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ANÁLISE
publicado: 11 de abril de 2019
doi: 10.3389/fimmu.2019.00755

Técnicas para estudar a decodificação de

Dinâmica de célula única
Stevan Jeknic' 1,2†, Takamasa Kudo2,3† e Markus W. Covert 1,2,3 *
1 2
Departamento de Bioengenharia, Universidade de Stanford, Stanford, CA, Estados Unidos, Centro de descoberta Allen para sistemas
3
Modelagem de Infecção, Stanford, CA, Estados Unidos, Departamento de Biologia Química e de Sistemas, Universidade de Stanford,
Stanford, CA, Estados Unidos

As células devem ser capazes de interpretar os sinais que encontram e gerar de forma
confiável uma resposta apropriada. Há muito se sabe que a dinâmica do fator de transcrição
e da ativação da quinase pode desempenhar um papel crucial na seleção da resposta de uma
célula individual. O estudo da dinâmica celular expandiu-se dramaticamente nos últimos anos,
com a descoberta da dinâmica em novos caminhos, novos insights sendo revelados sobre a
importância da dinâmica e melhorias tecnológicas aumentando o rendimento e as capacidades
das medições de células únicas. Nesta revisão, destacamos os desenvolvimentos importantes
neste campo, com foco nos métodos utilizados para fazer novas descobertas. Também
incluímos uma discussão sobre melhorias em métodos de engenharia e medição de dinâmicas
Editado por: e respostas de células únicas. Finalmente, destacaremos brevemente alguns dos muitos
Myong-Hee Sung,
desafios e caminhos de investigação que ainda estão abertos.
Institutos Nacionais de Saúde (NIH),
Estados Unidos
Palavras-chave: dinâmica, decodificação, codificação, célula única, sinalização, microscopia de células vivas

Revisados pela:
João Albeck,
Universidade da Califórnia, Davis, INTRODUÇÃO
Estados Unidos
Eric Batchelor, A especificidade requer que uma célula seja capaz de reconhecer sinais heterogêneos como entradas
Institutos Nacionais de Saúde (NIH),
e calcular de forma confiável saídas heterogêneas em resposta. As células recebem sinais que podem
Estados Unidos
ser derivados do próprio organismo – sinais autócrinos, parácrinos e endócrinos – do ambiente ou de
*Correspondência: outros organismos, por exemplo, durante uma infecção. Freqüentemente, vários sinais estão presentes
Markus W. Covert
simultaneamente e em quantidades e durações que mudam rapidamente. Apesar disso, as células
mcovert@stanford.edu
devem ser capazes de diferenciar sinais de forma confiável e gerar uma resposta específica com base
†Esses autores contribuíram na identidade do sinal, intensidade (ou seja, a quantidade de sinal presente), frequência (ou seja, a
igualmente a este trabalho duração durante a qual o sinal está presente) e contexto (ou seja, , os outros sinais presentes e o estado celular).
Conseqüentemente, as células desenvolveram uma miríade de mecanismos para receber, transmitir
Seção especializada: e processar informações de forma reproduzível em um ambiente flutuante e barulhento. As células
Este artigo foi submetido para
geralmente primeiro “codificam” o sinal que recebem, transmitindo informações sobre o sinal para a
Imunidade Molecular Inata, uma
ativação de vias de sinalização específicas. As células são então capazes de “decodificar” essas
seção da revista
informações em respostas fenotípicas e mudanças na expressão de genes e proteínas. Notavelmente,
Fronteiras em Imunologia
as flutuações estocásticas na concentração de moléculas de sinalização, no número de proteínas de
Recebido: 25 de janeiro de 2019
sinalização intracelular e na composição do microambiente podem ser substanciais no nível de célula
Aceito: 21 de março de 2019
única (1). Portanto, as vias evoluíram para serem robustas a esse ruído biológico inevitável. As vias de
Publicado: 11 de abril de 2019
sinalização também são frequentemente redundantes ou sobrepostas; muitas vias de sinalização
Citação:
' celular são capazes de transmitir informações de uma variedade de sinais para produzir resultados
Jeknic S, Kudo T e Covert MW (2019)
heterogêneos, enquanto muitos sinais podem afetar múltiplas vias (2–4).
Técnicas para estudar a decodificação
da dinâmica de célula única.
Nas últimas duas décadas, tornou-se cada vez mais claro que as células utilizam uma variedade de
Frente. Imunol. 10:755. arquiteturas de sinalização para codificar informações detalhadas sobre os sinais que encontram
doi: 10.3389/fimmu.2019.00755 como padrões temporais de ativação de fatores de transcrição, quinases, íons de cálcio e outras moléculas de sina

Fronteiras em Imunologia | www.frontiersin.org 1 Abril 2019 | Volume 10 | Artigo 755.º

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'
Jeknic et al.
As células devem, portanto, também possuir mecanismos para
interpretar esta informação dinâmica e traduzi-la numa resposta
transcricional ou fenotípica. Um exemplo clássico é a discriminação
do fator de crescimento nervoso (NGF) e do fator de crescimento
epidérmico (EGF) por precursores neuronais de ratos. A estimulação
do NGF produz ativação sustentada da via ERK que estimula a
diferenciação da célula, enquanto a estimulação do EGF gera ativação
transitória da via ERK que é decodificada como um sinal proliferativo
(Figura 1A) (8–10) . Outro exemplo clássico é a via de sinalização imune
inata do fator nuclear (NF)-ÿB , que exibe padrões de ativação oscilatória
quando estimulada com fator de necrose tumoral (TNF)-ÿ, mas ativação
sustentada quando estimulada com lipopolissacarídeo (LPS), resultando
em diferentes expressões gênicas. padrões (11–13).
