Daniel Olindo de Castro Linhares

TREINAMENTO FÍSICO MELHORA DISFUNÇÃO MICROCIRCULATORIA

RENAL ASSOCIADA À DIABETES VIA DIMINUIÇÃO DOS PRODUTOS
FINAIS DE GLICAÇÃO AVANÇADA

NOV
A IGUAÇU-

RIO DE JANEIRO
2023
 Daniel Olindo de Castro Linhares

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade do Grande Rio “Prof. José de Souza
Herdy”, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Biomedicina.

Orientador: Drª Anissa Daliry

Coorientador: MSc Karine Lino Rodrigues

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2023
TREINAMENTO FÍSICO MELHORA DISFUNÇÃO MICROCIRCULATORIA
RENAL ASSOCIADA À DIABETES VIA DIMINUIÇÃO DOS PRODUTOS
FINAIS DE GLICAÇÃO AVANÇADA

Trabalho de Conclusão de
Curso apresentado à
Universidade do Grande Rio
“Prof. José de Souza Herdy”,
como requisito parcial para a
obtenção do título de Bacharel
em Biomedicina.

Orientador: Drª Anissa Daliry

Coorientador: MSc Karine Lino
Rodrigues

Aprovada em:
Nova Iguaçu de
de 2024.

BANCA EXAMINADORA

Drª Anissa Daliry (orientadora)

LISTA DE FIGURAS

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SUMÁRIO

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2023
 TREINAMENTO FÍSICO MELHORA DISFUNÇÃO MICROCIRCULATORIA
RENAL ASSOCIADA À DIABETES VIA DIMINUIÇÃO DOS PRODUTOS
FINAIS DE GLICAÇÃO AVANÇADA
Daniel Olindo de Castro Linhares 1
Karine Lino Rodrigues 2
Anissa Daliry 3

Resumo

A nefropatia diabética (ND) é uma das complicações microvasculares mais frequentes do diabetes tipo 2
(T2D). Acredita-se que o estresse oxidativo seja responsável por induzir a formação de produtos finais de
glicação avançada (AGEs), o que poderia contribuir para ND. No presente estudo tivemos o objetivo de
estudar os efeitos do treinamento aeróbico na microcirculação renal e os mecanismos subjacentes,
incluindo a modulação da via dos produtos finais de glicação avançada e estresse oxidativo em
camundongos com T2D. A T2D foi induzida pela alimentação de camundongos C57BL/6 com uma dieta
rica em gordura e carboidrato por 24 semanas. Nas 12 semanas seguintes, um subgrupo dos camundongos
T2D foi submetido ao treinamento físico aeróbico (T2D EX). Ao final do protocolo foram avaliados o
peso corporal, pressão arterial sistólica, homeostase glicêmica, níveis de AGEs e dano oxidativo, além da
microcirculação renal, que foi avaliada por fluxometria com laser speckle contrast imaging (LSCI). O
grupo T2D EX apresentou uma diminuição no peso corporal, pressão arterial e melhora no metabolismo
da glicose em comparação com o grupo T2D. No rim, o treinamento físico reverteu a diminuição de fluxo
microvascular basal, aumento dos níveis de AGEs e da peroxidação lipídica, observados no grupo T2D.
Nas análises de correlação de Pearson houve uma correlação negativa entre os níveis de AGEs e o fluxo
microvascular renal.O treinamento físico pode ser um potencial tratamento não farmacológico para
disfunção microcirculatória e complicações metabólicas associadas ao T2D, via diminuição da deposição
renal de AGEs e do estresse oxidativo no rim.

Palavras-Chave: Nefropatia diabética, produtos finais de glicação avançada e treinamento físico

