UNIVERSIDADE FEDERAL DO RECÔNCAVO DA BAHIA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

ROTEIRO SOBRE CALIBRAÇÃO DE MICROPIPETAS

1. Introdução
A medida de volumes é extremamente importante, garantindo que a quantidade dos insumos
utilizados (i.e. reagentes, amostras, meios, etc) seja conhecida e controlada. Para obter volumes com
excelentes níveis de confiança é necessário, além de o operador utilizar as técnicas adequadas, da
calibração do equipamento de medida.
Considerando que as micropipetas são instrumentos que medem volumes na escala de
microlitros e estão suscetíveis ao desgaste mecânico, bem como às condições de temperatura,
exposição à luz e à atmosfera laboratorial, merecendo muito cuidados na sua operação,
condicionamento, necessitando de checagens e calibrações periódicas.
Este roteiro apresenta os procedimentos mais básicos para verificação e calibração de
micropipetas com base nas normas ISO 8655-6:2002. A técnica utilizada é a gravimetria, onde a massa
de água destilada dispensada pela micropipeta é medida com muita exatidão em uma balança analítica
apropriada e o valor medido é convertido em volume, possibilitando verificar se o volume dispensado
está adequado. Esta conversão depende de fatores como a temperatura, empuxo do ar, densidade do
peso de calibração, perdas por evaporação, umidade do ar, dilatação térmica da micropipeta, entre
outros que precisam ser considerados cuidadosamente.

2. Materiais
2.1. Vidrarias e acessórios
 Micropipeta a ser calibrada
 Ponteiras compatíveis com micropipeta – limpas e secas
 Barca de pesagem ou béquer de 10 – 25 mL
 Béquer de 50 mL
 Pissete com água destilada
 Papel higiênico
 Pipeta de Pasteur
 Peso de calibração de balança

2.2. Equipamentos
 Balança analítica – ligada com antecedência de 30 min ou tempo necessário para estabilização
recomendado pelo fabricante
 Termômetro digital com resolução de 0,1oC ou similar.
 Barômetro
 Higrômetro

2.3 Reagentes
 Água destilada

3. Recomendações gerais
 Manter o laboratório previamente climatizado preferencialmente à 20 oC antes das medidas, sendo
que a temperatura deve estar constante durante medidas na faixa de 15 - 30oC.
 A umidade do ar deve ser inferior a 50%
 Transferir cerca de 30 mL de água para o béquer de 50 mL e monitore constantemente a
temperatura da água
 A balança analítica deve ser ligada com antecedência de 30 min ou tempo necessário para
estabilização recomendado pelo fabricante.
 .Limpe a balança analítica antes e após o uso, com auxílio de um pincel para remover partículas
sólidas ou com papel higiênico para remover líquidos.
 Verifique se a balança analítica está bem nivelada.
 A balança deve apresentar a resolução adequada para cada faixa de volume, conforme indicado na
Tabela 1 abaixo.

Tabela 1. Requisitos para a balança analítica usada na calibração de micropipetas.

Volume da micropipeta testada (µL) Resolução da balança (mg)
1 - 10 0,001
10 – 100 0,01
100 – 1000 0,1
1000 – 10000 0,1

Parte Experimental
4.1. Calibração da balança analítica
 Caso a balança não esteja nivelada, ajustes os "pés" da balança até que a bolha de aferição do nível
esteja centralizada.
 Pressione o botão de tara.
 Reserve o peso de calibração da balança, manipulando-o pela embalagem até o uso.
 Pressione o botão de calibração ("Cal") e siga a instruções (vai ser solicitado para manter a balança
vazia para medir o peso "0,0000 g" e em seguida vai ser solicitado para inserir o peso de "100,0000
g")
 IMPORTANTE: O peso de aço inox não pode ser manipulado com as mãos nem deixado
sobre a bancada. Use um papel higiênico limpo para manipular o peso e devolva o peso para
sua embalagem após o uso.
 Aguarde a balança indicar que está calibrada.

4.2. Calibração da micropipeta

4.2.1. Cuidados e resumo na técnica de uso da micropipeta
 Verifique se a faixa de volume de trabalho da micropipeta é adequada para o volume a ser medido.
 Utilize as ponteiras compatíveis para cada tipo de micropipeta, previamente limpas e secas.
 A micropipeta deve mantida na posição vertical durante aspiração do líquido.
 A micropipeta não deve ser mantida na posição horizontal conectada com uma ponteira já
utilizada, sob o risco do líquido da ponteira contaminar o mecanismo da micropipeta.
 Para medida de volume pelo modo direto, siga atentamente a sequência ilustrada na Figura 1.

