Princípios de cromatografia

para desenvolvimento de corridas Flash e HPLC Prep

Bart Denoulet | Birke Götz | Peter Näf | Adela Bordeanu | Chantal Ulmer | Csaba Szabados
Business Area Purification - BÜCHI Labortechnik AG - Flawil - Switzerland

Flash VS HPLC Prep Parâmetros a se avaliar para Diferenças entre seletividade

desenvolvimento dos métodos e eficiência
Flash HPLC Prep
Flash ou HPLC Prep

Intensidade do sinal
Tamanho de partícula 15-63 µm 5-15 µm

Diâmetro Interno da Coluna 12-115 mm 10-70 mm Um “prato teórico”

• Definir o tipo de método de • Escolha o método analítico com base
purificação com base no objetivo no método de purificação Dessorção
Vazão 15-250 mL/min 5-100 mL/min
Adsorção
-- Massa grande de amostra: -- Cromatografia Flash: TLC (thin layer
Amostra < 300 g <1g cromatografia Flash chromatograhy) Analito
Tempo, t
Pressão máxima 50 bar 300 bar -- Alta resolução: HPLC Prep -- HPLC Prep: HPLC analítico Seletividade Eficiência
• Verifique a polaridade da amostra • Avalie a otimização da fase estacionária e a Fatores que afetam a seletividade Fatores que afetam a eficiência (expressa
e escolha o solvente móvel (seletividade) com o método analítico (expressos pelo fator de seletividade): pelo número de pratos teóricos):
-- Solvente apolar: fase normal • Aumente a escala do método de purificação • Fase estacionária • Tamanho de partículo
-- Solvente polar: fase reservada • Otimize a resolução (eficiência) • Fase móvel • Fluxo
Desenv. de método via TLC • Quantidade de amostra

1. Otimize a seletividade A seletividade tem o maior impacto na resolução. A eficiência é mais facilmente
• Teste os solventes mais comuns Solventes mais comuns modificada
• Para aplicações complexas, selecione vários solventes do triângulo de Snyder
e Kirkland (veja a figura à direita) Fase normal (sílica): Fase reserva (C18 ligado à sílica):
• Ajuste a retenção através da polaridade misturando solventes mais fortes hexano, acetato de etila, água, etanol, metanol, acetonitrila
e mais fracos diclorometano, metanol Desenv. de método via HPLC
analítico
• Ajuste em:
-- Rf entre 0.2 e 0.5 para o composto de interesse
-- Boa separação entre os compostos
1. Otimize a seletividade
fase móvel
Distância percorrida Triângulo de Snyder e Kirkland • Faça algumas corridas de HPLC analítico sob condições padrões
distância • Ajuste a retenção via polaridade do solvente usando gradientes com solventes
pela fase móvel, Rf
I Éter isopropílico V Diclorometano fracos e fortes
D0 distância do soluto
Rf = Éter dietílico 1,2-Dicloroetano • Busque a separação dos picos pela linha base com a maior quantidade
distância da fase móvel Éter trietilamina de amostra e menor tempo de corrida
D1
VI Dioxano
D2
D1 II Propanol Acetato de etila 2. Aumente a escala para uma coluna de preparação HPLC
D3 Rf =
posição inicial D0 Etanol Acetona • Escolha uma coluna com o mesmo comprimento que a coluna analítica
Metanol Acetonitrila • Selecione o diâmetro da coluna preparativa com base na quantidade de amostra necessária:
Base Carregamento a = Carregamento b x (Diâm. a / Diâm b)2 x (Compr. a / Compr. b)
2. Aumente sua escala para cartucho Flash III Tetrahidrofurano VII Tolueno
• Selecione o tamanho do cartucho baseado na quantidade de amostra necessária Piridina Benzeno Selecione o fluxo utilizando a seguinte equação: a = coluna analítica
• Use cartucho de máx. 120g para otimização durante execução das corridas iniciais Dimetilformamida Fluxo a = Fluxo b x (Diâmetro a / Diâmetro b)2 b = coluna preparativa
• Calcule o método e o gradiente com a seguinte equação: CV = 1 / Rf VIII Clorofórmio
IV Ácido acético • Aplique o mesmo perfil de gradiente usado para a corrida analítica
Formami II I
CV Geral (volume da coluna) 3. Otimize a eficiência via tamanho de partícula, carregamento de
amostra e fluxo
Equilibração 3-6
IV III
Injeção de volume máx 0.1

Separação 3-6
VIII Manutenção da coluna HPLC
VI
Lavagem (solvente forte) 2-3 V Prep e manuseio ideal
VII
• Verifique a taxa de fluxo padrão e o volume da coluna (CV) do cartucho selecionado • Use pré-colunas para prolongar a vida útil da coluna
• Verifique a solubilidade da amostra na condição inicial (solvente fraco); em caso Ácido D ip o lo • Armazene os cartuchos da seguinte forma:
de problemas de solubilidade, utilize o acessório de carregamento sólido -- Fase Normal: 100% isopropanol ou hexano
-- Fase Reversa: 80/20% orgânico / água
3. Otimize a eficiência de acordo com tamanho de partícula, • Evite a secage da coluna
a massa de amostra e o fluxo

Manutenção do cartucho Flash Qual é o fluxo otimizado?

e uso otimizado • A taxa de fluxo ideal oferece a mais alta eficiência 1000
50µm 30 µm
• Quanto menor o tamanho da partícula, maior o fluxo 900
H*= altura do “prato

• Não exceda o limite máximo de pressão • O fluxo prático é, geralmente, muito maior do que o ideal e a perda de eficiência, 800

