Mestrado em Inovação e Qualidade na Produção Alimentar

2022/2023

MICROBIOLOGIA AVANÇADA
______________________________________________________________________________________

Aula Prática – Deteção de genes enterotoxigénicos de Staphylococcus coagulase positiva

por Multiplex PCR
Maria Manuela Goulão, Cristina Santos Pintado
_________________________________________________________________________________

1. Introdução
As bactérias do grupo Staphylococcus coagulase positiva (Staphylococcus aureus, Staphylococcus
hyicus e Staphylococcus intermedius) são ubíquas no ambiente podendo ser disseminadas a partir de
hospedeiros humanos e animais (Furtado et al., 2014). São pequenos cocos Gram-positivos,
normalmente associados em cacho, imóveis, não esporulados e pertencem à família Staphylococcaceae.
Várias espécies de Staphylococcus produzem enterotoxinas estafilocócicas (SE; staphylococcal
enterotoxins), principalmente espécies produtoras da enzima coagulase, como é o caso de
Staphylococcus aureus. Este é o principal agente de intoxicação alimentar estafilocócica (Hennekinne et
al., 2010). Uma importante fonte de contaminação são os manipuladores de alimentos portadores de
estirpes enterotoxigénicas no trato nasofaríngeo ou nas mãos (Furtado et al., 2014). O consumo de
alimentos contaminados de origem animal constitui igualmente uma importante fonte de contaminação
(EFSA, 2014).
As enterotoxinas estafilocócicas são proteínas extracelulares de baixo peso molecular,
hidrossolúveis e resistentes à ação de enzimas proteolíticas do sistema digestivo, permanecendo ativas
após a ingestão. Outra característica importante é a sua termoestabilidade, sendo capazes de resistir a
tratamentos térmicos como a pasteurização e a ultrapasteurização (Rahimi e Forough, 2013).
Apesar de atualmente estarem identificados mais de 20 tipos distintos de enterotoxinas
estafilocócicas (Furtado et al., 2014), sabe-se que 95% dos surtos são causados pelas enterotoxinas SAA,
SEB, SEC, SED e SEE (Zoche et al., 2009).
O gene femA tem sido explorado como marcador específico de Staphylococcus aureus em testes de
Biologia Molecular. A amplificação do gene femA ou parte dele por PCR constitui uma ferramenta útil na
diferenciação de espécies de Staphylococcus podendo ser uma alternativa rápida e segura para a
identificação desta bactéria (Mehrotra et al., 2000).
Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a deteção de enterotoxinas. O método que irá ser
exemplificado nesta aula prática consiste num ensaio Multiplex PCR que permitirá avaliar o DNA
bacteriano quanto à presença de fragmentos do gene femA e de genes que codificam para as
enterotoxinas estafilocócicas SEA, SEB, SEC, SED e SEE (respetivamente os genes sea, seb, sec, sed, see).

2. Material e Métodos
2.1. Culturas bacterianas
Vão ser usadas quinze culturas de Staphylococcus coagulase positiva (Tabela 1), a maioria das
quais isoladas das fossas nasais de alunos que frequentaram as aulas em 2022/2023. Foram também
usadas as seguintes culturas de referência (Tabela 2):
- Staphylococcus aureus ATCC 29213 (gene sea, que codifica para a enterotoxina estafilocócica A)
- Staphylococcus aureus EURL 11CEB126STA (gene seb, que codifica para a enterotoxina estafilocócica B)
- Staphylococcus aureus EURL 12CEB583STA (gene sec, que codifica para a enterotoxina estafilocócica C)
- Staphylococcus aureus EURL 12CEB502STA (gene sed e ser, que codificam para, respetivamente, a
enterotoxina estafilocócica D e R)
- Staphylococcus aureus EURL 09CEB329STA (gene see, que codifica para a enterotoxina estafilocócica E).

