persistência do CL), no D7 aplica-se PgF2α. Com 48h (D9), aplica-se um concentrador
de cio, 36h faz a IA.
IA pós-estro com detecção de estro

Para situações com poucas fêmeas, muita mão de obra, e baixo poder executivo.
123
D0 P4 (CIDR®) D7 D12
GnRH PgF2α DE+IA
Com a retirada do CIDR, a DE, começa 12h depois, pois o tempo de regressão luteal, pois o
desbloqueio do EHH é mais forte com o CIDR, do que com a esponja. Se ciar de manhã
insemina a tarde, e se cia a tarde, insemina na manhã seguinte.
O grau de concentração de cios do encurtamento .. 2h:02minutos pegar no áudio.

Momento da IATF
Protocolo de 3 manejos – BE 8,5
D0 P4 (CIDR®) D8,5 38 ou 44h D10

BE Retira P4
1 2 3
1)BE (Benzoato de Estradiol) e aplicação do CIDR;
Ele bloqueia o EHH pelo uso do Estradiol, mas que as ondas foliculares, estejam todas
uniformes, com folículos pequenos.
2)PGF + eCG BE
Luteólise e estimular ondas foliculares
3) IATF
124
OVELHAS
 Natural: Efeito macho

 Hormonal: Agentes luteolíticos/progestágenos.
Efeito macho
 Os animais devem ser separados, machos e fêmeas;

 Devem estar a pelo menos 200m de distância;
 Os manejadores deve manejar as fêmeas primeiro.
Efeito macho:
IDEAL que fosse assim:
D0 LH + ovulação + CL+Luteólise D19 D21

Carneiro estro
O que realmente acontece é isso:
D0 LH + ovulação + CLhipofuncional D7 D27

Carneiro
O nível de LH não é suficiente para manter e desenvolver o CL, sendo assim o CL é

hipofuncional, sendo assim o cio que me interessa é o segundo cio após o efeito macho.
Pegar no áudio.
Porque em caprinos não se deve utilizar o princípio do encurtamento do ciclo estral?
Pois a cabra tem ciclo curto fazendo com que o CL não dure até a segunda aplicação da PGF2α
IA pós-estro (OVINOSYNC®)
IA pós-estro (Ovinosync) Encurtamento do Ciclo Estral – Uso de agentes luteolíticos
D0 (Pgf2α) D10(Pgf2α) DE + IA16-20h pós-DE D13
125
- Animais devem estar cíclicos, dentre os cíclicos deve-se fazer um diagnóstico de gestação e
separo as vazias, e aplico PGF2α. Quem não apresentou base de cauda molhada, coloca no
protocolo.
- Devo respeitar a fase luteal e com 12 dias antes de iniciar o protocolo, se fosse cabras seriam
14 dias. No caso D0.
D0: Aplico PGF2α em todo o plantel. Se o animal estava na fase folicular, não afeta nada. Se
tiver na fase luteal, os CL com <4 dias de vida não possuem receptores para prostaglandina e
não ocorre nada. Se for em Cl com >4 dias, ocorrerá lise. Com 10 dias irá ter CL’s e aplica
PGF2α dnv, D10. A partir de 24 horas (D 11) começa a detectar estro, se ciar de manhã, insemina
a tarde, se ciar a tarde, insemina de manhã. Deve-se detectar a cada 4 horas.
- Ovelhas ovulam no 1/3 final do estro, 24 horas antes do cio.
- Em condições de fazenda se insemina com 12 horas do primeiro cio detectado, pois corre o
risco de perder a ovulação pois estou admitindo a ocorrência do cio antes do cio durante o
período que não observei. E se deve inseminar antes do cio, por conta da diferença
cronológica sódos gametas.
Ovelhas: 24 – 36h DE Vacas: 17h DE
IATF (Ovsync®) Encurtamento do Ciclo Estral – Uso de agentes luteolíticos
D0 (GnRH) D7(Pgf2α) D9 (GnRH) 24-36h antes da IATF D10 (IATF)
Animais que estão em fase folicular, vão ser estimulado, ocorrendo ovulação e formação do
CL. Com o CL <4 dias, ele ainda é dependente de LH e como o GnRH estimula a liberação de LH
e FSH, ele vai maturar e com os CL >4 dias não vai ocorrer nada. No dia D7, vai haver aplicação
de PGF2α, para que ocorra a luteóise, marco a inseminação para 72h após a aplicação e 24-36h
antes da IATF aplico GnRH para concentrar as ovulações.
IATF (Synchrovine®) – Encurtamento do ciclo estral – Uso de agentes lutelíticos
D0 (PGF2α) DE+IA D7(Pgf2α) D9 (1ª IA) D22 (2ª IA)
Com 24h da aplicação da PGF2α, começa a detectar cio a cada 12h. No D 7 aplica nos animais
que não foram inseminadas e que não apresentaram estro, pois estes estavam em fase luteal,
porém tinham <4 dias e não tinham receptores para PGF2α. Com 42h da segunda aplicação de
PGF2α.
O PROFESSOR NÃO CONSIDERA ESSE PROTOCOLO COMO IATF.
IA PÓS ESTRO COM ALONGAMENTO DO CICLO ESTRAL – PROGESTÁGENOS
IA- PÓS ESTRO: s/ IATF
126
D0 (MAP/FGA) MAP/FGA D10(PGF2) D12 (Retira Esponja e eCG) DE + IA D14
Os folículos vão entrar em atresia, pois o EHH vai estar bloqueado. Em Cl <4 dias, vão regredir,
pois ainda são dependentes de LH, com o CL<4 dias, não vai ocorrer nada. Com 48h antes do
dia de retirar a esponja, deve-se usar PGF2α, para garantir que não haja nenhuma fêmea com
CL endógeno. No dia D12, há descarga de GnRH pelo hipotálamo e descarga de LH e FSH
levando o animal em cio, no dia D 12 também se recomenda a aplicação de eCG, 12h após
retirar a esponja, começa a detectar estro. Se tirou de manhã, começar a detecção 12h
IA- PÓS ESTRO: c/ IATF
D0 (MAP/FGA) MAP/FGA D10(PGF2) D12 (Retira Esponja e eCG) D13 GnRH D14
Os folículos vão entrar em atresia, pois o EHH vai estar bloqueado. Em Cl <4 dias, vão regredir,
pois ainda são dependentes de LH, com o CL<4 dias, não vai ocorrer nada. Com 48h antes do
dia de retirar a esponja, deve-se usar PGF2α, para garantir que não haja nenhuma fêmea com
CL endógeno. No dia D12, há descarga de GnRH pelo hipotálamo e descarga de LH e FSH
levando o animal em cio, no dia D 12 também se recomenda a aplicação de eCG. Marca a IATF
para 48h após a retirada da esponja e aplicação do eCG e com 24 -36h aplica GnRH para
concentrar as ovulações.
127
Caprinos:
Encurtamento
S/ IATF
IA pós-estro- Encurtamento do Ciclo Estral – Uso de agentes luteolíticos
D0 (Pgf2α) D11(Pgf2α) DE + IA 16-20h pós-DE D13