Figura 01. Ilustração da sequência de passos para tomada e dispensa de volumes utilizando
micropipeta

4.2.2. Calibração da micropipeta

 Coloque a barca de pesagem ou o béquer de para a balança analítica
 Com auxílio de pipeta de Pasteur, transfira para a barca de pesagem ou o béquer um volume de
água destilada a ser utilizada na calibração que corresponda a cerca de 3 mm filme de líquido.
 Tare a balança até obter 0,0000 g com estabilidade.
 Ajuste a micropipeta para o volume desejado (normalmente volume máximo da sua faixa de
trabalho) e coloque uma primeira ponteira
 Pipete e descarte o líquido por cinco vezes, troque a ponteira e repita esse procedimento.
 Transfira todo o volume pipetado para a barca de pesagem ou béquer tocando levemente as
paredes, com cuidado para a ponteira não ter contato com o líquido já existente na barca de
pesagem ou béquer.
 Feche as portas da balança, aguarde a medida se estabilizar e anote a massa obtida e a temperatura
da água utilizada em no Quadro 01.
 Tare a balança e repita processo por mais 9 x, realizando as anotações necessárias.

Quadro 01. Planilha para calibração de micropipeta

Data: Marca: Faixa de volume: Operador

Temperatura, oC Massa, g Volume 20oC, µL

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
Desvio padrão
Conclusão:
( ) Micropipeta calibrada
( ) Micropipeta descalibrada

Cálculos:
Para o cálculo do volume, a partir da medida de massa de água destilada, é necessário consultar o fator
de correção Z para a temperatura da água medida (Quadro 02) e utilizar a fórmula abaixo:
V (µL) = m (g) x Z x 1000
Registre os valores de volumes calculados e padronizados para 20 oC no Quadro 01 acima, calcule o
volume médio e desvio padrão.
Análise dos resultados:
Compare o volume médio obtido com os valores de referência listados no manual da micropipeta ou,
alternativalemte, aqueles do Quadro 03 e conclua se a micropipeta está calibrada ou descalibrada. Os
valorer de referência do manual são os mais indicados para averiguar as especificações da micropipeta.
Quadro 02. Fator de correção Z para volume ocupado por 1,000 g de água, pesada na presença de ar a
1 atm (101,3 kPa), empregando-se calibração com massa padrão de aço inoxidável.
Fator de correção Z, Fator de correção Z,
o Temperatura, oC
Temperatura, C mL/g mL/g
Corrigido para 20oC Corrigido para 20oC
15 1,0020 22,5 1,0034
15,5 1,0020 23 1,0035
16 1,0021 23,5 1,0036
16,5 1,0022 24 1,0038
17 1,0023 24,5 1,0039
17,5 1,0024 25 1,0040
18 1,0025 25,5 1,0041
18,5 1,0026 26 1,0043
19 1,0027 26,5 1,0044
19,5 1,0028 27 1,0045
20 1,0029 27,5 1,0047
20,5 1,0030 28 1,0048
21 1,0031 28,5 1,0050
21,5 1,0032 29 1,0051
22 1,0033 29,5 1,0052
30 1,0054

Quadro 03. Tolerâncias admitidas típicas para as diferentes micropipetas.

Volume nominal (µL) Erro sistemático máximo Tolerância máxima admissível
admissível (µL) (µL)
1 ±0,05 0,95 - 1,05
5 ±0,125 4,875 - 5,125
10 ±0,12 9,88 - 10,12
20 ±0,2 19,8 - 20,2
50 ±0,5 49,5 - 50,5
100 ±0,8 99,2 - 100,8
200 ±1,6 198,4 - 201,6
500 ±4,0 496 - 504
1000 ±8,0 992 - 1008
5000 ±40 4960 - 5040
10000 ±60 9940 - 10060

4.3. Recalibração
 Localize a chave de ajuste para recalibração na caixa da micropipeta.
 Posicione a chave nos orifícios do anel de calibração (Figura 02).
 Gire a chave no sentido anti-horário para diminuir o volume e no sentido horário para aumentar o
volume.
 Para checagem, repita resumidamente as principais etapas de calibração, sem repetir por 10 x.
 Caso o volume obtido esteja dentro da faixa de tolerância adequada, realize a calibração completa.
 Caso contrário, use a chave de calibração para aumentar ou diminuir o volume.
 Repita a checagem e ajuste do volume até que o volume obtido esteja dentro da faixa de tolerância
aceitável.
 Realize a calibração completa e registre os resultados no Quadro 01, armazenando-os para controle
de qualidade.
 Algumas micropipetas apresentam procedimento de recalibração mais específico, sendo necessário
seguir as instruções do manual.

Figura 02. Recalibração de micropipeta.

5. Bibliografia
ISO 8655-6. Piston-operated volumetric apparatus—Part 6: gravimetric methods for the determination
of measurement error. 2002.
Skoog, D. A.; West, D. M.; Holler, F. J.; Fundamentos da Química Analítica, 8ª. ed, Thomson
Learning, 2005.