kasvi.com.

br
@microbiologia.pratica
 Biólogo

 Microbiologista

 Especialista em Controle de Qualidade e Microbiologia de Alimentos

 Especialista em Gestão da Qualidade

 Fundador do Canal Microbiologia Prática e Consultor pela Diagnóstica

 Carreira desenvolvida em laboratórios clínicos, hospitais e multinacionais de alimentos e bens de consumo

 Mais de 8.000 alunos em 2 anos de trabalho digital com Microbiologia

Dinâmica do Treinamento

Identificação
Introdução a Microscopia Identificação
de Fungos
Micologia Direta de Leveduras
Filamentosos
Introdução a Micologia
Características gerais dos fungos Introdução à micologia

Em geral as infecções fúngicas não apresentam gravidade, exceto se o

sistema imunológico esteja comprometido.

Nas últimas décadas têm sido relatadas com maior frequência

(possivelmente) por algumas razões:

1. Uso de medicamentos (corticoides, imunoterápicos etc.)

2. Doenças como AIDS, leucemia, diabetes, linfomas, queimaduras

extensas etc..
Características gerais dos fungos Introdução à micologia

Infecções fúngicas são descritas como:

• Oportunistas: agente geralmente não patogênico que por alguma

razão instala um processo infeccioso;

• Primárias: organismo está iniciando uma reação contra um agente

indesejável;

Podem ainda ser classificadas como:

• Localizadas: acomete áreas/sítios específicos do corpo

• Sistêmicas: quando afetam várias partes do corpo

 Características gerais dos fungos Estruturas vegetativas: hifas septadas e hifas
cenocíticas

• Hifas: longos filamentos de células conectadas.

• Hifas septadas: hifas contém paredes cruzadas (septos) que

separam as hifas em unidades semelhantes a células uninucleadas
distintas (maioria dos fungos).

• Hifas cenocíticas: as hifas não possuem septos e se apresentam

como células longas e contínuas com vários núcleos (algumas
classes).

• Hifas vegetativas: porção de uma hifa responsável por obter

nutrientes.

• Hifas reprodutivas ou aéreas: hifas envolvidas na fixação ao

substrato e reprodução (se projeta acima da superfície do meio
onde o fungo está crescendo).
Características gerais dos fungos Características das hifas
Características gerais dos fungos Estruturas vegetativas: micélio
Vegetativo: referente à nutrição e
crescimento!!
Micélio é a parte vegetativa de um fungo, consiste de uma massa de
ramificação formada por um conjunto de hifas emaranhadas, é
responsável por carregar os nutrientes até onde o fungo precisa.

1. Micélio vegetativo: é a parte correspondente a sustentação e

absorção de nutrientes, se desenvolvendo no interior do
substrato.

2. Micélio reprodutivo: parte do micélio que se projeta na superfície

(micélio aéreo) e se diferencia para sustentar os corpos de
frutificação ou propágulos.
 Características gerais dos fungos Hifas aéreas e hifas vegetativas

Além de fixação ao substrato, as hifas têm as funções de:

• reprodução
• digestão extracelular

Como os fungos são heterótrofos, ou seja, não produzem seu

próprio alimento e se alimentam principalmente das substâncias
orgânicas do substrato onde vivem, as hifas libertam através da
sua parede celular as enzimas necessárias à degradação dos
carboidratos e absorvem os nutrientes necessários ao seu
metabolismo.

No caso das micorrizas e dos fungos parasitas, as hifas invadem

os tecidos das raízes ou dos hospedeiros cumprindo um papel
semelhante.
 Características gerais dos fungos Hifas aéreas e hifas vegetativas

Do ponto de vista da reprodução, as hifas atuam na reprodução assexuada:

• produzindo gomos ou brotos, ou ainda se ramificando, ou no caso de hifas
aéreas, corpos reprodutivos como o Conídio, que produzem conidiósporos,
existindo vários tipos diferentes.
Na reprodução sexuada, observa-se o fenômeno da plasmogamia:
• células de duas hifas ou da mesma hifa se conjugam (troca de material
genético entre 2 células) e produzem um zigoto, que é o único corpo
diploide destes seres, onde após meiose (divisão celular) se formam
esporos haploides.
Características gerais dos fungos Hifas aéreas e hifas vegetativas
Características gerais dos fungos Leveduras
• Fungos unicelulares, não filamentosos, geralmente esféricos ou ovais.
• Reprodução por brotamento (Saccharomyces), ou fissão (Schizosaccharomyces)
e algumas espécies podem formam pseudo-hifas (brotos que não se separam
uns dos outros originando uma pequena cadeia de células). Ex.: Candida
albicans).
Características gerais dos fungos Fungos dimórficos

São fungos que exibem a capacidade de crescer tanto na forma

filamentosa como na forma leveduriforme.