Tabela 1. Culturas de Staphylococcus coagulase positiva a usar na aula prática e posição que vão ocupar no
gel de agarose.
Posição Refª Origem da amostra Culturas Presença de genes
1 --- ----- Marcador --------
2 1 FN aluna R_EV Staphylococcus cogulase positiva, 2C, 2.11.2022 ?
3 2 Boca cão D_EV Staphylococcus cogulase positiva, 3NC, 2.11.2022 ?
4 3 FN aluno E_EV Staphylococcus cogulase positiva, 6C, 2.11.2022 ?
5 4 FN aluna PG_EV Staphylococcus cogulase positiva, 1C, 2.11.2022 ?
6 5 FN aluna MJ_EV Staphylococcus cogulase positiva, 3C, 2.11.2022 ?
7 6 FN aluna BS_EV Staphylococcus cogulase positiva, 10C, 2.11.2022 ?
8 7 FN aluna BA_EV Staphylococcus cogulase positiva, 11C, 2.11.2022 ?
9 8 FN aluna DS_CV Staphylococcus cogulase positiva, col±C ?
10 9 FN aluna N_CV Staphylococcus cogulase positiva, col C ?
11 --- ----- Marcador ---------
12 10 FN aluno D_CV Staphylococcus cogulase positiva, col NC ?
13 11 FN aluna JR_CV Staphylococcus cogulase positiva, col NC ?
14 12 FN aluna Ca_MIQPA Staphylococcus coagulase positiva, col NC ?
15 13 FN aluno Cl_MIQPA Staphylococcus coagulase positiva, col C ?
16 14 FN aluno JR_MIQPA Staphylococcus coagulase positiva, col C ?
17 15 FN aluna S_MIQPA Staphylococcus coagulase positiva, col C ?
18 --- ----- Controlo negativo ---------
19 --- ----- Marcador ---------
20 --- ----- --------- ---------

Tabela 2. Culturas de Staphylococcus coagulase positiva usadas como controlos.

Culturas Presença de genes
Staphylococcus aureus ATCC 29213 sea e femA
Staph. aureus EURL 11CEB126STA seb e femA
Staph. aureus EURL 12CEB583STA sec e femA
Staph. aureus EURL 12CEB502STA sed, ser e femA
Staph. aureus EURL 09CEB329STA see e femA
 O protocolo de PCR Multiplex aqui descrito é baseado em Mehrotra et al. (2000) e no protocolo do
Laboratório de Referência Europeu para estafilococos coagulase positiva (AFSSA, 2009), com algumas
alterações.

2.2. Extração do DNA

A extração de DNA das células de Staphylococcus coagulase positiva é baseada em Doumith et al.
(2004), encontrando-se no Anexo I a descrição do procedimento.
A partir de colónias em meio sólido recolher, com ansa estéril, duas a três colónias para um
microtubo, onde previamente foi colocado 50μl de uma solução a 0,25 de dodecil sulfato de sódio em
0,05N NaOH estéril (Anexo II) e emulsionar. Colocar o microtubo em banho-Maria a 99ºC, durante 15
minutos, adicionar 100μl de água ultrapura estéril e homogeneizar. Por fim, guardar as amostras de
DNA a -20ºC até ao momento da sua utilização.

2.3. Amplificação por Reacção de Polimerização em Cadeia (Polimerase Chain Reaction

– PCR) Multiplex
Após a extração de DNA dos isolados de Staphylococcus coagulase positiva proceder à reação de
amplificação do DNA e à separação dos produtos amplificados por eletroforese em gel de agarose.
As características dos seis primers a usar na reação de amplificação encontram-se na tabela 2.

Tabela 2. Primers, tamanho dos produtos de amplificação e especificidade.

Gene alvo Primer Sequência do Primer (5' – 3') Produtos(bp) Especificidade Conc. final