Pegar texo no áudio 1:00’:00”
Alongamento
IATF
IA pós-estro- Encurtamento do Ciclo Estral – Uso de agentes luteolíticos. S/ DE
D0 Esponja D7 eCG D9 Retirada da esponja D10GnRH D11 IA
Pegar texto no áudio.
O uso de eCG não sincroniza cio, o que faz isso é a esponja, ele faz com que aumente o número
de animais gestantes, pois concentra as ovulações, consequentemente mais animais vão parir.
A esponja, ½ implante e implante não apresentam diferença estatísticas entre si, quando % de
animais em estro. Em relação a cabra ovulando a esponja é superior ao ½ implante e não difere
do implante. Em relação a fertilidade se comporta como o item anterior e em relação a
prolificidade não diferem entre si.
A eCG PODE promover uma superovulação
Entre CIDR, Esponja nacional (MAP) e internacional (FGA), não houve diferença estatística entre
animais que entraram em estro. O início do estro após a retirada do dispositivo, a MAP e FGA
foram inferiores ao CIDR, logo este é superior, pois gera um estro mais precoce que as
esponjas, pois as esponjas possuem progestágenos e o CIDR possui P 4, pois o desbloqueio
causado pela queda de P4 é mais forte do que o causado por progestágenos.
128
Fatores que influenciam a TSEO
 Variabilidade (ESTRO, PPLH, ovulação)

o Estro em 49-72h -> 25% de fertilidade
o Estro em até 30h -> 65% de fertilidade
Estros muito tardios após a retirada dos dispositivos, geram baixa fertilidade.
 Anticorpos anti-eCG
o 60% (estros tardios) -> aumenta tx de ligação (>25%);
o 10% (estros tardios -> diminuem a tx de ligação (<5%).
Fêmeas que são submetidas a vários protocolos utilizando eCG, maior será o número de
complexo Antigeno-AntiCorpo anti eCG, maior a quantidade de eixos tardios, logo quando
menor. Logo, se recomenda intercalar os animais, moléculas de eCG são encontradas em até 1
ano após a aplicação.
Protocolo curto em caprinos e ovinos
 Tratamentos progestágenos giram em torno dos (11 -14d) – PROTOCOLOS LONGOS

o A diminuição de progestágenos (FT) -> Diminuem fertilidade.
Observou-se que no dia da retirada da esponja a concentração de progestágenos seria

melhor, logo o desbloqueio do EHH seria menos eficiente.
Com a retirada da esponja a queda de MAP, não vai ser de forma tão abrupta, pois a
concentração dele é menor na esponja, logo vai demorar ocorrer o desbloqueio do EHH,
demorando a descarga de LH e FSH, demorando a maturação, fazendo com que demore mais
tempo para o FSH se ligar nas células da granulosa para liberar E2, demorando mais ainda para
fazer feedback+ com o EHH e promover o complexo hiperplasia e hipertrofia uterina,
multiplicando o receptores para ocitocina, para que haja a motilidade uterina para aumentar a
motilidade espermática.
Para os oócitos, a demora de ocorrer um feedback +, significa que os níveis de LH demorarão a

subir para que ocorra o pico pré-ovulatório de LH, fazendo com que o oócito passe mais tempo
dentro do folículo. Logo, o oócito deve estar maduro a tal ponto que a maturação oocitária
deve culminar com o pico de LH para que ocorra ovulação, caso ocorra assincronia em uma das
duas partes, ele não ovula, sofrendo processo degenerativo e quando a próxima onda aparecer
ele vai gerar um oócito não fecundável.
 Protocolos a curto prazo - Tratamento progestágenos a curto prazo ≠ de

encurtamento.
Esse tipo de protocolo faz parte do protocolo de alongamento do ciclo estral, pois estou
utilizando progestágenos. – Não confundir !!!
IA pré-fixada:
D0 Esponja + PGF2α MAP/FGA D5Retirada + eCG 24-36h D6 (GnRH) D7 IA
129
Animais que estão na fase folicular do ciclo ocorre atresia folicular e os que estão na fase
luteal com CL <4 dias ocorre regressão luteal e os com >4 dias sofrem luteólise, fazendo com
que todos se encontrem na fase folicular. No dia 5 retira a esponja e aplica eCG, fazendo com
que concentre as ovulações. Após 48h marca a IA e 24-36h antes da IA, deve-se aplicar o
GnRH.
IA pós - estro:
D0 Esponja + PGF2α MAP/FGAD5 Retirada + eCG DE + IA D7 IA
No dia D5 aplica eCG e com 12h começa a DE a cada 12h, se ciou de manhã, insemina a tarde e
vice/versa. Em condições experimentais com 12h após a aplicação do eCG começa a DE de 4
em 4 horas, a inseminação fica a 16-20h após a detecção do estro.
O estro geralmente ocorre +/- 30h após a retirada da esponja e com 60h ocorre a ovulação.
A escolha do protocolo
É o método mais simples, que curse com o melhor aproveitamento do reprodutor. Mais rápido
e econômico.
Um macho dá conta de 2 fêmeas sincronizadas (1:2) em estação de monta (1:25).
130
Assunto da 2ª prova de Biotecnologia da Reprodução
PRODUÇÃO in vivo de embriões Múltipla ovulação e recuperação de embriões

(MORE)/Múltipla ovulação e transferência de embriões (MOTE)
Na MOTE escolhe-se uma fêmea de alta aptidão genética, para promover superovulação, e
promove a fecundação e transfere o embrião para animais de baixa qualidade genética.
 Vantagens da MOTE:
o Encurtamento do intervalo entre gerações – acelerando o MGA;
o Teste de progênie – maior confiança na expressão de características no
rebanho;
o Difusão intercontinental de material genético;
o Menor introdução de doenças exóticas;
o Preservação de espécies em extinção;
o Base para outras biotécncias.
2ª AULA MOTE – EDILSON
Superovulação (Pegar no caderno de Patrícia e áudio)
Só quem tem receptores para inibina são folículos médios e pequenos chamado de
codominância (um folículo pré-ovulatório não inibe o outro, pois não possui receptores para
inibina). Os folículos grandes, secretam inibina.
A Superovulação ela maximiza o fenômeno da codominância.
Superovulação: (09’)
1. eCG
 Fármacos superovulatórios
o eCG
o Dois dias antes do fim do TSE (dose única)
o 1500 a 2000 UI (IM)
eCG – não se usa mais
131
D0 C-MAP D12 1600UI eCG D13 D14 R-MAP
Superovulação >5 ovulações (somando os dois ovários).
Folículo persistente: folículo que não ovulou.
Não se usa mais eCG por conta do baixo número de ovulações e que com maior dose gera
mais folículos persistentes.
Logo quanto menor a dose, menor o número de ovulações e quanto maior a dose maior o
número de folículos persistentes é maior.
Doadora permanente: uso racional da matriz para que possa utilizá-la mais vezes
Desvantagem:
- Alta meia vida (120h), com isso estimula as células da granulosa a produzirem mais 17-β
estradiol, aumentando ainda mais a concentração de E 2, levando ao bloqueio do EHH.
- Altas doses de eCG levam a uma maior concentração de estrógenos e aumenta o número de
anticorpos anti-eCG;
- Há um menor número de embriões transferíveis por conta do amadurecimento exacerbado

do oócito;
- Presença de cistos foliculares.
Não utilizar eCG sozinha.

25:25’ – Alexandro perguntando - pular
26:00’ – volta a falar
2. FSH
 Baixa meia vida, devendo ser adm em doses sucessivas a cada 12h, devendo começar
dois dias antes do fim do tratamento de superovulação (TSEO)
o FSH É BEM MAIS TOP QUE eCG
 Existem duas apresentações comerciais.
 Ambos são de origem suína (menor resposta imunológico) –FSH-p
o Folltropin-v® e Pluset®
o Pluset® - tem a mesma concentração de LH e FSH;
 Folltropin-v® - tem 15% da concentração de FSH em LH; - logo pode-se dizer que esse é
mais puro do que o Pluset®.
 É melhor que se tenha FSH do que LH, pois o mais importante é o recrutamento
folicular.
Se você aplicar 200mg em animais jovens ou que nunca foram submetidos a esse tipo de tratamento, vai
haver uma superovulação violenta, levando a cisto folicular
Esses hormônios vêm liofilizados
132
- A solução mãe não deve sair da geladeira.
- Dilui todo e coloca em tubos Eppendorff e leva para o aprisco refrigerado, para que não
ocorra desnaturação proteica dos hormônios.
Protocolo
FSH-p
D0 C-MAP D12 50/50 UI FSH D13 25/25 UI FSH D14 R-MAP
As doses iniciais de FSH devem ser maiores para iniciar o recrutamento folicular e diminui para
metade para manter o recrutamento folicular. Não tem luteolíticos porque a fase luteal da
ovelha dura de 12 a 14 dias, não sendo necessários o uso de luteolíticos.
Respostas ovulatórias que variem de 12 a 14 ovulações, pois respostas maiores representam