A importância da decodificação dinâmica da dose e identidade do
estímulo também foi descrita em várias outras vias. Por exemplo, sabe-
se que o p53 usa dinâmica para diferenciar doses de radiação gama e
entre radiação gama e UV (14, 15). A via Msn2 na levedura utiliza
dinâmica para diferenciar entre estresse osmótico e oxidativo, bem
como a gravidade da falta de glicose (16). Além disso, descobriu-se
recentemente que a via Notch diferencia alguns ligantes do tipo Delta
usando padrões dinâmicos (17). Finalmente, estudos recentes
descreveram como as células individuais interpretam múltiplos
estimulantes simultâneos (18, 19). Estes são apenas alguns exemplos
num espaço amplo; encorajamos fortemente os leitores a consultar
algumas das excelentes análises publicadas sobre codificação e
decodificação celular para uma visão mais completa, especialmente de
exemplos clássicos (20–22).
Claramente, a codificação e decodificação dinâmicas são difundidas
na biologia, mas estudar como as células interpretam a dinâmica
celular pode ser um desafio, porque as medições populacionais
obstruem o comportamento de células individuais (Figura 1B) e é difícil
fazer perturbações direcionadas nas vias de sinalização. Para entender
como as células individuais codificam e decodificam a dinâmica,
muitas vezes várias medições diferentes precisam ser feitas na mesma
célula em vários pontos de tempo. Características dos padrões
dinâmicos de sinalização (Figura 1C) podem então ser correlacionadas
com outras medições do comportamento celular para entender como
a célula está usando a dinâmica. Recentemente, o portfólio de
tecnologias de alto rendimento e de célula única expandiu-se bastante
e tornou-se acessível a um espectro mais amplo de laboratórios,
permitindo que a dinâmica de sinalização seja estudada em uma infinidade utilizando
Por exemplo, a optogenética permitiu a activação precisamente
direccionada de vias de sinalização, permitindo uma maior compreensão
do papel da dinâmica no desenvolvimento e na sinalização do cancro
(23–26). Os avanços na microfluídica permitiram uma nova precisão no
tempo de estimulação e dosagem (19, 27–29), bem como estudos de
secreção de proteínas de células únicas ou transcriptômica (30–33).
Finalmente, novos repórteres criaram oportunidades para fazer
medições em novos contextos e vias de sinalização (29, 34–41). Nesta
revisão, destacaremos diversas estratégias experimentais que têm
sido utilizadas com sucesso para estudar a decodificação dinâmica
celular, com ênfase em estudos unicelulares. Também discutiremos os
recentes desenvolvimentos tecnológicos que permitiram que o campo
crescesse rapidamente e terminaremos discutindo alguns potenciais
caminhos futuros de estudo e desafios tecnológicos que ainda
persistem.
Fronteiras em Imunologia | www.frontiersin.org
Decodificando a dinâmica de sinalização de célula única
DECODIFICAÇÃO DINÂMICA DE CELULAR
INFORMAÇÃO
Estudos em nível populacional revelaram algumas das conexões entre
a dinâmica de sinalização e as respostas celulares (12, 13, 42, 43). No
entanto, como discutido anteriormente, as medições populacionais
não são necessariamente indicativas do comportamento de uma única célula (Figura
A fim de compreender como células individuais decodificam sinais
dinâmicos em uma resposta fenotípica, é necessário fazer medições
combinadas da dinâmica de sinalização e da resposta celular a jusante
na mesma célula única. A microscopia provou ser uma ferramenta
inestimável para esses estudos, dada a versatilidade de medições que
pode fazer, incluindo não apenas a fluorescência de células vivas para
medir a própria dinâmica de sinalização, mas também a hibridização in
situ de fluorescência de molécula única (smFISH) para medir o gene.
expressão (44) e imunofluorescência ou outros métodos baseados em
anticorpos para medir a expressão proteica. Além disso, tem havido
trabalhos recentes para combinar outras modalidades, como RNA-seq
e microfluídica, com imagens de células vivas, ampliando o repertório
de possíveis medições. Apresentamos aqui uma coleção de estudos
recentes que demonstram estratégias eficazes para sondar a conexão
entre dinâmica e respostas celulares em um único nível celular.
Imagens de células vivas acopladas a medições
de fenótipos físicos A maneira mais direta de interrogar
como as células decodificam a dinâmica é medir a dinâmica de
sinalização e respostas fenotípicas claras, como morte celular,
migração celular ou divisão celular.
Estas medições estão bem adaptadas à microscopia de células vivas,
uma vez que as medições da dinâmica celular e da resposta fenotípica
podem ser feitas utilizando a mesma modalidade de medição com
poucas limitações técnicas.
Por exemplo, o p53 é um factor de transcrição com um papel crítico
na regulação do crescimento celular e na apoptose em resposta a
danos no ADN (45). Estudos anteriores em nível populacional sugeriram
que células com ativação de p53 abaixo de um limite específico
iniciariam a parada do crescimento, enquanto células acima desse
limite sofreriam apoptose (46). No entanto, estudos de células únicas
de sistemas.
um repórter p53 fluorescente mostraram que, para sofrer
apoptose, os níveis de p53 na célula devem de facto atingir um limiar,
mas que este limiar aumenta ao longo do tempo (Figura 2A) (47) .
Portanto, a decisão de apoptose ou parada do crescimento celular é
determinada pela dinâmica da ativação do p53, em oposição a um limiar estático.
Esta observação só poderia ter sido feita usando uma abordagem
dinâmica de célula única.
Um estudo semelhante revelou aspectos da sinalização do TNF que
estão correlacionados com a apoptose. A sinalização do TNF inicia
uma cascata pró-apoptótica, bem como a indução de genes pró-
sobrevivência pelo NF-ÿB (48). Usando um dispositivo microfluídico
para controlar com precisão o tempo e a dosagem do estímulo, Lee et
al. mostraram que pulsos curtos – tão curtos quanto 1 min – de TNF-ÿ
podem ser mais eficazes na indução de apoptose do que pulsos mais
longos. Medições unicelulares da ativação do NF-ÿB mostraram que
pulsos mais longos de TNF sustentaram tempos de residência mais longos de NF-ÿB
2 Abril 2019 | Volume 10 | Artigo 755.º
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Jeknic et al. Decodificando a dinâmica de sinalização de célula única

FIGURA 1 | Fundamentos de codificação e decodificação dinâmica. (A) As células podem codificar informações sobre os sinais que encontram como padrões dinâmicos de ativação da
via de sinalização. Esses padrões podem então ser decodificados para produzir uma resposta específica. Por exemplo, o NGF cria uma ativação sustentada de ERK, que leva à
diferenciação, enquanto o EGF cria uma ativação transitória de ERK, que leva à proliferação. (B) Medições em nível populacional, como um western blot, podem ocultar o
comportamento de células únicas no sistema subjacente. Por exemplo, uma resposta analógica ou digital poderia produzir western blots semelhantes, apesar de ter diferentes quantidades
de células ativas e atividade por célula. (C) Exemplos de alguns recursos de rastreamentos dinâmicos que podem ser usados para codificar informações.