Na forma filamentosa produz hifas aéreas e vegetativas e na forma

leveduriforme se reproduz por brotamento.

O dimorfismo é dependente da temperatura e tensão de oxigênio

(Ex.: Mucor indicus):

• a 37°C o fungo adquire a forma de levedura e a 25°C a forma de

bolor.

• na presença de oxigênio exibe crescimento leveduriforme e na

ausência ou sob uma baixa tensão de oxigênio o fungo assume
um crescimento filamentoso.
Características gerais dos fungos Fungos dimórficos
 Características gerais dos fungos Esporos assexuados

São produzidos pelos fungos por mitose e posterior divisão

celular, não há fusão de núcleos de células.

Tipos:

• Conidiósporo ou conídio: esporo unicelular ou multicelular

que não é envolvido por uma bolsa (produzidos em
cadeias na extremidade do conidióforo) . Ex.: Aspergillus e
Penicillium.

Aspergillus
Penicillium
 Características gerais dos fungos Esporos assexuados

• Artroconídio: conídios formados pela fragmentação de uma hifa septada em células únicas. Ex.: Trichosporon.

Trichosporon sp. corado em lactofenol azul algodão

 Características gerais dos fungos Esporos assexuados

• Blastoconídios: são formados a partir de um broto originado de uma célula parental. Ex.: Candida albicans e Cryptococcus.

• Clamidoconídeos: é um esporo de paredes espessas formado pelo seu arredondamento e alongamento no interior de um
segmento de hifa. Ex.: Candida albicans
 Características gerais dos fungos Esporos assexuados

• Esporangiósporos: são esporos formados no interior de uma bolsa, o esporângio, na extremidade de uma hifa aérea
chamada de esporangióforo. Ex.: Rhizopus e Mucor.
Microscopia Direta
 Exame microscópico direto com hidróxido de
potássio (KOH) a 20%

Microscopia
Técnica utilizada para exame de pelos, pele, unha, tecido obtido
por biópsia, exsudatos espessos e outros materiais densos.

Execução da técnica:
1. Colocar 1 gota de KOH (aquoso a 20%) sobre uma lâmina e
em seguida adicionar a amostra a ser analisada
2. Cobrir a preparação com lamínula e aquecer ligeiramente
para intensificar a clarificação sobre chama de bico de
Bunsen (sem levantar fervura)
3. Aguardar perto de 20’
4. Observar ao microscópio com objetiva de 10x e 40x.
 Exame microscópico direto com hidróxido de
potássio (KOH) a 20%

Execução da técnica:
1. Colocar 1 gota de KOH (aquoso a 20%)
sobre uma lâmina e em seguida adicionar
a amostra a ser analisada
2. Cobrir a preparação com lamínula e
aquecer ligeiramente para intensificar a
clarificação sobre chama de bico de
Bunsen (sem levantar fervura)
3. Aguardar perto de 20’
4. Observar ao microscópio com objetiva de
10x e 40x.

Imagem: Thais Avila Fernandes Catan

 Exame microscópico pelo método de Gram

Microscopia Todos os fundos são Gram-positivos.

A utilização desse método não visa a diferenciação do fungo,
mas irá possibilitar discriminar elementos e estruturas fúngicas
de artefatos existentes em amostras de:
• Urina
• Secreções
• Fezes
Execução da técnica:
• Distribuir em uma lâmina de forma homogênea a amostra a
ser analisada, em movimentos circulares
• Fixar com calor o esfregaço
• Submeter à técnica e observar ao microscópio

Imagem: Thais Avila Fernandes Catan

Identificação de Leveduras
 Métodos clássicos
Identificação de Leveduras

1. Detecção por exame direto

2. Subcultivo

3. Técnica de esgotamento

4. Provas bioquímicas e fisiológicas

5. Meios seletivos (cloranfenicol para inibição de

bactérias e cicloheximida para inibição de fungos
anemófilos/saprófitos – dispersados pelo ar
atmosférico)
 Análise morfológica
Identificação de Leveduras

Colônias de levedura obtidas de amostra biológica só devem ser

identificadas quando estiverem puras (sem contaminação bacteriana
ou em mistura de espécies).