hiperestrogenismo, levando uma diminuição da qualidade dos embriões transferíveis, além de
aumentar a resposta imunológica. Copiar restante do áudio 00:50’.
FSH-o (OVAGEN®) – Protocolo com 8 doses decrescentes
FSH-o
D0 C-FGA D10 1,5/1,5mL D11 1,5/1,25mL D12 1,25/1mL e R-FGA D13 1/1mL
D10 ao D13 -10mL de FSH-o: 8mg/@, fracionada em 4 dias. BID
Copiar tudo do áudio – Não tô conseguindo prestar atenção.
Variabilidade na resposta superovulatória:
 Raça
o Uma raça não responde igual a outra – raças respondem de forma diferente.
o Quando a doadora ovula, CH se transformam em CL, porém esses CL vão só
aumentar de tamanho
1:15’ Regressão pré-matura de CL
Protocolo para evitar regressão pré-matura de CL (só uso quando tem na escrituração
zootécnica que tem alto índice de regressão pré-matura de CL), pelo uso de FM 1mg/kg 72h
após retirada da esponja em 8 doses (D17 – D20) a cada 12h (BID).
Pegar foto no celular a foto do esquema do protocolo.
 Estação/stress térmico: não fazer no 2º semestre do ano

o Queda nos hormônios da reprodução;
133
 Alimentação
o Subnutridos/super-nutridos: Respondem menos do que os animais bem
nutridos.
Animais que comem demais, aumenta Leptina para que expresse saciedade, ele baixa
os LH e FSH, não superovulando, levando a baixos índices de superovulação.
o Bem-nutridos: Respondem melhor
 FSH/LH:
o Lembrar do Folltroprin®
o O número de ovulações é melhor quando se tem menores concentrações de
LH.
 Nº de partida
o É o número que vêm na caixa. Se forem todos iguais, o risco de ser bom ou
ruim pode ser de 100% e usando de números de partida diferentes poderá
haverá resultados ruins e bons, porém ainda terá os bons.
o É melhor ter números de partida diferentes – comercial;
o É melhor ter números de partida iguais – experimentos.
 Idade:
o Animais muito velhos ou muito jovens não irão responder como um animal
maduro.
ESTRO E FECUNDAÇÃO
 12 h após a remoção do dispositivo/esponja para começar a DE, sendo que na

receptora iremos realizar a fecundação.
 Sinais clínicos do estro:
o Anatômicos – vulva
 Edema;
 Hiperemia;
 Corrimento.
o Comportamentais:
 Agitação da cauda;
 Docilidade;
 Imobilização.
Ao DE, recolher o rufião e trazer o reprodutor. Deixar apenas uma monta pois 24h após será
utilizado para realizar uma nova cobertura.
 DE:
o A importância de saber a hora exata do início do estro, uma vez que fêmeas
inseminadas entre 20-24h do início do estro possuem maiores números de
embriões clivados e embriões na placa.
o Caso você insemine/cubra muito cedo (<12h) ou muito tarde (>32h), tanto o
número de embriões clivados, quanto de embriões por placa serão reduzidos.
134
D0 C-MAP D12 FSH D13 D14 R-MAP + DE D18
Detecção de estro da receptora:
 Sincronia doadora-receptora
o Usar rufião- DEFERENTECTOMIA – MELHOR FORMA DE FAZER O RUFIÃO
 Vasectomizado;
 Esperar cicatrizar e zerar espermograma.
 Inteiro + avental;
 Marcador com tinta no abdômen do rufião.
 Fecundação propriamente dita

o Monta natural
 Livre
- Alta praticidade.
- Reprodutor munido de um colete marcador e ele vai fazer as coberturas por ele mesmo,
geralmente (1M:2F). Como não há controle ele pode cobrir uma fêmea várias vezes, fazendo
com que quando outra doadora entre em estro, a concentração espermática estará diminuída,
resultando em péssimos resultados.
- O profissional não acompanhamento
 Controlada
- A monta é realizada após a condução do reprodutor até a matriz pelo operador, onde este irá
atestar a cobertura da fêmea pelo macho.
- Possui uma menor praticidade, fazendo com que exija de um número menor de
reprodutores, aumentando o número de fecundações.
- 2 MN a cada 24h.
-1M:2F
o IA
 Transcervical superficial e profunda
 Intrauterina (laparoscopia)
Não é recomendado o uso de IA em associação com a superovulação em ovelhas e cabras,

sendo recomendada por MN, devido a baixa % de fecundidade. Sendo mais utilizado em vacas.
Colheita de embriões
De onde e quando colher?

Método de colheita
Avaliação de embriões
1) De onde colher?
135
Tuba: 4 a 5 dias após a ovulação
Para embriões de até 8 células
Utero: 6 dias após a ovulação ou monta e 7 dias após a ovulação ou monta em demais
espécies.
Mórula ou blastocisto
MÉTODOS DE COLHEITA DE EMBRIÕES:
 Cirúrgico (útero-oviduto) – Laparatomia – mais utilizado em ovelhas (pois a cérvix da

ovelha não permite a coleta transcervical); Embriões de 2-4-8 células
 Semi-cirúrgico (útero) – Laparoscopia; Punção com trocater – ñ é mais utilizada.
 Não cirúrgico (útero) – Transcervical – Para animais de grande porte, sendo possível
em caprinos.
Lavagens devem ser realizada PBS (37ºC).
Colheita de embriões Aula exta 30/07/2018 – 07:00 – 10:00.
Pegar até aqui do caderno de Patrícia/áudio
Conferência do número de ovulações
(Nº de estrututras/ nº de CL )* 100
1) Face do músculo: isolado simples/Wolf/ Suttam) –Nylon 0-1 (+ espesso que o 0);
Usar terracotril – Na fáscia do músculo;
2) Abolir espaço morto

- Categut 0 – Contínuo.
3) Wolf na pele
Depois que fechar fazer uma dose de PGF2α IM - 75µg/kg
Fazer FM 2,2mg/kg 3 d
Método semi-cirúrgico (Laparoscopia):
Não se faz essa
Tudo igual até chegar a laparoscopia
Conta as ovulações no ovário esquerdo e no direito.
Iniciar coleta se houver 5 ou mais CL’s
Pós colheita
136
AB – Oxitetraciclina
AI
PGF2alfa
Método não-cirúrgico (transcervical)
Método de escolha para grandes animais.
24h antes da coleta aplicar 75µg/kg IM, pois essa aumenta a dilatação cervical e aumenta as
taxas de recuperação, tendo como desvantagem não conseguir detectar regressão pré-matura
do CL, embora não prejudique o embrião. Por isso alguns técnicos fazem laparoscopia antes,
porém não muito indicado (o professor não faz – ele faz no dia). Para saber se houve regressão
pré-matura, os embriões são de má qualidade.
No dia anterior a coleta, realiza-se a aplicação de PGF2alfa, no dia seguinte vai levar o animal
para maca de coleta transcervical, colocando animal em estação. Realiza-se tricotomia com
tesoura dos pelos perivulvares, lateral de cauda e base da cauda para facilitar a higienização
com água corrente, solução fisiológica e álcool..
Usar Lidocaína a 2% ( 3 a 5 mL a depender do escore)
- Epidural alta (L4-S1)
- Epidural baixa (última sacral e primeira coccígea).
Com auxílio do espéculo de Collins longo, lubrificado com ... pegar no áudio, to com preguiça:
(01:20’);
Existem dois tipos de coleta de embrião em pequenos ruminantes: circuito aberto e fechado.
a) Circuito aberto: O circuito aberto de colheita transcervical de pequenos ruminantes é

quando ocorre a desconecção dos cateteres;
Coloca-se um cateter (sonda nasogástrica nº 10) com o êmbolo do aplicador de sêmen,

para chegar no corpo do útero. A forma mais correta de saber até aonde cortar.
b) Circuito fechado: Não há desconecção dos cateteres
Muda o tipo de cateter. Utilizamos um cateter em Y (uma via para a bolsa de DMPBS e
outra para o filtro de coleta).
UTILIZADA EM CAPRINOS COMO MÉTODO DE ELEIÇÃO. A tx de recuperação é maior.