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1.Introdução

A diabetes é um dos maiores problemas de saúde pública da atualidade,

estima-se que possa afetar mais de 300 milhões de pessoas no mundo (Martínez-
Castelão et al. 2015). A diabetes tipo 2 (T2D) é um termo comum para distúrbios
metabólicos heterogêneos, e sua principal característica é a hiperglicemia, a qual
é responsável por desencadeiar diferentes tipos de complicações que quando
agravadas promovem inúmeras disfunções no organismo (Yiwen Li et al. 2023).
Sendo assim, à medida que a doença progride, aumenta o risco de desenvolver
complicações macro e microvasculares, os quais representam a maior causa de
morbidade e mortalidade dessa população (Dan Wu et al. 2023). A nefropatia
diabética (ND) é uma das complicações microvasculares mais frequentes do
T2D e a maior causa de insuficiência renal (Thomas et al. 2015). Com isso, uma
vez gerado alterações na homeostase glicêmica isso levará a alterações
funcionais e estruturais nos rins, através do aumento dos rins, hipertrofia
glomerular e aumento da taxa de filtração glomerular (Tampe e Zeisberg 2014).
Já foi demonstrado que a modificação na dieta de camundongos pode levar ao
desenvolvimento da NF [32566684]. Sánchez-Lozada et al. demonstraram que a
administração de frutose na água potável ou na dieta foi capaz de distúrbios
renais caracterizados por hipertrofia renal, arteriolopatia, hipertensão glomerular
e vasoconstrição cortical [16940562]. Já Deji et al. observaram que uma dieta
com 60% de gordura por 12 semanas em camundongos C57BL/6 foi capaz de
induzir lesões renais subsequentes, incluindo albuminúria, aumento na área do
tufo glomerular e aumento do acúmulo de colágeno tipo IV nos glomérulos,
expansão mesangial e comprometimento do manuseio de sódio [18971213].
Portanto, a prevenção de alterações renais e/ou ND é fundamental para melhorar
os resultados cardiorrenais em pacientes com diabetes. Para desenvolver uma
estratégia preventiva contra a NF nesses pacientes, é essencial esclarecer as
alterações renais na diabetes, incluindo o estresse oxidativo, inflamatório e da
função endotelial. No entanto, estes ainda não foram completamente avaliados e
os mecanismos pelos quais o diabetes pode influenciar a disfunção renal ainda
não é completamente entendido.
Vários estudos sugerem que os produtos finais de glicação avançada, ou
AGEs (do inglês, Advanced Glycation End Products), desempenham um papel
nas complicações relacionadas ao diabetes (Souza et al. 2000, Mulrenann et al.
2015, Indyk et al.2021). AGEs são proteínas modificadas pela ação de açúcares
redutores, de forma não enzimática, que são formados ao longo da vida, porém
aumentados em situações de estresse oxidativo e hiperglicemia, e que podem
danificar os tecidos (Singh et al. 2001; Nowotny et al.2015; Dariya E Nagaraju
2020). Os AGEs são capazes de promover disfunção no meio intracelular e
extracelular por meio de sua capacidade de se ligar ao colágeno outras proteínas
de membrana de forma irreversível, e também ao seu principal ligante, receptor

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dos produtos finais de glicação avançada (RAGE) (Sims et al.1996, Goldin et
al.2006). Após a ligação entre AGE-RAGE acontecer, genes envolvidos no
estresse oxidativo, inflamação, trombose e recrutamento de leucócitos são
ativadas (Sayej et al.2016, Guimarães et al.2010). Recentemente o nosso grupo
demonstrou que apesar de animais alimentados com uma dieta hipercalórica não
apresentarem alteração na expressão dos genes eNOS, VCAM e RAGE e no
conteúdo de AGEs fluorescentes, os mesmos apresentaram disfunção endotelial
e diminuição da defesa antioxidante (Silvares et al.2019). Além disso, a
toxicidade dos Ages nos Rins também é vista com prejuízo na função glomerular
sendo uma das principais causas contribuintes para progressão da doença, como
mostra no trabalho de Chiang et al. portanto, acredita-se que eixo AGE-RAGE
está envolvido na patogênese e progressão da disfunção vascular no T2D.
Sabe-se que a implementação de uma dieta balanceada, rica em alimentos
nutritivos e pobre em açúcares simples e gorduras saturadas, é fundamental na
prevenção ou retardamento do desenvolvimento de complicações decorrentes do
DM2, e que a associação regular com exercício físico tem impactos positivos na
saúde metabólica desses indivíduos (Kirwan et al. 2017, Balducci et al. 2014,
Hamasaki et al. 2018). Essas mudanças de hábitos podem levar a uma melhora a
sensibilidade à insulina, a hemoglobina glicosilada, pressão arterial, parâmetros
glicêmicos e gordura corporal (Poblete-Acro et al. 2018, Amanat et al. 2020).
Recentemente o nosso grupo demonstrou que o treinamento físico foi capaz de
melhorar a função microvascular, os parâmetros de estresse oxidativo e a via
AGE-RAGE no fígado e tecido adiposo de camundongos diabéticos (Rodrigues
et al. 2018). Sendo assim, vários mecanismos moleculares e metabólicos
parecem estar envolvidos nos efeitos benéficos do treinamento na T2D, mas os
mecanismos subjacentes que contribuem para melhorias na função da
microcirculação renal permanecem obscuros.
Desta forma, o objetivo do nosso trabalho foi estudar os efeitos do
treinamento aeróbico na microcirculação renal e os mecanismos subjacentes,
incluindo a modulação da via dos produtos finais de glicação avançada e estresse
oxidativo em camundongos com DM2.