estão correlacionados com o equilíbrio relativo da sinalização pró-
apoptótica e pró-sobrevivência (49). O braço pró-apoptótico da via é
iniciado numa escala de tempo mais lenta e é inibido pelo braço pró-
sobrevivência da via (48, 50, 51). Portanto, os autores propõem um modelo
onde a ativação sustentada do NF-ÿB causada por pulsos mais longos de
TNF mantém a inibição do braço de sinalização pró-apoptótica, levando a
uma maior sinalização relativa de pró-sobrevivência (49).
A microscopia de células vivas também tem sido usada para entender
como a dinâmica espaço-temporal das proteínas quinases ativadas por
que permitem
mitógenos (MAPKs) regulam os processos de acasalamento em células de levedura
individuais.
Para passar por um acasalamento e fusão bem-sucedidos, as células de
levedura individuais devem remodelar suas paredes celulares, interromper
o ciclo celular e polarizar seu crescimento (52, 53). Um repórter de
transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) da atividade de
duas MAPKs, Fus3 e Kss1, juntamente com a observação visual da forma
e do crescimento celular, revelou que a atividade elevada de Fus3 nos
locais de crescimento polarizado era necessária para iniciar a polaridade e
a fusão entre o acasalamento. células, mostrando que o padrão
espaçotemporal da atividade do Fus3, e não apenas os níveis do Fus3, são
necessários para o fenótipo de acasalamento correto (54).
Repórteres de múltiplas vias diferentes também podem revelar como o
contexto de um estímulo imunológico pode afetar a forma como uma célula
imunológica responderá (55). As células imunes inatas usam receptores de
reconhecimento de padrões (PRRs), como os receptores Toll-like (TLRs),
para detectar moléculas que são indicativas de uma infecção. Uma linhagem
celular que expressa tanto um repórter NF-ÿB quanto um repórter c-Jun N-
terminal quinase (JNK) foi desafiada com níveis crescentes de estimulação
imunológica, desde apenas LPS até infecção por Salmonella typhimirium, permitindo
medições da resposta de sinalização da célula em cada caso (35).
Este trabalho mostrou como uma célula individual usa sinalização TLR
para discriminar sinais semelhantes em uma variedade de contextos diferentes.
Por exemplo, numa população de células expostas a S. typhimirium, as
células não infectadas normalmente activavam apenas NF-ÿB, enquanto as
células que foram infectadas com bactérias normalmente activavam tanto
JNK como NF-ÿB (35).
Existem vários repórteres de células vivas que ampliam os tipos de
fenótipos físicos que podem ser medidos diretamente usando microscopia
de células vivas. Por exemplo, foram desenvolvidas sondas fluorescentes
medições quantitativas da ativação de quinase de célula
única (34, 37), visualização de vários modos de morte celular e ativação de
caspases (36, 56), bem como progressão do ciclo celular e medições de
proliferação taxa (57). Este repórter de proliferação foi usado em conjunto
com um repórter de atividade de ERK baseado em FRET para mostrar que
as células usam a duração do pulso de ERK e a atividade geral para regular
a entrada na fase S e o tempo do ciclo celular. Experimentos subsequentes
utilizando imunofluorescência de alto conteúdo (HCIF) sugeriram que o
principal fator quantitativo que controla a proliferação em estado
estacionário em células individuais é a produção de ERK (58).
Esses experimentos são exemplos claros de como podemos começar
a entender como a dinâmica de sinalização gera respostas fenotípicas
físicas. Além disso, o desenvolvimento de novos biossensores, melhorias
na nossa capacidade de regular a dinâmica celular (ver “Estratégias
experimentais para engenharia ou modulação de padrões de sinalização
dinâmica”) e melhorias na caracterização de fenótipos de alto rendimento
(59), devem permitir ainda mais informações sobre esta área de pesquisa.

Fronteiras em Imunologia | www.frontiersin.org 3 Abril 2019 | Volume 10 | Artigo 755.º

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'
Jeknic et al.
FIGURA 2 | Exemplos de decodificação de padrões de sinalização dinâmica. (A) A
apoptose devido à sinalização p53 não é determinada por um limiar estático, mas por
um limiar dinâmico e crescente. Algumas células não sofrem apoptose, embora tenham
níveis de p53 mais elevados do que algumas células que sofrem apoptose. Figura
adaptada de Paek et al. (47). (B) Existem subpopulações com padrões distintos de
atividade de NF-ÿB em células únicas estimuladas com LPS. Esses padrões estão
correlacionados com diferentes padrões de expressão gênica para alvos conhecidos de NF-ÿB.
Figura adaptada de Lane et al. (32). (C) As taxas basais de diferenciação
de adipócitos são baixas in vivo, apesar dos grandes pulsos diários de produção de
glicocorticóides. No entanto, insumos contínuos de glicocorticóides de magnitude
total semelhante induzem mais estabilização do PPARG, indicada em
verde, e taxas de diferenciação mais altas. Figura adaptada de Bahrami-Nejad et al. (73).
Imagens de células vivas acopladas a medições
de expressão gênica e transcrição As vias de sinalização
geralmente exercem
controle sobre a célula, fazendo alterações na expressão de genes-
alvo específicos. Nesses casos, é provável que os padrões de
sinalização dinâmica sejam decodificados como alterações
quantitativas na expressão gênica. Porém, desvendar
Fronteiras em Imunologia | www.frontiersin.org
Decodificando a dinâmica de sinalização de célula única
essa conexão pode ser mais desafiadora do que medir fenótipos
físicos porque requer medir a dinâmica de sinalização e a expressão
gênica na mesma célula. Apesar desta complicação, muitos estudos
recentes demonstraram estratégias experimentais para combinar
com sucesso modalidades de medição para descobrir resultados
interessantes.