Porém em ovelhas é melhor indicado a laparotomia.
Avaliação dos embriões
Pegar no áudio 2 do segundo áudio
137
18:53’’
Qualidade embrionária
Embrião 1 (Excelente/bom): Simetria perfeita; blastômeros uniformes; 85% massa

embrionária; se admite 15% de massa embrionária degenerada (enegrecida)
Embrião 2 (Regular): Irregularidades gerais e individuais moderada; 50% de massa

embrionária intacta.
Embrião 3 (Pobre) Irregularidades gerais e individuais maiores; 25% de massa embrionária

intacta.
Embrião 4 (degenerado): Sem forma; impossível determinar estádio; desorganização

celular
1,2 e 3: São os embriões transferíveis
1 e 2: São os únicos que aguentam criogenia.
Transferência de embriões
Resposta ovariana das receptoras
- Laparoscopia (6 ou 7 dias pós-IE) – INÍCIO DO ESTRO
Criopreservação de embriões
Primeira Criopreservação
Murina
Protocolos
- Crioprotetores/resfriamento-aquecimento
- Cristais intracelulares de gelo (gelação)
- Recristalização (descongelação)
- Danos celulares
Quando eu trabalho com métodos de queda da temperatura a criopreservação é lenta, alguns

pontos são congelados mais rápido do que outros, pois as células não são homogêneas, há
diferentes pontos de congelamento.
O crioprotetor homogeniza o meio de duas formas:
Extracelular: Ele rouba água da célula
Intracelular: Ele substitui a água intracelular
Deste modo ele homegeniza o meio, deixando ele com o mesmo ponto de congelamento
Príncipios do métodos de criopreservação
Lenta: Usar crioprotetores de baixo peso molecular ou em baixas concentrações, pois altas
concentrações levam a intoxicação celular.
138
Rápido: Se for utilizado um método rápido de criopreservação, deve-se homogeneizar o

meio o mais rápido possível, irão formar cristais de gelo, devendo-se utilizar crioprotetores
em altas concentrações e alto peso molecular.
Se for extracelular: A água é retirada da célula o mais rápido possível, pelo aumento do
gradiente de concentração
Se for intracelular: Entra muito rápido na célula, homogeniza o interior da célula.
Independente do método não há outra forma de descongelar no banho maria
Tamanho e estádio embrionário:
Quanto menor o embrião e mais jovem, mais susceptível a danos celulares do que os maiores
e mais velhos.
Permeabilidade osmótica
Maiores pressões osmóticas de alto peso molecular precisam de boa permeabilidade celular,
caso isso não ocorra, leva a danos celulares.
Velocidade de congelação
Velocidade de congelação rápida – altas concentrações, se for baixa, baixas concentrações
MÉTODOS DE CRIOPRESERVAÇÃO
1. CONGELAÇÃO LENTA
A congelação lenta se caracteriza por taxas lentas de resfriamento, por conseguinte, se

trabalha com crioprotetores de baixo peso molecular.
Curva de congelação: É a forma de queda de temperatura que os embriões serão

submetidos.
Para cada espécie há uma curva de congelação
O congelador programável programa a temperatura inicial, velocidade de congelamento.
Congelador programável:
139
O equipamento é formado por duas partes, uma delas é o recipiente dos embriões, que é um
balde cilíndrico e que no centro desse balde há um cilindro de aço inox. Na parte superior do
cilindro existe poços, para colocar as palhetas dos embriões. Conectado a este cilindro há um
cabo de fibra ótica que por sua vez se liga ao sistema de controle do congelador programado.
O recipiente dos embriões seve para inundar com N líquido, deixando este cilindro imerso em
N líquido, deste modo fora do cilindro está a -196ºC. A parede do cilindro de inox é revestida
para ser um isolante térmico, para deixar passar mais ou menos calor para dentro do cilindro,
aumentando ou diminuindo a espessura da parede.
No protocolo de ovinos, foi utilizado uma temperatura inicial de 10ºC, previamente criado um
ambiente de 10ºC com gelo reciclável em isopor e termômetro, onde se coloca as paletas no
GLOBET por 5 minutos, para não haver a mudança rápida de temperatura.
Depois de 5 minutos, colocar as palhetas nos poços do cilindro de aço de inox e aperta iniciar.
E irá começar a cair a temperatura de 1 a 3ºC/min, quando chegar a -7ºC irá apitar e aparecer
a palavra SEEDING (induzir a cristalização). Mergulhar uma hemostática por 3” e pegar a
palheta elevar e tocar na coluna que está meio + embrião, fazendo com petrifique
imediatamente, induzindo a cristalização do meio interno, NÃO FAZENDO ISSO, o embrião não
sobrevive ao frio excessivo.
A temperatura começa a cair 0,1-0,3ºC/min até chegar a temperatura de -35ºC, passando 10’ e
quando chegar nessa temperatura, vai colocar um isopor com N líquido e vai tirar a palheta de
dentro dos poços e jogar direto no N líquido, retirando imediatamente e colocando dentro do
GLOBET e imergindo no botijão de N líquido, numa velocidade de 2500ºC/min.
Da temperatura de 10 a -30ºC demora 1:50 e para chegar a -196ºC tarda 10’. TOTAL 2H.
2. VITRIFICAÇÃO
Banhos com crioprotetor em altas concentrações e coloca direto no N líquido direto.
Colocar os embriões em uma gota de DMPBS + 20% Soro Fetal Bovino por 5’ a 37ºC;
A segunda gota é composta por DMPBS + 20% SFB + 10% GLICEROL 5’ a 37ºC
Terceira gota DMPBS + 20% SFB + 10% GLICEROL + 20% etilenoglicol 5’ a 37ºC
Quarta gota DMPBS + 20% SFB + 25% GLICEROL + 25% ETILENOGLICOL + 0,4M SACAROSE por
30”.
Depois coloca no meio: Meio; Ar; meio + embrião; ar; meio e coloca direto no N líquido.
3. VITRIFICAÇÃO RÁPIDA/ULTRA-RÁPIDA
- Palheta estreita e aberta (OPS)
- Taxa de resfriamento (20000ºC/min)
Essa palheta foi criada para diminuir a distância entre o meio e a palheta e além disso não é
vedada.
A vitrificação ultra-rápida é igual a sequência é igual, só que o envase é em uma palheta OPS e
não veda.
140
Comercialmente usar os métodos 1 e 2.
Descongelação:
Descongelar: Congelamento.
Vitrificação: Aquecer.
Quando você descongela ou aquece, deve-se cortar o local do vedante, para colcoar no
TOMCAT para transferir. Podendo ser feita por transferência direta ou indireta
Transferência direta: Sem retirar o crioprotetor.
Transferência indireta: Retirando o crioprotetor.
Quando for aquecer ou descongelar, deve reidratar a célula e tirar o etilenoeglicol, usando
concentrações decrescentes (1,5M/5’; 1M/5’; 0,5M/5’; 0M/5’ ESSE 0M BSA + 0,4% BSD) e
depois transfere para TOMCAT
Considerações finais:
- A TE é uma biotécnica em cadeia
- Equipe com total controle dos elos da cadeia;
- Para grandes animais é comercial;
- Entrave para pequenos animais
- A TE será favorecida por outras biotécnicas da reprodução.
141
PIV – AULA 30/07/2018
Antes de realizar a PIV deve-se fazer a seleção espermática e há dois tipos:
1. Swimming-up: coloca os sptz no fundo do tubo e espera que eles subam, utilizando os
de cima para a PIV.
2. Gradiente de Percol: (coloca o sêmen na superfície da solução e centrifuga, pegando o
sêmen que está em baixo)
Para saber se a FIV deu certo, avalia a presença de 2 corpúsculos polares (CP’s) no espaço
perivitelínico. Eu não posso chamar de zigoto pois não sei se os pronúcleos feminino e
masculino se fundiram.
CIV: objetiva-se levar o zigoto até o estádio de blastocisto (expandido ou inicial), caso eu já
tenha, posso transferir dois blastocistos.
Aplicações PIV:
a. Conhecer os fenômenos fisiológicos;