sea GSEAR-1 GGTTATCAATGTGCGGGTGG 102 Enterotoxina 0,4 M

GSEAR-2 CGGCACTTTTTTCTCTTCGG Estafilocócica A
(SEA)
seb GSEBR-1 GTATGGTGGTGTAACTGAGC 164 Enterotoxina 0,4 M
GSEBR-2 CCAAATAGTTGACGAGTTAGG Estafilocócica B
(SEB)
sec GSECR-1 AGATGAAGTAGTTGATGTGTATGG 451 Enterotoxina 0,4 M
GSECR-2 CACACTTTTAGAATCAACCG Estafilocócica C (SEC)
sed GSEDR-1 CCAATAATAGGAGAAAATAAAAG 278 Enterotoxina 0,8 M
GSEDR-2 ATTGGTATTTTTTTTCGTTC Estafilocócica D
(SED)
see GSEER-1 AGGTTTTTTCACAGGTCCATCC 209 Enterotoxina 0,4 M
GSEER-2 CTTTTTTTTCTTCGGGTCAATC Estafilocócica E (SEE)
femA GFEMAR-1 AAAAAAGCACATAACAAGCG 132 Staphylococcus 0,4 M
GFEMAR-2 GATAAAGAAGAAACCAGCAG aureus
Fonte: Adaptado de Mehrotra et al. (2000)

As reações de amplificação ocorrem num termociclador, em tubos de 0,2ml PuReTaq Ready-to-

Go PCR Beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, United Kingdom), num volume final de 25 l, contendo
1,5l de amostra de DNA, 3l da mistura de primers e 20,5l de água ultrapura isenta de nucleases
(Gibco®).
Cada PuReTaq Ready-to-Go PCR Beads contém estabilizadores, BSA, dATP, dCTP, dGTP, dTTP,
2,5 unidades de pureTaq DNA polymerase e tampão de reação. Quando uma pérola (bead) é
reconstituída num volume final de 25l, a concentração de cada dNTP é 200M em 10mM Tris-HCl (pH
9,0 à temperatura ambiente), 50mM KCl e 1,5mM MgCl2.
Usar um controlo negativo, o qual consiste na mistura de amplificação sem DNA. Para perfazer
os 25 μl substituir a quantidade de DNA (1,5μl) por água ultra pura isenta de nucleases.
Submeter a mistura obtida a um processo de desnaturação inicial a 94 ºC durante 5 minutos,
seguida de 35 ciclos sucessivos com a seguinte sequência: 2 minutos a 94 ºC para a desnaturação, 2
minutos a 54,6 ºC para a ligação dos primers e 1 minuto a 72 ºC para a amplificação. Segue-se um ciclo
final de 7 minutos a 72 ºC. O passo final é o arrefecimento a 4ºC (Tabela 3). Seleccionar, no
termociclador, o programa ESTAFILO, na directoria 9, programa 2. A fase de amplificação tem uma
duração de 3 horas, 29 minutos e 59 segundos.

Tabela 3. Resumo das etapas que ocorrem no termociclador na fase de amplificação

Etapas Temperatura oC Duração (min)

1 Desnaturação inicial 94 5
2 Desnaturação 94 2
35 ciclos 3 Ligação dos primers 54,6 2
4 Amplificação 72 1
5 Ciclo final 72 7
6 Conservação 4 ----------
Temperatura da tampa: 105 ºC

2.4. Separação dos fragmentos de DNA por electroforese em gel de agarose

Efectuar a separação dos produtos do PCR de cada uma das amostras por eletroforese em gel de
agarose (Nzytech, refª MB02702) a 2% previamente preparado conforme descrito no Anexo III. Após
preparação, verter o gel no tabuleiro da tina de eletroforese (Bio-Rad Wide mini subcell GT) (Fig. 1), na
qual se colocou previamente o pente adequado (de 20 poços).
 Figura 1. Deposição do gel no tabuleiro da tina de eletroforese.
Fonte: Goulão (2010)

Carregar as amostras no gel (Fig. 2), de acordo com a seguinte sequência: no primeiro poço, no
poço do meio e no último poço colocar 5 μl de marcador (50 ng/μl) (50 bp NZYDNA Ladder IV; Nzytech,
refª MB05802). Nos restantes poços colocar 5 μl da mistura constituída pela amostra de DNA
amplificada (3 μl) adicionada da solução de deposição, gel loading buffer (Sigma-Aldrich) (2 μl),
destinando-se esta a conferir peso à amostra, mantendo-a dentro do poço do gel.
Realizar a corrida eletroforética numa tina de eletroforese (Bio-Rrad Wide mini subcell GT), com
tampão TBE 1x (Nzytech, refªMB11501) (Anexo II), durante aproximadamente 1 hora e 45 minutos a
uma voltagem de 90 V (Fig. 2b).

