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Graduação em Biotecnologias
Manipulação de Gametas e Embriões
Coleta, Classificação e
Maturação in vitro de Oócitos
Priscila M. M. de Leon
Profa, Dra., Médica Veterinária
Oócito
Conceito:
• Oócitos são células germinativas femininas resultantes do
processo determinado Oogênese.
• Nomenclaturas: Oócito ou Ovócito
• Coroa Radiada
• Zona Pelúcida
• Membrana Plasmática
• Citoplasma
• Núcleo
• Nucléolo
Oócitos Equinos
Oogênese
• Oogênese inicia-se na vida fetal com a divisão mitótica das oogonias;
Nos humanos:
Fecundação Óvulo
Foliculogênese Humana
A: Desenvolvimento de
Folículos
B: Níveis Hormonais
Antro Folicular
Coroa Radiada
Zona Pelúcida
Oócito
Maturação Oocitária
Vesícula Germinativa
1. Crescimento Oocitário
2. Capacitação Oocitária
3. Maturação Oocitária
b. Maturação Nuclear
4. Ativação do Oócito
1. Crescimento Oocitário
• Crescimento Oocitário se inicia com o Crescimento
Folicular;
• Modificações Estruturais
• Abrange 2 estágios:
Maturação Citoplasmática
Maturação Nuclear
3.1. Maturação Nuclear
• Reversão do 1º bloqueio meiótico (mantido pela alta de
cAMP produzido pelas céls. da granulosa)
Quebra de
Vesícula Vesícula
Germinativa Germinativa
Metáfase I Metáfase II
Tremoleda et al., 2006.
Reguladores da Maturação do Oócito
VG Pró-M MI
• Microtúbulos
MI AI TI
• Microfilamentos
• Cromatina
• http://www.youtube.com/watch?v=3-uocDm4SNg
4. Ativação do Oócito
• In vivo:
– Aspiração Guiada Por Ultra Som (OPU)
– Aspiração Folicular Cirúrgica
– Aspiração Transcutânea pelo flanco
• In vitro:
– Aspiração Folicular
– Slicing (Técnica de Fatiamento)
– Scraping
Aspiração Guiada por Ultra Som (OPU)
• Bomba de vácuo;
• Tranquilização/sedação;
• http://www.youtube.com/watch?v=Wm4Khn6MVbc&feature=related
Coleta de Oócitos in vitro
Aspiração Folicular
Slicing (Técnica de Fatiamento)
Scraping
• Objetivos:
– Avanços científicos;
– Controle em clínicas de reprodução assistida;
Coleta de Oócitos in vitro - Scraping
• Aspecto do Citoplasma:
Oócitos de camundongos apresentam ooplasma claro e quase
ausente de granulações;
Oócitos equinos, suínos e caninos observa-se ooplasma
escuro e com granulações;
* Variação devido a quantidade de lipídeo intracelular e sua
distribuição.
CCO Bovino CCO Equino
CCO Murino CCO Suíno
Classificação dos Complexos Cumulus Oócito
• Grau I:
– Mais de 3 camadas de céls. do cumulus;
– Cumulus compacto;
– Ooplasma com granulações finas e homogêneas;
– Ooplasma preenchendo todo o interior da zona pelúcida;
• Grau II:
– 3, 2 ou 1 camada de células do cumulus;
– Cumulus compacto;
– Granulações heterogeneamente distribuídas
(concentradas em uma lado ou na periferia);
– Ooplasma preenche todo o interior da zona pelúcida;
Classificação dos Complexos Cumulus Oócito
• Grau III:
– Cumulus parcialmente expandido;
– Ooplasma contraído (espaço entre a zona pelúcida e o
ooplasma);
– Manchas escuras no ooplasma;
– Degeneração das céls. do cumulus em grau leve;
• Grau IV:
– Cumulus expandido;
– Oócitos Desnudos;
– Ooplasma muito escuro;
– Sinais de degeneração (vacúolos, inclusões
citoplasmáticas, degeneração das céls. do cumulus);
Classificação quanto ao Estágio de Maturação
Classificação de oócitos
Grau I Grau II Grau IV
Cumulus Cumulus
Compacto Expandido
Oócito humano em Metáfase II apresentando:
Granulações Citoplasmáticas
Oócito humano em Metáfase II apresentando:
Fragmentação do Corpúsculo Polar
Oócito humano em Metáfase II apresentando:
Vacúolo no Ooplasma
Oócito humano em Metáfase II apresentando:
Inclusões Citoplasmáticas
Maturação In Vitro - MIV
• Bovinos:
– Taxa de maturação entre 80 e 90%
– 20 a 24h de incubação a 38,5°C
• Caprinos e Ovinos:
– Taxa de maturação caprinos é 50%
– Taxa de maturação ovinos 35 – 40%
– 27h de incubação a 38,5°C a 39°C
• Suínos:
– Taxa de maturação 60-70%
– 48h de incubação a 38,5°C
• Equinos:
– Taxa de maturação entre 40 e 60%;
– 36 a 40h de incubação a 38,7°C
Maturação In Vitro - MIV
• Maioria dos Protocolos:
– Meio de cultivo de tecidos 199 (TCM-199);
– Suplementação com Soro Fetal Bovino (SFB);
– Antibióticos (Gentamicina e Penicilina ou Sulfato de Amicacina);
– Adição de Hormônios :
• Estradiol
• FSH e LH
– Fatores de Crescimento e Estimulantes (GH, IGF-I, IL-1β);
– Fluído Folicular ou Soro de Vaca em Estro;
– Adição de Albumina Sérica Bovina (BSA);
– Compostos Antoxidantes (Cisteamina);
Reprogramação Celular;
Adição de Cisteamina ao meio de MIV;
Síntese de Glutationa (GSH);
Estresse Oxidativo;
Aumento da taxa de maturação in vitro;