b. Desenvolvimento – biotécnicas;
c. Infertilidade.
Limitações
a. Inconsistência – resultado;
Não vale para bovinos, pois há protocolos bem estabelecidos
b. Custo inicial muito elevado;
c. Manutenção – rotina – Limpeza e desinfecção do ambiente e máquinas
4. Obtenção/acondicionamento de CCO’s
a. Abatedouro: transporte/limpeza/banhos
A qualidade de um animal in vivo é superior ao de um animal de abatedouro.
142
Geralmente se trabalha com 90’ se do abatedouro para o laboratório durar 30’. Embora exista
protocolos de até 4 horas de duração.
Transporte:
Preparar garrafa térmica de boca larga para transportar os ovários no abatedouro, nessa
garrafa térmica terá solução fisiológica 0,9% + AB a +/-35 ºC, para manter a viabilidade dos
oócitos até o laboratório. (Cloreto de sódio + Sulfato de streptomicina + Penicilina G)
Ao levar para o laboratório deve-se estar no banho-maria um Becker na mesma solução e na

mesma temperatura da térmica e antes disso pegar peneira e borrifar a mesma solução para
lavar e ao terminar colocar no Becker no banho maria a mesma temperatura.
Limpeza: retirada dos tecidos adjacentes, chamado de toillete e já vai coletando os CCO’s
Colheita de CCO’s:
Tipos de colheita:
a) In vitro:
- Slicing (fatiamento) – folículos de 2-6mm) Não Se usa muito, pois possui bx taxa de
recuperação (nº de cco’s colhidos/nº de folículos fatiados x 100)
Slicing: passar lâmina de bisturi em folículos antrais em cima de um bécker com uma
solução de recuperação, para lavar os ovários
- Punção folicular em ovários de abatedouro
Esta colheita pode ser realizada com seringa ou com bomba a vácuo.
o Com seringa:
Alguns laboratórios utilizam esse procedimento (5 – 10mL) e pegar ovário por ovário e aspirar
e antes de começar colocar aproximadamente 1mL de meio de colheita, quando terminou de
aspirar todos os ovários, puxa um pouco de meio para lavar a agulha, despluga a agulha e
coloca o líquido na placa de contagem.
A agulha deve se utilizar agulhas 18 – 21G (>21G podem levar a extirpação das células do
cumullus) ou (usar uma agulha <18G pode aspirar muitas células corticais, contaminando o
meio e dificultando a visualização dos CCO’s, uma vez que as células corticais possuem
aparência parecida).
Mais barata, porém necessita de um técnico treinado para obter sucesso na tx de recuperação.
(Tx de recuperação: nº de cco’s colhidos/nº de folículos aspirados x 100)
o Com a bomba de vácuo:
A vantagem é o maior número de folículos puncionados/minuto.
143
Saindo da bomba de vácuo, sai uma cânula que vai entrar dentro de um tubo falcon com 2mL a
35ºC meio de colheita, tirando o ar dele, gerando vácuo. Pela outra entrada conecta uma linha
de aspiração (mangueirinha) e conectado a ela, vai estar a um cateter 18G. A pressão da
bomba deve ser regulada a cada espécie. (Bov: 50mmHg; Ovi: 40 -50mmHg; Cap: 30mmHg)
50- 70mmHg – 15mL/min ; Ovi: 40-50mmHg – 12mL/min; Cap : 30mmHg – 7mL/min)
Antes de iniciar a colheita, calibrar a bomba e conta em 1 minuto quantos mL ele puxa para ver
se está correto.
Após calibrar, lavar a linha de aspiração com o meio de colheita.
Porque o CCO’s pode desnudar:
- Qualidade do animal;
- Acondicionamento do ovário (água quente ou fria demais, pode ter descolamento de células
do cumullus);
- Diâmetro da agulha;
- Tamanho da linha de aspiração (Quanto maior a linha, maior a probabilidade de se perder

oócitos), sendo menor a tx de recuperação;
- A agulha deve entrar na região perifolicular, pois se entrar diretamente no folículo ele
estoura.
Uma cânula deve estar desnivelada, para não ter chance do líquido entrar na bomba.
As maiores txs de recuperação foram descritas com essa técnica.
(Espaço para desenhar a bomba)
Procura de CCO’s:
144
Na placa de petri quadriculada, verter o tubo e procurar os oócitos. Ao lado da lupa, quando
achar algum oócito colocar uma mini placa e ir tirando os CCO’s e colocando em uma gota de
meio MIV, quando terminar faz o cálculo da tx de recuperação.
Ao terminar, realizar mais 4 banhos em 4 gotas de 50µL de meio MIV.
Colocar uma 5ª gota para classificar.
(Espaço para desenhar)
Grau de Característica
qualidade
1 Cúmulus compacto, apresentando ≥3 camadas com ooplasmas homogêneo em toda ZP
2 Cummulus compacto < 3 camadas e ooplasma heterogêneo em toda sua ZP
3 Cummulus expandido <3 camadas e ooplasma heterogêneo/contraído
4 Cummulus ausente
Utiliza-se graus 1 e 2 para PIV.
Quanto maior o tamanho do folículo, maior a probabilidade do CCO já está com o cumullus
expandido, diminuindo o grau de qualidade desse animal.
Tem alguma coisa que ele falou no áudio +/- 1:40
Meio MIV: solução Mãe (MPM)
 TCM 199 10X;

 HEPES,
 BICARBONATO DE SÓDIO;
 PIRUVATO DE SÓDIO;
 GENTAMICINA;
 LACTATO DE CÁLCIO diluído em 10Ml de água ultrapura;
 VERMELHO FENOL;
 ÁGUA Meq.
Solução final: Esses ingredientes são colocadas na hora
 MPM;
 Soro de vaca em estro;
145
 FSH;
 Cisteamina
b) In vivo: TUGA ou LOPU
OPU: Aspiração oocitária por TUGA ou LOPU
Em bovinos OPU = TUGA
Em pequenos ruminantes
TUGA: Aspiração guiada por ultrassonografia transvaginal, feita comercialmente na vaca.
LOPU: Aspiração oocitária por laparoscopia, feito em pequenos ruminantes
Quando terminar o processo de coleta, a lavagem, classificação é igual.
Como pequenos ruminantes possuem menos folículos nos ovários deve-se fazer um protocolo
hormonal prévio a colheita, para vacas não precisa.
Para pequenos ruminantes
D0 MAP D8 PGF2α+p-FSH+eCG (a noite) D10 R-MAP + LUPO

 D8 - 125µg PGF2α (48h pré-R-MAP)
 D8 – 70MG Pfsh + 300 UI eCG (36h pré-R-MAP)
 D10 – RE + LUPO
Não se detecta estro e na hora que retira a esponja o animal já vai para maca para ser
realizada a aspiração dos folículos, justamente para não dar tempo ocorrer a ovulação.
TUGA:
 Deve-se fazer uma epidural baixa com 4mL de lidocaína 2% (Ultima sacral e 1ª
coccígea);
 Limpeza da vulva;
 Calibrar a bomba (mL/min); 120mmHg
 Palpar o ovário por via transretal e colocar um transdutor com ultrassom no fundo de
saco vaginal e encostar o ovário no transdutor acoplado com sistema de colheita
agulhado. Visualizar áreas anecóicas e puncioná-las. A medida que a área anecóicas
some o conteúdo folicular vai sendo aspirado.
LOPU:
 Faz-se uma laparoscopia comum, realizando a punção lateral esquerda e depois latero-
direita, a diferença é que faz uma punção para a agulha de aspiração;
 Como sangra, sempre puncione o folículo de baixo para cima, pois caso puncione de
cima para baixo irá sangrar e impossibilitará a visualização dos outros folículos, por
conta do sangue;
 Ao final, banha o ovário com solução fisiológica 0,9% + 1% de heparina para evitar
aderências;
MIV - Maturação in vitro:
146
 Os oócitos graus 1 e 2 estão na 5ª gota esperando o processo de MIV.