Por exemplo, a abundância nuclear de NF-ÿB varia significativamente
em células estimuladas e não estimuladas, sugerindo que a
transcrição de NF-ÿB também pode ser altamente variável (60). No
entanto, as medições smFISH em células individuais mostram que os
níveis de transcrição para muitos alvos de NF-ÿB variam menos que a
atividade do NF-ÿB (61). Medições de um repórter fluorescente de NF-
ÿB, combinadas com a quantificação smFISH de ponto final de
transcritos regulados por NF-ÿB, mostraram que quantidades
dinâmicas, como a mudança de dobra de NF-ÿB, eram melhores
preditores de níveis transcricionais do que quantidades estáticas,
como NF Abundância nuclear -ÿB . A modelagem matemática
subsequente revelou um mecanismo potencial baseado em um loop
feed-forward incoerente gerado pela competição de fatores de
transcrição (61). Trabalhos recentes, também utilizando uma
estratégia baseada em smFISH, mostraram ainda que a alteração da
dobra do NF-ÿB era um preditor preciso dos níveis de transcrição em
promotores com níveis altos e baixos de transcrição induzida por TNF (62).
Um exemplo semelhante envolveu o estudo das respostas do NF
ÿB à estimulação simultânea de LPS e TNF-ÿ para entender como as
células respondem a múltiplos estímulos. Um repórter fluorescente
foi usado para medir a ativação de NF-ÿB em células 3T3 em uma
faixa de concentrações de LPS e TNF-ÿ. Para a maioria das
concentrações, a resposta poderia ser classificada como uma
resposta apenas de LPS ou apenas de TNF-ÿ, mas para uma série de
concentrações intermediárias, houve uma resposta sinérgica que
tinha características de células estimuladas por TNF e LPS. A medição
subsequente do smFISH do mRNA de uma série de quimiocinas e
citocinas relevantes revelou que as células de resposta dupla tinham,
em média, maior expressão de Cxcl10 e Csf3 (18). Estratégias
semelhantes também foram utilizadas com sucesso em outros sistemas de sinaliza
A imagem dinâmica unicelular também pode revelar novos
fenômenos que podem ser estudados posteriormente usando outras
técnicas. Por exemplo, sabe-se que o vírus VIH se integra no genoma
do hospedeiro e permanece latente em alguns linfócitos T, o que
representa um grande obstáculo ao tratamento com terapia anti-retroviral (66).
Embora esses reservatórios latentes de vírus exibam ativação
estocástica e de baixo nível, os reguladores moleculares que
controlam a ativação viral ainda não são completamente
compreendidos (67). NF-ÿB é um regulador conhecido do promotor
de repetição terminal longa (LTR); no entanto, um estudo recente
utilizando repórteres fluorescentes de ativação de HIV e NF-ÿB
revelou que a ativação de NF-ÿB não é preditiva dos níveis de ativação viral em dife
Em vez disso, usando smFISH e imunoprecipitação da cromatina
(ChIP), os autores descobriram que o ambiente da cromatina regula
o bursting transcricional e pode explicar a variabilidade entre clones.
Estas descobertas revelaram que as interações NF-ÿB-cromatina são
necessárias para explicar a explosão transcricional e a ativação viral
(68).
Estratégias baseadas em FISH também têm sido usadas para
elucidar o papel que a dinâmica pode desempenhar in vivo durante o
desenvolvimento. Por exemplo, foi demonstrado que a miogênese requer transição
4 Abril 2019 | Volume 10 | Artigo 755.º
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Jeknic et al.
ativação sustentada de Notch, mas o mecanismo de ativação
transitória de Notch não estava claro (69). Recentemente, foi revelado
que a via Notch também utiliza dinâmica para codificar e decodificar
informações sobre a identidade do estímulo ativador (17). Um sistema
experimental criativo, usando linhas celulares “remetidas” projetadas
que produzem DLL1 ou DLL4 e uma linha celular “receptora” com
um receptor Notch quimérico que conduz a expressão de uma
proteína fluorescente permitiu medições da dinâmica da ativação de
Notch na presença de qualquer ligante . Esses experimentos
revelaram que a estimulação de DLL1 leva à ativação pulsátil de
Notch, enquanto DLL4 cria ativação sustentada de Notch, com
diferenças na expressão gênica como resultado. Os resultados foram
reproduzidos em um modelo in vivo eletroporando DLL1 ou DLL4
em um lado da crista neural de um embrião de pintinho e depois
usando FISH de reação em cadeia de hibridização (HCR) para corar
MyoD1, um fator regulador muscular. Seus resultados revelaram que
MyoD1 é regulado positivamente por DLL1, que cria dinâmica pulsátil,
enquanto DLL4, que cria dinâmica sustentada, regula negativamente
MyoD1 (17).
Em sistemas onde as medições finais da expressão genética são
insuficientes, vários repórteres fluorescentes podem ser usados
para medir a sinalização e a saída transcricional simultaneamente.
Por exemplo, o TNF-ÿ é um alvo regulador conhecido do NF-ÿB, que
pode subsequentemente regular respostas a jusante através de
sinalização parácrina e autócrina (11, 32, 70). Uma linhagem celular
com repórteres tanto para a atividade do NF-ÿB quanto para a
transcrição do promotor do TNF-ÿ foi usada para medir
simultaneamente a sinalização e a dinâmica transcricional em tempo real.frequentes das alterações na expressão da proteína a jusante. A
As medições revelaram baixa correlação entre muitas medidas da
atividade do NF-ÿB e a saída do promotor do TNF-ÿ.
No entanto, a atividade do NF-ÿB integrada no tempo foi bem
correlacionada com a produção total do promotor do TNF-ÿ,
demonstrando que medições contínuas da atividade transcricional
podem revelar mais informações do que medições finais em alguns
sistemas (71).