a) b)

Figura 2. Carregamento das amostras no gel (à esquerda); Tina de eletroforese ligada à fonte de alimentação(à
direita).
Fonte: Goulão (2010)

Colocar o gel num banho com brometo de etídio (0,5μg/ml) (Anexo V), durante 20 minutos,
observar por transiluminação UV (Fig. 3) e fotografar com câmara digital (Kodack DC 290) devidamente
adaptada, em formato TIFF.
 Figura 3. Transiluminador (UViTEC) com sistema de captação de imagem (BioRad™)
Fonte: Goulão (2010)

Analisar as imagens obtidas e identificar a presença dos genes enterotoxigénicos e do gene femA
nos isolados analisados, em função dos produtos de amplificação obtidos (Fig. 4).

Figura 4- Separação eletroforética dos fragmentos dos genes femA, sea, seb, sec, sed e see, após amplificação por
PCR Multiplex do DNA das culturas de referência Staph. aureus ATCC 29213 (coluna 1), Staph. aureus EURL
11CEB126STA (coluna 2), Staph. aureus EURL 12CEB583STA (coluna 3), Staph. aureus EURL 12CEB502STA
(coluna 4) e Staph. aureus EURL 09CEB329STA (coluna 5). M – Marcador de 50bp.
Fonte: Ferreira (2014)
3. Referências Bibliográficas

AFSSA. (2009). Detection of genes encoding staphylococcal enterotoxins Multiplex PCR for sea to see
and ser – Method of the CRL for coagulase oositive staphylococci, including Staphylococcus aureus.
(Version 1). Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments, UE Community Reference Laboratory
for Coagulase Positive Staphylococci.

Doumith, M., Buchrieser, C., Glaser, P., Jacquet, C., Martin, P. (2004). Differentiation of the major Listeria
monocytogenes serovars by multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology. 42 (8): 3819-22.

EFSA. 2014. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents
and Food-borne Outbreaks in 2012. European Food Safety Authority. EFSA Journal 12(2): 3547.
Ferreira, J. (2014). Genes enterotoxigénicos e resistência a antibióticos em isolados de Staphylococcus
coagulase positiva de origem alimentar. Tese de Mestrado em Inovação e Qualidade na Produção
Alimentar. Escola Superior Agrária do Instituto Politécnico de Castelo Branco.

Furtado, R., Coelho, A., Correia, C., Saraiva, M., Cunha, I. e Calhau, M.. (2014). Enterotoxinas
estafilocócicas em géneros alimentícios. Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge. Boletim
Epidemiológico 13.

Goulão, M.M. (2010).Caracterização molecular de Listeria monocytogenes ser. 4b por Amplified

Fragment Length Polymorphism “AFLP”. Tese de Mestrado em Engenharia Zootécnica. Universidade dos
Açores.
Hennekinne, J., Ostyn, A., Guillier, F., Herbin, S., Prufer, A. e Dragacci, S., (2010). Article How Should
Staphylococcal Food Poisoning Outbreaks Be Characterized?.Toxins 2:2106-2116.

Mehrotra, M., Wang, G. e Johnson, W. M.. (2000). Multiplex PCR for detection of Genes for Staphylococcus
aureus Enterotoxins, Exfoliative Toxins, Toxic Shock Syndrome Toxin 1, and Methicillin Resistance.
Journal of Clinical Microbiology 38(3): 1032-1035.

Rahimi, E. e Forough, A.. (2013). Presence of enterotoxigenic Staphylococcus aureus in cow, camel,
sheep, goat, and buffalo bulk tank milk. Veterinarski Arhiv. 83 (1): 23 – 30.