2. MATERIAIS E METODOS

2.1 PROTOCOLO EXPERIMENTAL: O estudo foi realizado em conformidade

com os princípios internacionalmente reconhecidos para o Cuidado e Uso de
Animais de Laboratório, sendo aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais (CEUA) da Fundação Oswaldo Cruz (Licença nº L0012/18 A1).
Utilizou-se um total de 23 camundongos C57BL/6 provenientes do biotério
central da Fundação Oswaldo Cruz. Os animais, com idade de 8 semanas, foram

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alojados em gaiolas padrão com temperatura controlada (22 ± 1 °C) e ciclo de
luz/escuro de 12 horas (início do escuro às 18h).
Os camundongos foram divididos em dois grupos distintos: aqueles que
receberam uma dieta comercial (CTL) e os que receberam uma dieta
hipercalórica e hiperlipídica (HCHF). A dieta HCHF consistiu em uma
formulação modificada da ração comum, com teores de 55% de lipídeo (banha
de porco), 34% de carboidrato e 10% de proteína (%kcal), acrescida de 25% de
frutose na água de consumo (Panchal et al.2011). Em contrapartida, a dieta CTL
foi composta por 13% de lipídeo, 66% de carboidrato e 21% de proteína
(%kcal). Após 24 semanas, os camundongos alimentados com dieta HCHF
foram divididos em dois grupos. com base no exercício: T2D (dieta HCHF mais
25% de frutose sem exercício físico, n=10) e T2D EX (dieta HCHF mais
exercício físico com 25% de frutose, n=10). O regime de exercícios físicos
consistiu em corrida em esteira ergométrica, realizado três vezes por semana,
com sessões de 30 minutos cada, a uma intensidade de treinamento
correspondente a 80% da velocidade máxima atingida no teste de velocidade
progressiva até a exaustão. Ao término do protocolo (36 semanas), os
camundongos de todos os grupos (CTL, T2D e T2D EX) foram submetidos a
diversas análises in vivo, incluindo Teste de Tolerância à Glicose (TOTG),
avaliação da pressão arterial, ultrassonografia hepática e microcirculação
hepática. Em seguida, os animais foram submetidos à punção cardíaca para a
coleta de sangue total, eutanásia e coleta de órgãos. O soro foi separado por
centrifugação a 700xg por 15 minutos a 4°C e as alíquotas foram armazenadas a
-80°C para análises futuras.

2.2 Determinação da capacidade máxima de exercício: para estabelecermos a

capacidade máxima de exercício, foi realizado um teste de exaustão em esteira
ergométrica com velocidade progressiva ao final da 24ª semana. O teste iniciou
com velocidade de 10m/min e a cada 3 minutos a velocidade aumentava em
3m/min ate que a exaustão dos animais fosse certificada. Sendo a exaustão
estabelecida quando o ritmo dos animais decaia e permaneciam no final do
tapete na grade de choque por 5 segundos. Durante o teste, a velocidade máxima
que obtivemos determinou a intensidade do treinamento (80% do teste), os
animais foram adaptados na semana anterior, na esteira por três sessões seguidas
com duração de 15 minutos a velocidade de 12m/min.

2.3 Treinamento físico: O exercício teve duração de 12 semanas, iniciando na

24ª semana de alimentação dietética (HFHC) (Machado et al.2017). Os animais
foram exercitados na parte da manha (8h às 12h) em esteira ergométrica (modelo
HT 2.0; Hestoron Fitness Equipments) durante 30 minutos por dia e três vezes

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por semana. Como uma forma de indução a corrida foi utilizado uma grade de
choque que fornece baixas correntes elétricas 2 mA.

2.3 Pressão arterial: Os animais foram adaptados no recipiente de contenção

antes da primeira aferição, de forma que minimizasse o estresse e possíveis
varrições de pressão. E como medida de pressão arterial não invasiva na cauda,
foi utilizado a técnica de fotoplestismografia com aquisição automática de
dados (EFF 306, insight). O protocolo de aferição de teve inicio com
aquecimento prévio dos animais a temperatura de 36ºC durante 20 minutos, em
estufa com temperatura controlada. Em seguida os animais foram colocado no
pletismografo para o inicio da aferição da pressão.

2.4 Medição da glicemia em jejum: Os animais ficaram de jejum por 12 horas,

após foram coletadas alíquotas de sangue da ponta da cauda para analise dos
níveis de glicose no sangue, a analise foi feita utilizando o glicômetro (Accu-
Chek Active, Roche Diabetes Care Brasil).

2.5 Teste oral de tolerância à glicose (TOTG): O TOTG foi feito após 6 horas de
jejum, sendo administrado glicose via oral na dose de 2g/Kg para todos os
animais. As medições ocorreram nos tempos 0,15,30,60 e 120 minutos após
administração da glicose, aonde mais uma vez foi utilizado o glicômetro (Accu-
Chek Active, Roche Diabetes Care Brasil).