Finalmente, agora também é possível medir a dinâmica de
sinalização e as respostas transcricionais de todo o genoma na
mesma célula. O RNA-seq forneceu um método para medir todo o
transcriptoma de uma única célula, mas permaneceu sem solução
como conectar esses dados com medições da dinâmica de ativação
do fator de transcrição. Lane et al. usou microfluídica para isolar
células para imagens de células vivas e RNA-seq de célula única
para conectar a identidade da célula em ambos os conjuntos de
dados. Seus resultados revelaram que padrões distintos de
sinalização de NF-ÿB em resposta ao mesmo estímulo correlacionaram- repórter FRET e secreção de IL-1ÿ em células individuais. Análises
se com diferentes respostas transcricionais globais (Figura 2B) (32).
A capacidade de medir a expressão gênica global resultante da
dinâmica heterogênea é extremamente útil, porque permite a
caracterização fenotípica da dinâmica de células únicas sem a
necessidade de conhecimento a priori dos genes alvo.
Imagens de células vivas acopladas a medições de expressão
de proteínas Freqüentemente, uma
resposta celular aos sinais que recebe é regular diferencialmente a
expressão ou secreção de proteínas. Por exemplo, uma grande parte
da resposta imunitária é coordenação
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Decodificando a dinâmica de sinalização de célula única
da secreção de citocinas e quimiocinas pelas células do sistema
imunológico no local da infecção. Portanto, outro caminho promissor
para pesquisa em dinâmica celular é estudar mudanças na expressão
e secreção de proteínas em conjunto com medições de dinâmica. A
imunofluorescência pode ser usada para medir a expressão
intracelular de proteínas, semelhante às medições de expressão
genética usando smFISH. Alternativamente, dispositivos microfluídicos
ou ensaios baseados em micropoços podem ser usados para medir
a secreção de proteínas de células individuais.
Por exemplo, a quantificação de proteínas pode ser usada para
compreender como as vias de sinalização nas células controlam a diferenciação.
Hormônios como os glicocorticóides induzem fortemente a
adipogênese in vivo e in vitro, mas as taxas basais de diferenciação
de pré-adipócitos são baixas em animais vivos, apesar dos grandes
picos diários na produção de hormônios glicocorticóides (72). Isto
levanta a questão de como a via de diferenciação nos pré-adipócitos
é capaz de filtrar sinais pulsáteis diários. Imagens de células vivas
de fatores de transcrição adipogênicos endógenos CEBPB e PPARG,
e coloração para marcadores de diferenciação de células adiposas,
revelaram que o circuito transcricional em pré-adipócitos filtra
efetivamente sinais pulsáteis, mas responde a sinais contínuos da
mesma magnitude total (Figura 2C). Um modelo previu que tal
resposta poderia ser alcançada se o sistema tivesse ciclos de
feedback rápidos e lentos, e coloração adicional de proteínas e
mRNA revelou FABP4 como um potencial parceiro de feedback lento na via (73) .
Na maioria das vezes, a expressão da proteína é medida no ponto
final do experimento, mas às vezes são necessárias medições mais
sinalização ERK foi descrita como um “detector de persistência”,
que impulsiona a expressão aproximadamente digital de genes alvo
com base na duração da atividade ERK (74-76), e também como um
sistema onde a amplitude do pico regula qualitativamente a indução
genética (77). Medir simultaneamente a atividade de ERK e a indução
de Fra-1, um alvo de ERK, usando repórteres de células vivas, revelou
que a integração linear da atividade de ERK foi o principal
determinante das respostas a jusante (78) .
A secreção de proteínas unicelulares é mais difícil de medir,
devido às baixas quantidades de proteínas secretadas e à necessidade
de isolar células individuais. Uma estratégia para estudar a secreção
proteica de uma única célula é usar microscopia de reflexão interna
total para medir proteínas secretadas em um micropoço por meio de
um imunoensaio em sanduíche (79). Esta abordagem foi usada para
fazer medições simultâneas da ativação da caspase-1 usando um
adicionais revelaram que a ativação da caspase-1 é digital e controla
uma explosão de IL-1ÿ secretada por macrófagos mortos (33).
Alternativamente, foram desenvolvidas múltiplas estratégias
microfluídicas para combinar imagens de células vivas e detecção
de proteínas secretadas baseada em anticorpos (30, 31). As células
são inicialmente capturadas em poços de células individuais, onde
podem ser expostas a doses e durações precisas de estímulos e
fotografadas usando um microscópio fluorescente. A mídia do poço
de cada célula pode ser amostrada e medida com anticorpos para
proteínas secretadas em vários momentos durante o experimento.
Dependendo do dispositivo, também é possível corar células por
imunofluorescência, permitindo a medição de proteínas secretadas e intracelulare
5 Abril 2019 | Volume 10 | Artigo 755.º
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Jeknic et al.
Finalmente, as alterações na expressão proteica também podem
ser controladas pelos reguladores da cromatina, que conferem
modificações nas histonas e no DNA (80, 81). Agora é possível estudar
como células individuais usam diferentes reguladores da cromatina
para produzir dinâmicas variadas de expressão gênica. Bintu et al.
usaram um sistema induzível por doxiciclina para recrutar reguladores
individuais da cromatina para regular a expressão de uma proteína
fluorescente. Eles mostraram que o silenciamento e a reativação
epigenética são processos digitais em células individuais e que
diferentes reguladores da cromatina modulam a fração de células
silenciadas. Além disso, utilizando um modelo estocástico, eles
descrevem as diferentes dinâmicas tanto para silenciamento quanto
para reativação, criadas por cada regulador de cromatina (82). Como
as células usam modificações na cromatina para processar
informações de sinal ainda é pouco compreendido (83), mas estudos da dinâmica
plasmática
ESTRATÉGIAS EXPERIMENTAIS PARA
ENGENHARIA OU MODULAÇÃO
PADRÕES DE SINALIZAÇÃO DINÂMICA
Estudar a decodificação celular é mais desafiador do que estudar a
codificação celular, por razões técnicas e biológicas. O principal
desafio biológico é que as células possuem vias de sinalização
complicadas que interagem entre si e controlam resultados
heterogêneos. Assim, é tecnicamente difícil provar que a dinâmica é o
fator causal na medição fenotípica. Também tem sido difícil perturbar
a dinâmica de sinalização de forma que ajude a estabelecer a
causalidade do fenótipo, especialmente em células individuais. Aqui
resumimos estratégias que foram utilizadas com sucesso para modular
a dinâmica de sinalização, bem como avanços técnicos significativos
que permitiram novas formas de controlar a dinâmica de sinalização
em células individuais.