 Pode-se escolher entre uma placa de 5 poços ou uma placa de petri;
 400µL nos poços – 50 oócitos ou 50μL na gota na placa de petri – 10 oócitos;
 20 a 24h a partir da punção.
Lupa, microscópio invertido, microscópio epi-fluorescência
1) Por poço colocar óleo mineral (para não desidratar) até 2/3 da altura placa ou do poço;
2) Se for poço colocar 400 µL de meio MIV com pipeta e ponteira no fundo do poço ou da
gota;
3) Colhe os oócitos da 5ª gota e deposita 50 oócitos se for poço e 10 oócitos na placa,
coloca dentro do meio MIV (não colocar no óleo mineral);
4) Colocar na estufa de cultivo 20 a 24h (da punção) a 38,5ºC / CO 2 / umidade.
5) Passado as 24h com a lupa, poderá ser visualizado o primeiro sinal de maturação, que
vai ser a expansão das células do cummulus (O oócito que estava parado em prófase 1,
vai ser a retomada da meiose 1, metáfase 1, anáfase 1 e telófase 1 e ocorre a liberação
do primeiro corpúsculo polar (2º sinal de maturação), vai para prófase 2, metáfise 2 e
para, formando a placa metafásica (3ª sinal de maturação). Para ter certeza da
maturação, fazer uma coloração de Hoechst 33342, ele tem afinidade por DNA,
quando colocar as gotas dentro do poço, onde tem DNA ele vai se ligar e que quando
incidir raios UV, irá fosforescer o primeiro corpúsculo polar e a placa metafisásica.
Um oócito maduro é o que possui os sinais da maturação. Só fecunda se tiver.
(Espaço para desenhar a plaquinha)
D-4 D-2 D-1 D0 Colheita Avaliação e MIV D1 Avaliação dos cco’s
D-4 liga a estuda e com 72h (D-1), afere a quantidade CO2 com o Farayte, no D-2 faz os
meios, no D-1 afere a osmolaridade e o pH, que deve estar 280 – 300mOsm e pH
levemente alcalino 7,2. Se a osmolaridade tiver muito alta usar água mEq e se tiver
147
baixa osmolaridade usar citrato. D0 colheita e avaliação de oócitos e MIV no D1 faz

avaliação dos cco’s maduros
FIV:
Fonte de sêmen:
Congelado-descongelado (palheta)
30ºC / 30” no ar e 30” no banho maria, colocar o conteúdo da palheta em um tubo

eppendorf de 3mL.
Seleção espermática: Pois os sptz que sofreram criogenia podem se degenerar.
Métodos de seleção espermática
a. Percoll (500μL; 30 / 60/ 90%)

1ª centrifugação (10’/600g) – Seleção dos sptz
2ª centrifugação – 3,5mL (10’/200g) - Lavagem dos sptz
Deve-se realizar primeiro a coluna de Percoll (colocar em um tubo falcon de 14mL e colocar no
fundo dele 500μL de Percoll 30% (C1V1=C2V2) o diluidor é meio FIV (150μL de Percoll 100% :
350μL de meio FIV), Depositar 500μl de Percoll 60% e o Percoll 30% sobe, depois colocar
Percoll 90% e o do 30 e 60 sobem e por último coloca o sêmen, colocado pela parede.
Realizar a primeira centrifugação/(10’/600g), ao final dos 10’ desprezar o sobrenadante, e

preencher novamente com 3,5mL de meio FIV para lavar o sêmen e retirar os polímeros do
reagente e faz a segunda centrifugação (10’ /200g), pois a função agora é lavar, não é mais
selecionar.
b. Swim up:
Em um eppendorf, colocar 1mL de meio FIV e vai depositar o conteúdo da palheta de sêmen
no fundo do tubo e este vai para uma estuda por 1h/38,5ºC.
Deste modo os sptz de maior mobilidade vão nadando até a superfície e com uma ponteira e
pipeta se aspira o sobrenadante.
O Percoll é melhor por não
precisar da motilidade dos
SPTZ e o Swim up, necessita
de SPTZ, uma vez que
motilidadade não é
característica de um sêmen Solução mãe (TL-SPERM):
congelado-descongelado. Cloreto de sódio
Hepes
Bicarbonato de sódio
Lactato de cálcio
Fosfato de cálcio
Vermelho fenol
Cloreto de magnésio . 6H2O
148
Cloreto de cálcio x 2H2O

Água ultrapura
Meio FIV – Regulado a 295 a 305mOsm

TL-sperm
BSA
Piruvato de sódio
Gentamicina
Heparina (para realizar capacitação espermática)
Lavagem de CCO’s (meios de FIV);

Preparar placa de FIV
400μL de meio + 20μL heparina + 50 CCO’s maduros/poço ou 10 por gota
É O MESMO PROCEDIMENTO, SÓ MUDA O MEIO
Óleo + meio FIV + CCO + STPZ (1 MILHÃO/mL)
Quanto colocar de SPTZ?

 Precipitado – sptz (1mL FIV)
 [SPTZ] – Usa água para matar os SPTZ – formol é proibido no lab de PIV
o 5 μL de solução STPZ do tubo + 95μL H2O = 1:20
o CE= C/(1/b)x(1/10)x(n/25) x 1000 se tiver em mm³ para transformar em mL.
o CE= N x (20*50) *1000 stpz/mL se for como no exemplo.
o Ex:
CE: x
C1V1=C2V2
X.V1=1.000.000 . 0,4mL
V1= 400000/X
Pegar resolução do exemplo na sala no celular
 Avaliação inicial
o O grande sinal que a fecundação ocorreu é a presença de 2 CP’s no espaço
perivitelínico, retomando anáfase 2 e telófase 2, liberando o 2ºCP. Isso é um
presumível zigoto, para poder avaliar deve-se corar novamente com o corante
e observar ao microscópio invertido e ver a presença dos dois CP’s
CIV: Complementar no audio

 Desnudamento: retirar as células do cummulus do presumível zigoto (pegar no audio
o 400 μL de meio CIV + zigotos (tubo)
o Vortéx (2’)
 Preparo da placa de CIV
o ÓLEO MINERAL + 400 μL de meio CIV no fundo da placa + 10 – 20 presumíveis
zigotos (gota: 10 e poço 10-20)/3 a 7dias a 38,5ºC/5% CO 2/5% O2/
o Tem a mais que os outros aa.
 Bloqueio – desenvolvimento (8 a 16 células)
o Transcrição ineficiente –genoma embrionário;
o Síntese protéica deficiente – diminui metabólitos;
149
o TE – 2 a 4 células (oviduto) – Método para driblar o bloqueio

Como resolver teoricamente o bloqueio
A cada 2 a 3 dias durante o CIV fazer feeding (alimentação do cultivo) – pegar no áudio
Caso haja dificuldade em meio pobre ou células ruins, faz o co-cultivo

- Co-cultivo (BOEC/GC/VERO/BRL)
Cultivar o embrião com outras células da tuba) que vão propiciar...
Preparo da placa de um co-cultivo:

Células + óleo mineral + meio CIV + mais presumíveis zigotos
Essas células possuem fatores de crescimento e remove radicais livres, íons de amônio e
metabólitos embrionários/celulares
Aumenta taxa de fertilização.
Eficácia da PIV – Todas as espécies menos da bovina

 30% - oócitos (MIV) até blastocisto (5-60%)
o Sêmen – capacitação espermática (heparina);
o Qualidade dos CCO ou inabilidade do técnico
o Produtos de qualidade/equipamentos não devem desrregular
 Fertilidade 54% (in vivo =76%)
 Perdas perinatais 15% e in vivo: 9%)
Clonagem e Trangênese 16/08/18
DEFINIÇÃO:
Pegar o restante do áudio de 00:00” a 19:00”
TYLER VENEZIA
150
Importância:
 MGA;
Quanto mais melhorada uma raça para uma característica com bxy – com adaptabilidade.
 Desenvolvimento de outras biotecnologias;
 Biomedicina;
 Pesquisa fundamental.
Tipos de clonagem:
a. Bipartição embrionária
Com um embrião em estado de blastocisto, com uma lâmina de bisturi oftálmica,
partindo o embrião, tendo o cuidado de fazer a secção do botão embrionário, porque
se você partir na metade, pode ser que uma das n metades a outra parte seria inviável,
151
pois ao deixar menos blastômeros de um lado, você prejudica os folhetos