2.6 Marcadores bioquímicos: foram avaliados os níveis séricos de colesterol

total, colesterol HDL e LDL, triglicerídeos, albumina e atividade das enzimas
ALT e AST onde foram analisados utilizando kits comerciais (Bioclin, Belo
Horzonte, MG, Brasil) e analisados por espectrofotometria.

2.7 Laser Speckle: O fluxo sanguíneo microvascular renal foi medido por meio
de imagens de contraste com laser speckle (LSCI) (Periscam PSI system,
perimed, Suécia), que fornece um índice de perfusão microcirculatória
equivalente à concentração e velocidade média de eritrócitos que são usados
para fornecer a análise de fluxo microvascular em tempo real. O procedimento é
feito com os animais mobilizados e posicionados em uma superfície firme, na
sala onde ocorre o procedimento a temperatura foi controlada com 25ºC, os
animais foram posicionados abaixo da luz do laser com contraste de imagem
com o comprimento de onda em 785 nm para a medição da perfusão do tecido
renal. O fluxo sanguíneo foi expresso em unidades arbitraria de perfusão

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(APUs), a distancia entre a base de varredura e a superfície do tecido foi de
aproximadamente 10cm.

2.8 Substância reativa ao ácido tiobarbiturico: O dano renal foi determinado

através da quantificação da substancia reativa ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
foi utilizado o método de espectrofotométrico baseado na concentração de
malondialdeido (MDA), um produto da peroxidação lipídica. A homogeneização
foi feita em hidroxitolueno butilado (BHT), com concentração de 0,2%, em
solução salina com tamponamento em fosfato fria (PBS, pH 7,4). Cada amostra
teve seu tubo selado e incubado a 96ºC por 30 min após adição igual do volume
de ácido tiobarbitúrico 0,67% (sigma EUA) ás amostras no volume de 0,5mL.
Para medidas espectrofotométricas, 200 microlitros de cada amostra foram
avaliados a 535 nm utilizando um leitor SpectraMax Plus (Molecular Devices,
EUA).
2.9 Atividade antioxidante da superóxido dismutase (SOD) e da catalase (CAT):
A superóxido dismutase foi determinada através do monitoramento a inibição da
autooxidação da epinefrina (Sigma EUA) usando o espectrofotômetro
(Molecular Devices EUA) em comprimento de onda de 530mn. As amostras
foram avaliadas durante 3 minutos a 30ºC e comprimento de onda de 230 mn. A
atividade da catalase foi avaliada através da medida no espectrofotômetro
(Molecular Devices EUA) diminuindo a concentração de hidrogênio.

2.10 Imunohistoquimica: Os cortes desparafinizados foram tratados com H2O2 a

3% e depois bloqueados com leite em pó desnatado a 5% e BSA a 5%. As
secções foram então lavadas com PBS e incubadas durante a noite numa câmara
humidificada a 4 °C com um anticorpo monoclonal primário contra RAGE
(1:200, sc-365154, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) e CML
(1:200, ab125145, Abcam, Cambridge, U.K) de camundongo. As lâminas foram
lavadas em PBS e tratadas com anticorpo secundário biotinilado, seguido de
incubação com estreptavidina peroxidase. A diaminobenzidina (DAB) foi usada
como cromógeno. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina de Mayer. O
software ImageJ foi utilizado para quantificação de imunocoloração (ImageJ,
EUA).2.11 Niveis de produtos finais de glicação/lipoxidação: Os AGEs
florescentes foram quantificados através do método de Nakayama. A
fluorescência da amostra foi medida contra o branco (NaOH 0,1N) em um
comprimento de onda de 440 nm e uma excitação comprimento de onda de
370nm usando um leitor de microplacas SpectraMax M5 Elisa (Molecular
Devices EUA). Uma unidade de fluorescência foi equivalente a intensidade de
fluorescência de 1mg/mL de albumina sérica bovina nativa (BSA) e expressa em
unidades arbitrarias (UA).

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2.12 Histologia: Os rins foram fixados em solução formalina tameponada com
fosfato de Milloning a pH 7,2, sendo processados e posto em parafina para
microscopia de com coloração hematoxilina e eosina (HE) e tricromo de
masson. Foram feitos e analisados quatro cortes histológicos de quatro animais
por grupo.

2.13 Análises estatísticas: Os resultados foram expressos em medias ± DP para

cada grupo e as comparações entre os grupos foram feitas utilizando o ANOVA
two way seguido do pós teste de Bonferroni (GraphPad InStat 8.0, GraphPad
Software Inc., La Jolla, USA). Valores de p<0,03 foram considerados
significativos.

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