Dinâmica projetada usando optogenética e outros sistemas sintéticos
Avanços recentes na biologia sintética abriram
novas maneiras interessantes de controlar de forma precisa e seletiva
a sinalização dinâmica. Um desses avanços é o campo da optogenética,
que explora a luz para controlar a função proteica e as atividades
celulares com alta resolução espaço-temporal (Figura 3A).
As ferramentas optogenéticas são geralmente mais rápidas e seletivas
do que a estimulação farmacológica, e sua capacidade de gerar
padrões temporais flexíveis nos trouxe um conceito de identificação
de sistemas de engenharia para estudar as características da via de
sinalização celular de maneira mais direta.
Aqui apresentamos alguns exemplos de estratégias optogenéticas
aplicáveis à dinâmica de sinalização, mas informações mais detalhadas
sobre limitações e outras aplicações também foram revisadas
recentemente (84–86).
Um sistema comumente usado é o Phy-PIF, um sistema
optogenético com uma taxa de desativação rápida. Tanto a ligação
como a dissociação são induzidas pela estimulação luminosa; a luz
vermelha induz a ligação e a luz infravermelha induz a dissociação
(87). OptoSOS adota este sistema para ativar a via de sinalização Ras-
ERK, induzindo a translocação de SOS para a membrana plasmática. Isso pode ser usado
irreversíveis devido à ligação de alta afinidade, a indução aguda de dimerização ou
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Decodificando a dinâmica de sinalização de célula única
ativar a via de forma reprodutível usando pulsos muito curtos (<1 min)
e altas frequências de ativação, permitindo medir a resposta de
frequência da via (88). Este sistema foi recentemente utilizado para
mostrar que uma mutação em B-Raf numa linhagem de cancro humano
levou a uma cinética de decaimento mais lenta da via, o que significa
que um espaço maior de frequências e forças de entrada são
interpretados como sinais de crescimento nesta linha celular (23 ) .
Cry2 é outro sistema optogenético amplamente utilizado. Tem uma
taxa de ativação e desativação mais lenta em comparação com outros
sistemas, mas tem a propriedade única de exibir hetero e
homodimerização após estimulação com luz azul.
Cry2 se liga ao domínio N-terminal de CIB1 de maneira dependente da
luz azul. Da mesma forma que o OptoSOS, a fusão cRaf com Cry2 foi
usada para ativar a via ERK induzindo a translocação para a membrana
de regulação
(89) (Figura
da3B).
cromatina
Utilizando
em células
este sistema,
individuais
foi demonstrado
fornecem um caminho pro
que a ativação pulsátil de ERK levou a uma maior proliferação celular
do que a ativação sustentada. Vários genes que são melhor induzidos
pela ativação pulsátil de ERK também foram identificados.
A fotoativação pelo recrutamento de um parceiro para uma membrana
compreende muitos exemplos, como PKA (90), AKT (26, 91) e TrkA
(92). Além desta heterodimerização entre Cry2 e CIB1, sabe-se que
Cry2 tem uma propensão para oligomerização.
Esta propriedade de oligomerização foi posteriormente melhorada
com uma pequena alteração nas sequências (93, 94). Como muitos
eventos de sinalização são iniciados pela homo-oligomerização,
particularmente a sinalização do receptor, eles têm sido amplamente
aplicados a muitas vias de sinalização (95–100).
Um domínio sensor de voltagem de oxigênio leve (LOV) é um
motivo fotossensorial encontrado em muitas proteínas em diversas
espécies. A estimulação da luz azul induz a formação de ligação
covalente entre o domínio LOV e seu cofator flavina, levando a um
desdobramento parcial entre o domínio LOV e a hélice A C-terminal.
Os domínios LOV foram projetados para muitas aplicações devido ao
pequeno tamanho deste domínio (~110 aminoácidos). Por exemplo,
um sistema promotor de gene comutável por luz foi desenvolvido pela
fusão de um domínio LOV fúngico e o fator de transcrição Gal4 sem o
domínio de dimerização (101). Este sistema também foi aplicado para
controlar padrões temporais de expressão do gene Ascl1 proneural
em células progenitoras neurais (24), e a expressão oscilatória e
sustentada de Ascl1 mostrou induzir proliferação e diferenciação,
respectivamente.
Ao contrário dos exemplos acima que exploram a translocação ou
o recrutamento, existem muitas ferramentas optogenéticas que podem
controlar diretamente o alostério e a complementação de fragmentos.
Isto inclui estratégias baseadas em Dronpa (25, 102), proteínas
baseadas no domínio LOV utilizando foto-uncaging (103-106) e uma
série de canais e receptores sensíveis à luz. Por exemplo, Hannanta-
Anan e Chow usaram melanopsina para gerar uma onda de liberação
de cálcio (107). Ao controlar sistematicamente a amplitude, a
frequência e os ciclos de trabalho da oscilação do cálcio, eles
descobriram que o NFAT a jusante integra concentrações totais
elevadas de cálcio devido à sua lenta taxa de exportação.
A dimerização também pode ser induzida quimicamente; a
dimerização de FKBP e FRB com rapamicina é um exemplo clássico
que tem sido utilizado numa ampla variedade de aplicações há muitos
anos (108-110 ). Embora muitas ferramentas sejam essencialmente
6 Abril 2019 | Volume 10 | Artigo 755.º
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FIGURA 3 | Abordagens de engenharia para manipulação de padrões de sinalização dinâmica. (A) Ferramentas optogenéticas podem ativar de forma dinâmica e seletiva
uma via isolada de contextos de sinalização de receptores endógenos. (B) A luz azul induz a dimerização entre o domínio N-terminal CIB1 e Cry2 fundido ao cRaf,
levando ao recrutamento de cRaf para a membrana. Ras ativa cRaf na membrana e, assim, ativa a via ERK a jusante. (C) Dispositivos microfluídicos foram usados para
controlar o fluxo de inibidores de moléculas pequenas da via de sinalização Notch e Wnt. As oscilações em fase dessas duas vias levaram à segmentação
adequada do mesoderma, enquanto a oscilação fora de fase prejudicou a segmentação.