Zocche, F., França, R. C., Guimarães Aleixo, J. A., Moreira, A. N. e Silva, W. P.. (2009). PCR Multiplex para
detecção de Staphylococcus aureus enterotoxigênicos isolados de alimentos de origem animal no sul do
Rio Grande do Sul, Brasil. Interciencia. 34 (7): 487-491.
ANEXO I - Extração de DNA bacteriano segundo Doumith et al. (2004)
A partir de colónias em meio sólido (Agar Columbia ou TSYEA):

Recolher com ansa, 2 a 3 colónias para um microtubo, onde previamente foi colocado 50µL de uma
solução a 0,25% de Dodecil sulfato de sódio em 0,05N NaOH estéril e emulsionar

Colocar o microtubo em banho a 99oC, durante 15minutos

Adicionar 100 µl de água ultra-pura estéril e homogeneizar

Armazenar os tubos a -20°C até ao momento da sua utilização

Preparação da solução de lise - Dodecil sulfato de sódio a 0,25% em 0,05N NaOH estéril:

Partindo de uma concentração de NaOH a 0,1 N e, recorrendo à equação das diluções:

Ci  Vi = Cf  Vf

Para obter por ex. 250 ml de solução de NaOH a 0,05N temos:

Cf  Vf
Vi = onde : (Ci = 0,1N ) (Ci ) : Concentração inicial
Ci
(Cf = 0,05 N ) (Cf ) : Concentração final
(Vf = 250ml ) (Vi ) : Volume inicial
(Vf ) : Volume final
0,05N  250ml 12,5
Vi = = = 125ml Quantidade de NaOH a 0,1N que é necessário
0,1N 0,1
medir, para um balão volumétrico de 250ml, perfazendo com H2O destilada até à marca.

Para preparar por ex. 100ml da solução de Dodecil sulfato de sódio a 0,25% em 0,05N NaOH:

Pesa-se 0,25g de Dodecil sulfato de sódio e adiciona-se a 100ml de NaOH a 0,05 N, esterilizando-se
a seguir por filtração.
ANEXO II- Preparação da solução tampão TBE 10x

Características:
- TBE buffer 10X, pH 8,3- Tampão de eletroforese
- Marca Nzytech, refª MB11501

Partindo de uma solução concentrada, TBE 10x e recorrendo à equação das diluições
Ci  Vi = Cf  Vf , temos:
Por exemplo, para preparar 1litro de TBE1x

Cf  Vf
Vi = onde : (Ci = 10 ) (Ci ) : Concentração inicial
Ci
(Cf = 1) (Cf ) : Concentração final
(Vf = 1000ml ) (Vi ) : Volume inicial
(Vf ) : Volume final
1  1000 ml
Vi = = 100ml
10

Assim, para preparar 1litro de solução TBE 1x, mede-se 100 ml da solução concentrada TBE 10x e perfaz-se,
num balão volumétrico, até aos 1000ml com água destilada.
ANEXO III - Preparação do gel de agarose

Características da agarose:
Agarose da marca Nzytech, refª MB02702.

O gel é preparado em função da espessura, da percentagem de agarose que se pretende usar e do tipo
de tina.
Se for usada a Tina Bio-Rad (Wide Mini-Sub Cell GT) podem tomar-se como referência os volumes
de tampão necessários para se obter uma determinada espessura, como pode ser visto no quadro seguinte:

Espessura do gel Volume de tampão (ml) Volume da tina (ml) Dimensões do gel
(mm) (mm)
2,5 30
5,0 60
650-900 150 x 100
7,5 90
10 120

Para obter um gel a 2,0% e com espessura de 5mm, pesar 1,2 g de agarose e adicionar 60ml de tampão
TBE1x.

Modo de preparação:
Adicionada a agarose ao tampão, num frasco apropriado, leva-se ao microondas até dissolver
completamente, ou seja até ficar transparente, tendo o cuidado de não deixar ferver, para evitar a saída do
recipiente.
Deixar arrefecer à temperatura ambiente, nunca devendo arrefecer-se bruscamente à torneira. Depois
de arrefecido, à volta dos 50oC, verte-se no tabuleiro de preparação do gel (onde previamente foi colocado um
pente, para formar os poços, que serão cheios com as amostras de DNA) e deixa-se solidificar.
Após solidificação da agarose retira-se o pente e o tabuleiro é colocado na tina de electroforese; cobre-
se de seguida com a solução tampão TBE 1x , para que a agarose não desidrate. O gel de agarose, tal como os
poços, devem ficar completamente submersos.