• Em caso de reutilização (consulte a tabela neste ponto, ainda é aceitável 700

forma: abaixo), armazene o cartucho • Operar acima ou abaixo do fluxo ideal tem diferentes efeitos: 600
25 µm
500
da seguinte forma:
400
-- Fase Normal: 100% isopropanol ou hexano Baixa eficiência Alta pressão 15 µm
teórico”

300
-- Fase Reserva: 80/20% orgânico / água Longo tempo de análise Baixa eficiência
200
• Evite secar o cartucho
100
• Não use 100% de água com material C18 10 µm
0
(colapso de fase) 95/5% water/ 100% water Fluxo ideal 0 20 40 60
organic solvent Fluxo (mL/min)
• Quanto menor o tamanho das partículas, menor o efeito do fluxo na eficiência * Quanto menores as partículas, menor o efeito da taxa de fluxo na eficiência

Tamanho de partícula e controle de pressão FlashPure Scout

• Quanto menor o tamanho de Solvent% ELSD UV1 UV2 UV3 Solvent% ELSD UV1 UV2 UV3 A contrapressão gerada durante Descubra o seu cartucho ideal
partícula em um cartucho ou coluna, 663 0.50 359 0.50 uma corrida é influenciada por vários
maior a área superficial total e o 530 0.40 287 0.40 parâmetros • Escolha o cartucho FlashPure ideal
nFL
∆P =
ELSD (mV)

215 0.30
ELSD (mV)

número de “pratos teóricos” 398 0.30 de acordo com suas necessidades

AB 143
AB
0.20
K0 ∏r2 dD2
• Diminuir o tamanho das partículas é 265 0.20 • Saiba mais dos parâmetros para
uma abordagem fácil e rápida para 133 AB 0.10 71 AB 0.10 ∆P: mudança de pressão(bar) dp: tamanho da partícula (μm) melhorar sua resolulção
F: fluxo (mL/min) r: raio da coluna(mm)
aumentar a resolução, mas deve 0 0.00 -1 0.00 L: comprimento da n: viscosidade do solvente • Tenha todos os detalhes técnicos
ser aplicada com cuidado, pois a 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 coluna(mm) (cP) (1 para água,
do seu cartucho FlashPure e otimize
K: permeabilidade 2 paraágua/MeOH
contrapressão também aumenta Time (min) Time (min) específica da coluna 50/50) seu método
O tamanho das partículas, assim como o raio, • Receba facilmente uma cotação
Silica, tamanho de partícula 50µm Silica, tamanho de partícula 15µm são os fatores que mais influenciam a pressão para os cartuchos selecionados flashpurescout.buchi.com

Tudo sobre injeção de amostras

Injeção de líquidos Injeção de sólidos Procedimento para preparar uma amostra sólida Capacidades de carregamento
É um método rápido mas com é usado para amostras que são apenas • Dissolver a amostra bruta em um solvente adequado • Sobrecarga de amostra diminui a eficiência • Sílica (Fase Normal) tem uma capacidade de
resolução reduzida solúveis em solventes fortes (≠ fase móvel • Incubar por alguns minutos em um banho de ultrassom • Aplicações Flash permitem o (carregamento) de amostra maior que C18 (Fase Reversa):
inicial) ou para melhorar a resolução; para melhorar a solubilidade carregamento de mais amostras do que
método bastante lento • Se necessário, filtre a mistura para se livrar do material o HPLC Prep Aplicação Carregamento máx. comum
não dissolvido -- Alto carregamento desejado: Flash Flash Fase Normal 10-30%
Solvente Sílica
AMOSTRA AMOSTRA • Adicione sílica a mistura (3-5 vezes o peso da amostra bruta) -- Alta resolução desejada: HPLC Prep
LÍQUIDA SÓLIDA • Remova o solvente completamente por evaporação; Flash Fase Reversa 2.5-5%
assegure-se que a mistura sólida preparada está seca HPLC Prep Fase Normal 15%
• Carregue a amostra sólida (mistura de amostra bruta e sílica) em
Amostra Amostra um cartucho vazio e coloque-a antes do cartucho de purificação HPLC Prep  Fase Reversa  1%

Fases móveis e estacionárias mais usadas em Flash e HPLC Prep

Nome Tipo de fase Propriedades Ideal para separar Reutilização Sistema de solvente mais usado
- Alta superfície polar - Hexano / acetato de etila
Sílica Fase Normal - Compostos polares ou polaridade média Único uso
- Fase polar mais usada - Diclorometano / metanol
- Água / metanol
- Superfície apolar - Compostos apolares
C18 Fase Reversa Cartucho reutilizável - Água / acetonitrila
- Fase apolar mais usada - Proteínas / Peptídeos < 2000Da
- Água / etánol
- Água / metanol
- Compostos apolares
C4 Fase Reversa - Superfície apolar Cartucho reutilizável - Água / etanol
- Proteínas / Peptídeos < 2000Da
- Água / acetonitrila
- Compostos de polaridade média
Amino Fase Normal & Reversa - Superfície polar média Cartucho reutilizável Veja C18 e sílica
- Carboidratos, Heterociclos contendo nitrogênio, aminas
- Compostos de polaridade média
Diol Fase Normal & Reversa - Superfície polar baixa - Móleculas polares Cartucho reutilizável Veja C18 e sílica
- Lipídios
- Compostos polares ou polaridade média
- Superfície altamente polar - Hexano / acetato de etila
Alumina Fase Normal - Compostos sensíveis à ácidos Único uso
- Disponível como tipos neutros, ácidos e básicos - Diclorometano / metanol
- Para casos em que o uso de modificante de solventes deve ser evitado

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