tem sido uma estratégia eficaz para investigar a causa de eventos
de sinalização. Por exemplo, Santos et al. construíram os
repórteres nucleares Cdk1-FKBP e ciclina B1-FRB para testar a
regulação de feedback positivo espacial da Cdk1-ciclina B1 (111).
A dimerização química destes complexos nos núcleos
desencadeou a translocação nuclear da ciclina B1, que foi
confirmada pela translocação de uma proteína fluorescente
fundida à ciclina B1, mas não fundida à FRB.
Outra abordagem potencial para controlar a dinâmica é projetar
uma versão totalmente sintética da via em um ambiente celular
ortogonal. Por exemplo, a via ERK foi reconstruída em leveduras,
e esta cascata mínima demonstrou gerar ultrassensibilidade (112).
Recentemente, uma via sintética de sinalização NF-ÿB foi
introduzida em leveduras para estudar seu comportamento
oscilatório (113). A amplitude e o período da resposta oscilatória
ao fator ÿ podem ser regulados experimentalmente ajustando o
nível de RelA de um promotor induzível, a estabilidade da proteína
e/ou a força do promotor que conduz a expressão do componente
de feedback negativo, IÿBÿ . Os sistemas sintéticos fornecem uma
maneira fácil de manipular parâmetros de vias e estruturas de
circuitos com entradas de moléculas pequenas.
A microfluídica pode controlar com precisão a dose e o tempo
do estímulo O controle fluídico era
uma abordagem padrão para manipular dinamicamente um padrão
de estimulação antes que as abordagens genéticas ou sintéticas
se tornassem populares. Uma configuração fluídica simples com
uma bomba tem sido usada há várias décadas para controlar o
fluxo de entrada, incluindo estudos iniciais de sinalização de
glucagon (114) e sinalização de cálcio (115). Os dispositivos
microfluídicos representam agora uma melhoria dramática,
proporcionando-nos um controle mais preciso para gerar
praticamente qualquer tipo de padrão temporal, para estudar codificação e dec
A ativação do NF-ÿB em células individuais foi bem estudada
usando tais dispositivos (116, 117). Um estudo mostrou que as
células respondem ao TNF-ÿ de maneira probabilística, o que
significa que apenas uma fração das células ativa a via do NF-ÿB
quando as concentrações de TNF-ÿ são baixas. O controle
temporal baseado em microfluídica da estimulação do TNF
permitiu que múltiplos pulsos discretos de TNF-ÿ fossem
entregues à mídia. Estas experiências mostraram que a
variabilidade na resposta do NF-ÿB depende não apenas da
variabilidade celular pré-existente, mas também de um elemento estocástico p

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Jeknic et al.
Em termos de decodificação dinâmica, as características do filtro
da via de estresse da levedura foram extensivamente estudadas
utilizando dispositivos microfluídicos (16, 119, 120). Ao modular a
amplitude, frequência e duração da translocação nuclear periódica
do Msn2, foi demonstrado que cada promotor transcrito pelo Msn2
tem uma sensibilidade distinta à amplitude e frequência de pulso.
Estas diferenças podem regular diferencialmente pelo menos quatro
classes de genes a jusante do Msn2 (121).
A microfluídica também tem sido usada para manipular fenótipos
celulares, controlando a dinâmica de sinalização. Por exemplo, a
estimulação de EGF e NGF em células PC12 ativa a via ERK de
maneira transitória e sustentada, respectivamente, levando a
diferentes resultados celulares. Com um dispositivo microfluídico,
Ryu et al. inverteu os resultados de cada fator de crescimento
simplesmente alterando os padrões de estímulo (28). Como outro
exemplo, Sonnen et al. observaram que a segmentação do mesoderma
pré-somítico depende do tempo relativo entre as oscilações de
sinalização Wnt e Notch (29). Eles usaram microfluídica para gerar
oscilações em fase ou fora de fase dessas duas vias e mostraram
que as oscilações fora de fase prejudicam a segmentação (Figura 3C).
MELHORIAS TÉCNICAS EM ALTO
PRODUTO DE CÉLULA ÚNICA
MEDIDAS
Muitos dos exemplos acima mostram a versatilidade e capacidade da
microscopia para interrogar as relações entre a dinâmica de
sinalização e os fenótipos a jusante em células individuais. Está se
tornando claro que a dinâmica de sinalização pode ser decodificada
em programas distintos de expressão gênica, levando a diversos
fenótipos celulares; no entanto, a maioria dos estudos só conseguiu
medir alguns genes devido a desafios técnicos. Aqui abordaremos
alguns dos avanços técnicos recentes que potencialmente expandem
o rendimento e a acessibilidade desta modalidade de medição.
Como vimos nos exemplos acima, FISH e imunofluorescência são
técnicas comumente usadas para capturar respostas a jusante. O
FISH pode ser implementado de maneira de alto rendimento, pois é
possível remover ou branquear sondas e, assim, iterar a detecção
(122–124). A desvantagem destas técnicas é o seu custo e
sensibilidade, uma vez que são necessárias muitas sondas para ligar
uma espécie de ARNm e, assim, amplificar um sinal específico. Dois
métodos recentemente desenvolvidos utilizam diferentes esquemas
de amplificação de sinal, permitindo maior sensibilidade e ganho. O
primeiro método é a tecnologia de hibridização in situ por ligação por
proximidade (PLISH) (125). PLISH amplifica uma região alvo por
amplificação em círculo rolante após gerar oligonucleotídeos de
sonda de círculo fechado por ligação de proximidade modelada por
RNA. A segunda técnica, chamada FISH amplificadora de clique
(clampFISH), utiliza química de clique não enzimática para gerar
oligonucleotídeos de círculo fechado (126, 127). Ambas as técnicas
demonstraram fornecer melhores sinais de fluorescência tanto em
culturas celulares quanto em amostras de tecidos (126).