embrionários.
Essa técnica não é muito boa, pois só forma dois clones.
b. Transferência nuclear
É o ato de transferir um carioplasto para um citoplasto.
a. Maturação oocitária
b. Ativação
c. Enucleação
d. Preparo da célula doadora
e. Reconstrução de embriões
Mesa de mármore sem desnível desencostada da parede e com auxílio de um microscópio

invertido, onde acoplado a ele está acoplado um micromanipuladores, que manipulam a
pipetas (de apreensão; enucleação; inoculação) em movimentos horizontais e verticais. Em
cima da mesoplatina vai estar a câmara de clonagem, onde no centro se encontra uma
depressão que vai colocar um meio de manipulação e dentro do meio coloca-se a células que
irão se trabalhar.
1) Maturação oocitária
O primeiro processo é o processo de MIV, pois o principal citoplasto utilizado é um
oócito enucleado.
2) Ativação:
Enquanto houver o MPF (fator provedor de meiose) ainda há
Quem faz isso in vivo é o SPTZ, então temos que simular a mesma ação do SPTZ, fazendo com
que haja entrada de cálcio do meio extracelular e das organelas intracelular. Esse cálcio
promove a desorganização do fator promotor de meiose, fazendo com que retome a segunda
retomada Meiose 2, liberando o 2º CP.
Processos artificiais:
In vitro utiliza-se soluções com Ca2+, detruindo os MPF ou utilizam agentes que promovam o
influxo de Ca2+ ou de organelas intracitoplasmática, através da utilização de Soluções de Cálcio
+ 5 µMolar de ionomicina/4’ ou utilizar estimulação elétrica no equipamento de eletrofusão
com Etanol 7%/5’.
Quando o MPF é desorganizado pelos Cálcio ele tende a se reorganizar, fazendo necessário o
uso de outra substância chamada Ciclohexamida ou 6-DMAP, bloqueando a reorganização da
MPF
3) Enucleação:
Definição: 00:50”
a. Quando o oócito é colhido e coloca ele para maturar, vendo a expansão das
células do Cumullus. Retira-se as células do Cumullus, utilizando Hialuronidase
(1ng/mL) dentro de um tubo com as células e leva ao Vortéx por 3 a 5 minutos, usa
essa por enzima por que as células do Cumullus são ligadas por ácido hialurônico.
b. Após a agitação do vortex, verter e selecionar os oócitos desnudos.
c. Antes de realizar a introdução da pipeta de enucleação, desestabiliza as
glicoproteínas que são entrelaçadas por filamentos de actina, deixando-a frágil e
penetrável, pelo uso da Citocalasina B (5 a 10 µg/mL por 30”), como no final da
enucleação temos que comprovar que o DNA foi retirar o núcleo através da
epifluorescência, colocando em uma solução de um corante vital Hoechst 33348 1-
152
10 µg/mL, o qual possui afinidade por DNA e quando incidir os raios UV, vai
fluorescer. Viu-se o material genético, tem que retira o corante, para poder
colocar o núcleo da outra célula dentro dessa. Retira-se 30%
d. Problemas:
a. O volume exacerbado que é retirado do oócito (30%) do volume
citoplasmático e a radiação UV levam a prejuízos oocitário;
e. Solução:
a. Ativação (MII -> 2ºCP)
b. Cromatina próximo ao 2º CP
Vai ser necessário realizar um processo anterior a enucleação, essa é a solução: fazer uma
ativação depois da MIV, tira as células do Cummulus e depois faz a ativação e depois da
ativação faz a Citocalasina.
A ativação é necessária para fazer uma boa enucleação, pois: é o ato de levar um oótico de
metáfase 2 até formar o 2º CP, pois a cromatina está mais próxima no 2ºCP do que quando só
tem 1 CP, sendo necessário retirar apenas de 15% ao invés de 30%, o que causa bem menos
problemas a célula.
4) Preparo da célula doadora - Carioplasto
A estrutura mais utilizadora para doar carioplasto é o embrião de 8 a 16 células, pois é mais
fácio para separar os blastômeros.
Enquanto no oócito eu tinha a preocupação de apenas amolecer a ZP, no embrião eu tenho

que digerir a zona pelúcida, pelo uso de PRONASE 3mg/mL em pH 2,5, quando a ZP vou
segregar os blastômeros uns dos outros, utilizando uma solução de PBS por 15’ com
citocalasina/tripsina e incluir os blastômeros. Após esse processo, deve-se pipetar e despipetar
gentilmente com uma pipeta de 5µ e com isso a massa vai se soltando.
Agora vamos incluir cada blasômero no espaço perivitelínico.
5) Reconstrução dos embriões

É realizada a eletrofusão para colocar o núcleo dentro do citoplasma.
Irá colocar o meio de baixa condutividade elétrica (meio Zimmermann), pois a célula pode ser
destruída pelo alto potencial elétrico.
Quando colocar as células no meio, deve-se colocar o meio em corrente alternada (alinha as
membranas) – 600 – 1000kHz ;5 a 6V e por 5 a 10µs e após isso faz a corrente direta (Abre
poros na membrana) 1 a 3 poros com 0,6 a 3,6kV/cm; 30-250µs) fazendo com que o
carioplasto seja colocado entre para o núcleo do citoplasto.
Problemas de viabilidade embrionária, fetal e neonatal

 Mortalidade embrionária
o Alantóide deficiente
 Saúde neonatal
153
o Síndrome do bezerro grande

o Problemas respiratórios
 Disfunção de adrenais
 Infecções umbilicais
 Baixa tolerância a infecções
 Broncopneumonia.
1. Maturação oocitária
2. Ativação
3. Enucleação
4. Preparo da célula doadora
5. Reconstrução de embriões
Biotécnica de MOIFOPA Prof.ª Dr.ª Helena Matos
Folículo: possui oócito e ao redor com células da teca e da granulosa.

Funções: Endócrina (estrógenos, progesterona, inibina, testotesterona)
Exócrina (fatores de crescimento, viabilidade, maturação e ovulação do oócito)
Classificação:
Pré antrais:90%
a) Primordial: são folículos quiescentes, com metabolismo basal, o qual possui o oócito
circundado por células da granulosa pavimentosas;
b) Primário: é o folículo que sofreu ativação (passagem do primordial para primário),
circundado por células cúbicas e com o oócito um pouco maior
c) Secundário: mais de duas camadas de células cúbicas
Antrais: 10%
d) Terciário
e) Pré-ovulatório ou de Graff.
154
Fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos que irão causar proliferação, diferenciação de

células foliculares, atresia folicular, estereoidogenese e angiogênese.
Vaca: 235.000 folículos por ovário/Ovelha 160.000/cabras 35.000.

Apenas 0,1% dos folículos sofrem atresia
Atresia:
- Ocorre em todas as espécies, por degeneração ou apoptose
- Qualquer estádio do desenvolvimento folicular
- Predominante na fase antral terminal, uma vez que esses são dependentes desses de
gonadotrofinas como os folículos pré-antrais.
Objetivos:
Recuperar folículos pré-antrais antes da atresia
Aplicações Copiar do áudio

i. Pesquisa fundamental
ii. Indústria farmacêutica
iii. Medicina humana
iv. Reprodução animal
v. Bem estar animal
Fases da MOIFOPA
A) ISOLAMENTO:
Retirada dos folículos do ovário pode ser utilizado métodos mecânicos e enzimáticos
Mecânico
Tissue chopper/mixer/agulhas, tesouras e fórceps
O tissue chopper, corta os tecidos em 80 micrômetros
Enzimático:
Colagenase
Tx de recuperação:
Tissue chopper é bem alto, quando comparado as outras técnicas.
B) CONSERVAÇÃO DO OVÁRIO PRÉ-MANIPULAÇÃO
Protocolo ideal para conservar o ovário até chegar no laboratório, mantendo a viabilidade
folicular.
A 4ºC posso transportar em até 24h com qualquer meio
A 20ºC posso transportar por 12h em TCM199 e água de coco
A 39ºC Não dá para transportar por mais de 2h e apenas em solução do TCM199 e Salina.
Ovinos e caprinos:
Protocolo padrão -> conservação de pequenos fragmentos ovarianos
Manutenção da viabilidade após cultivo in vitro
Utilizar Meio essencial mínimo (MEM) por até 4h
C) CRIOPRESERVAÇÃO
Melhor utilizar os folículos isolados é melhor do que criopreservar o ovário inteiro, pois a
entrada do criopreservador é melhor
155
D) CULTIVO IN VITRO DE FRAGMENTO