Nota: Deverá ter-se em conta o tipo de agarose que se escolhe, pois a qualidade do trabalho e a velocidade da
corrida de electroforese podem ser influenciados pelas características da agarose.
ANEXO IV- Preparação do marcador
O marcador a usar deverá garantir uma abrangência dos fragmentos espectáveis, para implementação
do método descrito neste protocolo usou-se o marcador de 50bp da Nzytech, (NZYDNA Ladder VI, refª
MB08901). Este marcador já tem incorporado o gel loading.
O marcador é usado com uma concentração de 50ng/µl (solução de trabalho). Para a sua preparação
recorremos à equação das diluições: Ci  Vi = Cf  Vf . Por exemplo, se quisermos preparar uma solução de
trabalho de 100 µl de marcador com uma concentração de 50ng/µl teremos:

Cf  Vf
Vi = onde : (Ci = 1g / l  1000 ng / l ) (Ci ) : Concentração inicial
Ci
(Cf = 50ng / l ) (Cf ) : Concentração final
(Vf = 100 l ) (Vi ) : Volume inicial
(Vf ) : Volume final

50ng / l  100l 5000 l

Vi = = = 5l
1000ng / l 1000

Então, para obter 100 µl de marcador, com uma concentração de 50ng/ µl, pipeta-se 5µl (com
concentração inicial de 1µg/µl) e adiciona-se 95 µl de água destilada ultra pura, mas como o marcador vai
ser depositado no gel de agarose tem que ter peso, para que não saia dos poços. No caso em que o marcador
não vem com o gel loading incorporado, parte do volume de 95µl terá que ser substituído por gel loading
(solução constituída à base de açúcar, para conferir peso, e um indicador, azul de bromofenol, que serve para
visualizar a corrida de eletroforese). Relativamente ao modo de uso do gel loading, seguem-se as instruções
do fabricante. Por exemplo, a marca Sigma recomenda entre 1 µl a 4 µl por cada 5 µl de amostra DNA.

No nosso caso foi usada uma proporção de 1/5, assim:

1µl (gel loading) __________ 5µl (DNA)
x __________ 100µl (DNA marcador)

X= 20 µl de gel loading
Assim temos:
5 µl de DNA do marcador
Adiciona-se a mistura por pipetagem,
20 µl de gel loading num microtubo de 1,5 ml
75 µl de água destilada ultra pura
_________________
100 µl de Marcador com uma concentração de 50ng/µl
ANEXO V - Preparação do brometo de etídio (et Br)

Características:
Reagente tóxico por contacto (mutagénico), refª: 17- 1328-01, marca Plusone; concentração: 10mg/ml
(solução stock). A solução de brometo de etídio é usada com uma concentração de 0,5 µg/ml (solução de
trabalho).

Modo de preparação:
Recorrendo á equação das diluições e para preparar por ex. um volume de 200ml de solução de
et Br temos:
Cf  Vf
Vi = onde : (Ci = 10mg / ml  10000 g / ml )
Ci
(Cf = 0,5g / ml )
(Vf = 200ml )

0,5g / ml  200ml
= 0,01ml = 10 l
100ml
Vi = = 1000 µl _________ 1ml
10000g / ml 10000
x _________ 0,01ml

x= 10 µl
10 µl de et Br em 200ml de água destilada
Instruções de utilização:
1- Usar sempre luvas e bata;
2- Colocar a solução de et Br, preparada no passo anterior, numa tina e mergulhar o gel durante 15’ (se a
solução já tiver sido usada algumas vezes, prolongar o tempo de permanência do gel);
3- Após o tempo de coloração o gel deverá ser tirado com muito cuidado para outra tina contendo água
destilada, para diluir ligeiramente o et Br e de seguida colocar no transiluminador;
4- Antes de ligar o transiluminador devem ser colocados óculos de protecção UV; depois de ligado e
seleccionado o melhor tempo de exposição, a imagem do gel é captada com câmara digital devidamente
adaptada.