Semelhante às abordagens FISH de alto rendimento, existem
métodos que tentam determinar a quantidade de muitas proteínas
específicas através de imunofluorescência ao longo de múltiplos ciclos. sinalização farmacologicamente alterada só foi demonstrada em alguns estudos, m
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Decodificando a dinâmica de sinalização de célula única
Por exemplo, Lin et al. desenvolveram cycIF por branqueamento de
um fluoróforo conjugado com um anticorpo primário com peróxido
de hidrogênio (128). Eles foram capazes de detectar 60 proteínas em
uma amostra de tecido tumoral repetindo as etapas de branqueamento
e coloração para cada proteína de interesse (129). Outro grupo
desenvolveu o método de eluição de anticorpos denominado 4i, que
elui anticorpos com uma mistura de agente redutor, pH baixo e sais
caotrópicos, e um tampão de bloqueio (130). Isto é compatível com
imunofluorescência indireta, e 40 proteínas foram detectadas com
esta abordagem. Uma abordagem semelhante, codetecção por
indexação (CODEX), utiliza anticorpos conjugados com oligonucleotídeos (131).
Em vez de repetir as etapas de ligação ao anticorpo, este método
primeiro realiza o processo de ligação, seguido pela detecção repetida
dos anticorpos com código de barras, incorporando nucleotídeos
marcados com fluoróforo pela polimerase.
Estes métodos baseiam-se na detecção de fluorescência e,
portanto, o número de detecções de cada vez é limitado pela
sobreposição espectral. Em contraste com essas abordagens, a
citometria de massa de imagem e a imagem por feixe de íons
multiplexados usam anticorpos marcados com metal (132-134). O
sinal dos isótopos metálicos é medido por espectrometria de massa,
permitindo a detecção simultânea de mais proteínas do que seria
possível por fluorescência. Ambos os métodos foram capazes de
medir mais de 30 proteínas de amostras de tumores (135, 136) e
também podem ser combinados com métodos FISH de alto rendimento (137).
Para análise de imagens de células vivas, a automação
computacional é cada vez mais um requisito devido à quantidade de
dados que podem ser facilmente adquiridos. Um dos avanços
recentes nesta área envolve o aprendizado profundo. As redes
neurais convolucionais foram aplicadas pela primeira vez à
classificação de imagens histopatológicas para fins diagnósticos
(138-140). Em 2016, uma ferramenta de software chamada DeepCell
empregou esse tipo de tarefa de classificação para segmentação
automatizada de imagens de células (141). Além de uma maior
precisão de segmentação para imagens fluorescentes, esta
abordagem baseada em aprendizagem profunda também nos permite segmentar o
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A capacidade e compatibilidade das técnicas de medição unicelulares
avançaram significativamente nos últimos anos.
Agora é possível medir a ativação da via de sinalização e os níveis
de RNA, proteína ou metabólito em células individuais, muitas vezes
em tempo real. O rendimento destas medições também está
aumentando rapidamente, especialmente com o desenvolvimento de
melhores técnicas computacionais para análise de imagens e
abordagens iterativas de FISH e imunofluorescência. Além disso,
nossa capacidade de projetar a dinâmica de células únicas também
está melhorando rapidamente com o desenvolvimento de técnicas
como a optogenética. Como resultado, os estudos que descrevem
como as células individuais respondem às entradas usando padrões
dinâmicos expandiram-se para novos sistemas e níveis de detalhe.
Na prática, estas novas descobertas podem revelar formas de
direcionar a dinâmica de sinalização em contextos de doenças,
levando potencialmente a novos tratamentos (145). A dinâmica de
8 Abril 2019 | Volume 10 | Artigo 755.º
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isso pode mudar com o desenvolvimento de melhores ferramentas melhoria tanto nas técnicas disponíveis para o estudo da dinâmica,
e conhecimentos (64, 146). Além disso, uma melhor compreensão como também no número de sistemas aos quais essas técnicas
das respostas celulares dinâmicas pode ajudar a abrir caminho podem ser aplicadas.
para células com circuitos de sinalização funcionais projetados,
que têm grande potencial como possíveis ferramentas terapêuticas e científicas (147).
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
No entanto, este campo ainda está numa fase inicial e ainda há
muitos desafios a enfrentar. O desenvolvimento de repórteres SJ, TK e MC conceberam e escreveram o manuscrito.
continua a ser um problema desafiador e, portanto, atualmente
existem repórteres apenas para um pequeno subconjunto de FINANCIAMENTO
caminhos. Além disso, a maioria das medições das vias de
sinalização continua a depender de repórteres exógenos, que Os autores agradecem o financiamento de diversas fontes,
podem diferir das respostas observadas com proteínas endógenas. incluindo o Allen Discovery Center Award e o Allen Distinguished
Embora tenha sido feito trabalho para facilitar a medição direta de Investigator Award concedido a MC, a bolsa de estudos da
proteínas endógenas, esses métodos ainda permanecem mais Fundação Nakajima concedida a TK e o financiamento do National
difíceis do que usar repórteres exógenos. Finalmente, os rastreios Institutes of Health (NIH) NIGMS Training Grant in Biotechnology
genéticos em larga escala permitiram novos níveis de compreensão ( 5T32GM008412) concedido a SJ.
em muitos campos através da capacidade de procurar efetores importantes em todo o genoma.
No entanto, o uso da microscopia em conjunto com telas AGRADECIMENTOS
genômicas ainda é extremamente desafiador devido à necessidade
de conectar as medições feitas com a microscopia à perturbação Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório
genética em cada célula. Assim, ainda há muito espaço para Covert pelas discussões úteis e comentários sobre o manuscrito.

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Declaração de conflito de interesses: Os autores declaram que a pesquisa foi realizada
na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser
interpretadas como um potencial conflito de interesses.
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12 Abril 2019 | Volume 10 | Artigo 755.º