2D ou Bidimensional: Com meio (do fragmento) – in situ
90% dos folículos são primordiais, significando que a maioria está quiescente, devendo
ativar
3D ou Tridimensional: Usa uma base
E) CULTIVO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS
FATORES QUE AFETAM O CULTIVO IN VITRO

 Origem dos ovários
 Transporte dos ovários (meio/tempo/temperatura)
 Sistema de cultivo (bi ou tridimensional
 Composição do meio de cultivo
o MEM + antioxidantes + suplementos protéicos
o Meios pobres deixam os folículos pretos
o Em ovelhas 2 a 3 folículos são ativados
Resumo trangênese:
Retrovírus: São vírus que inserem uma cópia de DNA em seu material genético, funcionando
como um sistema natural de transferência por introdução de DNA em vários tipos de células
de mamíferos. Atuam por deleção das sequências gênicas virais e reposição destas com um ou
mais genes de interesse.
Embriões em estádio de pré-implantação ou oócitos são expostos ao vírus e após serem
infectados são transferidos para receptoras.
Desvantagem: O tamanho da sequência de DNA transferido é limitado e o gene
inserido não é sempre expressado na F2.
Lentívirus: A dispersão dos retr´

Possuem a habilidade de infectar células diferenciadas por completo que não estão em
divisão. Podem ser introduzidas em zigotos para inserção dessas construções no EPV ou para
co-cultivo de zigotos sem zona pelúcida, proporcionando ótimas taxas de incorporação dos
genes no organismo.
Injeção pronuclear: É a microinjeção de DNA clonado pro-núcleo masculino de oócitos

fecundados. A técnica consiste em remover do animal embriões recém fecundados, no estádio
de 1 célula e com auxílio de micromanipuladores, permitindo a contenção e injeção de DNA
exógeno dentro do pro-núcleo. Após a injeção o embrião é transferido para receptoras.
Vantagens: Eficiência relativamente alta.
156
Desvantagem: A técnica não pode ser aplicada em embriões em estádio elevado de

desenvolvimento, falha na detecção do local de injeção e ser uma técnica onerosa.
Células ES: Esta técnica envolve a injeção de células embrionárias em blastocisto expandido
para produzirem embriões híbridos compostos de duas ou mais linhagens celulares distintas,
sendo denomiados quimeras. Células ES também podem transformadas em DNA exógeno,
antes de serem utilizados na produção de embriões quiméricos.
Quando estas células transferidas formam as gônadas e participam da formação de
espermatozódes e oócitos, a progênie produzida por esses indíviduos quiméricos serão
transgênicos.
Vantagens: Células ES podem ser mantidas in vitro por várias gerações, produzindo
números ilimitados de células geneticamente idênticas.
Transferência de genes mediada por SPTZ: A técnica consiste em adicionar DNA a suspensão
de SPTZ para se obter uma concentração de 1 a 25μg/mL, podendo estes serem usados na
PIV / IA.
Vantagem: Simplicidade da técnica;
Desvantagem: Habilidade reduzida do genoma hospedeiro incorporar o DNA
apresentado desta forma.
Introdução de complexos lipossômicos: Lipossomos são estruturas capazes de proteger o

DNA-exógeno incluído das DNAses, sendo o DNA exógeno incluído na célula-alvo pela fusão do
complexo lípideo-DNA com as membranas celulares, transferindo para as outras organelas e
para o núcleo de células cultivadas.
Vantagem: Alta eficiência
Eletroporação: Esta técnica tem sido utilizada para transferir DNA clonado para células e
embriões. As células alvo ou embriões são colocados em uma solução contendo o gene de
interesse, as quais são expostas a pulsos elétricos de alta voltagem e de duração curta,
provocando a quebra temporária da membrana celular, ocorrendo o aparecimento de poros
na membrana, através dos quais o DNA penetra a célula e atinge o núcleo, onde pode ser
incorporado ao genoma
Vantagem: Alto potencial futuramente
Biobalística: Essa técnica consiste em um bombardeamento de partículas para introduzir DNA

em outras células e tecidos.
Vantagem: Habilidade mecânica para atravessar membranas biológicas, independente
da estrutura ou característica da célula-alvo.
Transferência nuclear: Essa técnica consiste em retirar o material genético de uma célula de
um animal de alto valor genético ou em risco de extinção e transferir principalmente para um
oócito maduro e transferir.
Vantagem: Nível reduzido do fator promotor de maturação e ativação antecipada do
citoplasto
Desvantagem: Remover parte do citoplasma do citoplasto.
Injeção de DNA exógeno intra-testicular: Técnica auto-explicativa

Vantagem: Simplicidade
157
158

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Apuntes de clase Ângelo Sena Silva 2018.

Biotecnologia da Reprodução – Aula 21/05/18

- O espermograma faz parte do exame andrológico

Critérios a serem avaliados no exame andrológico:

- @ mochos naturais devem ser descartados.

3) Exame clínico específico:

 Avaliação dos testículos

Avaliar comportamento sexual:

Biotecnologia da Reprodução - Aula 28/05/18

Aumento de volume testicular pode ser: Inflamação, varicocele e cisto.

O encurtamento dos cordões espermáticos pode levar a falhas na termorregulação.

 Exame clínico especial:

Requisitos para colheita de sêmen:

- O ejaculado completo deve ser obtido sem perdas ou contaminações;

- A sobrevivência dos sptz não pode ser comprometida;

- A concentração deve ser semelhante à de ejaculado produzido por monta natural;

- A saúde e a libido do animal devem ser mantidas;

- Métodos de fácil execução.

No Espermograma avalia-se as características físicas do ejaculado, como:

Volume, aspecto, turbilhonamento, motilidade, vigor, concentração e morfologia espermática.

a) Primárias b) Secundárias: c) Terciárias

- Origem intra-gonadal; - Origem extra-gonadal - Após ejaculação;

- Falhas na - Transporte e maturação - Manipulação do sêmen;

Exames complementares (microbiológicos, testes de termo-resistência e sorológicos) podem

Quem está apto/questionável/inaptos

Tecnologia do sêmen animal

1) Vagina artificial (VA):

- Há dois modelos de vagina artificial: Colorado e Francês;

- Animais impossibilitados de realizar salto: Animais com dor ou alterações adquiridas.

- Animais muito ariscos: Fazer sedação antes

- Animais selvagens: Animais não possuem o costume da lida com humanos

3) Manipulação digital (MD):

- Suínos, cães, aves e répteis;

Em aves e répteis deve-se massagear a região da cloaca

Colheita de sêmen: Vagina artificial

1. Termômetro e garrafa térmica 6. Manequim

Para pequenos ruminantes o tubo deve haver graduação acima de 2mL

Preparação da vagina artificial:

Evitar que a vagina molhe.

Apresentar o macho a fêmea

Existem manequins artificiais.

O piso para suínos deve ser emborrachado, na sala de coleta.

Colheita de sêmen: Eletroejaculador

- Contenção física e química

Bovinos não necessita contenção química.

- Higienização do pênis e prepúcio;

Cuidados com sêmen

Evitar incidência do sol e a temperatura do tubo (na EE demora 5 -10’)

(Não faz parte de eletroejaculação – ela apenas começou a falar)

A primeira fração do sêmen é sem SPTZ;

A terceira tem bem pouco SPTZ, há mais plasma do que células;

Se utilizar o sêmen inteiro: dilui-se 1:40

Evita-se a fração gelatinosa do sêmen.

O sêmen de ruminantes não é fracionado.

Colheita de sêmen: Manipulação manual

Avaliação do sêmen: PARÂMETROS

o Consistência - refere a concentração espermática

 Turbilhonamento ou movimento massa;

 Turbilhonamento ou movimento de massa;

o Para congelar: Não aceitar com <80%.

Interpretação da morfologia espermática

o Medusas o Células gigantes;

Anormalidades de peça intermediária e cauda