De cada colônia deve ser feito um repique em ASD para sua

identificação morfológica e confirmação da sua pureza por
microscopia.

Para isolamento e identificação presuntiva ao mesmo tempo de

algumas espécies de Candida mais frequentes, está disponível no
mercado o meio comercial Chromagar Candida®.
 Análise morfológica: macromorfologia em meios
Identificação de Leveduras cromogênicos
 Exame microscópico direto com tinta-da-china
(nanquim)

Microscopia
Técnica utilizada em amostras de LCR, urina, secreções ou
exsudatos para pesquisa de leveduras capsuladas do gênero
Cryptococcus.

Execução da técnica:
1. Na proporção de 1:1, colocar sobre uma lâmina 1 gota de
nanquim e 1 gota do sedimento da amostra a ser analisada
2. Misturar com auxílio de ponteira ou com a quina da
lamínula
3. Observar ao microscópio com objetiva de 10x e 40x.

Erro comum: confundir linfócitos com células leveduriformes, a diferenciação é feita pela
refringência da parede celular e inclusões no citoplasma das leveduras, além da presença de
brotamentos/células gemulantes.
 Exame microscópico direto com tinta-da-china
Identificação de Leveduras (nanquim)

Também realizada para pesquisa e identificação de

fungos leveduriformes do gênero Cryptococcus.

Pesquisa-se em determinados materiais clínicos a

presença de cápsula (característica marcante deste
gênero).

A técnica baseia-se na diluição da amostra ou 1 alçada da

cultura em 1 gota de nanquim.

A cápsula, constituída de material polissacarídico,

aparece como um halo claro ao redor dos blastoconídios
de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da
lâmina
 Identificação de Leveduras

A provas fisiológica mais comum simples para

identificação de Candida albicans é:

• Prova do tubo germinativo

 Identificação de Leveduras

1. Identificação presuntiva e rápida de Candida albicans

2. Capacidade de formar filamentos na presença de soro (coelho, bovino ou

cavalo)

Execução da técnica:

• 1 alçada da colônia isolada em 0,5mL de soro estéril

• Incubar a 37°C por 3hrs (no máximo)

• Analisar a suspensão ao microscópio

A presença de tubo germinativo, na forma de pequeno filamento que brota do

blastoconídio, sem formar constrição com a célula-mãe, permite a
identificação presuntiva de Candida albicans.
 Identificação de Leveduras Teste da Ureia ou Prova da Urease

Baseia-se na capacidade do fungo em hidrolisar ou não a ureia (Ágar Ureia de

Christensen)

Utilizado na identificação de leveduras como Cryptococcus spp., Trichosporon spp.,

Rhodotorulla spp. e Malassezia pachydermatis.

Teste para diferenciar, por exemplo, criptococose de infecção por cândida:

Cryptococcus neoformans é urease positiva.

• Semear uma alçada da levedura na superfície do meio de urease

• Incubar a temperatura de 35°C +/- 2°C

• Amarela: negativo (C. albicans)

• Cor-de-rosa forte: positivo (Cryptococcus spp., Trichosporon spp. e Rhodotorulla

spp.)
Identificação de Fungos
Filamentosos
Identificação de Fungos Filamentosos
Métodos de Identificação

Basicamente, além da cultura, empregam-se 2 métodos para

identificação de fungos filamentosos:

1. Técnica de esgarçamento (preparação com lactofenol azul

algodão): primeira tentativa (e mais rápida) para identificação
de colônias filamentosas);

2. Microcultivo em lâmina
Identificação de Fungos Filamentosos Coloração de Lactofenol Azul Algodão

• Método mais rápido para identificação dos fungos

filamentosos;

• Pode ser realizada diretamente após a maturação da

colônia fúngica em placa (subcultura) ou do isolado
primário (somente se a cultura estiver pura);

• Desvantagem técnica: estruturas fúngicas são quebradas

durante o preparo tornando ainda mais difícil a sua
identificação.

Penicillium
Identificação de Fungos Filamentosos
Análise microscópica: técnica de esgarçamento preparado com azul de lactofenol

Execução da técnica

1. Realizar todo o processo em cabine de segurança biológica utilizando

os EPIs recomendados;

2. Com alça em L retirar uma porção da colônia do fungo crescida em

ágar (zona intermediária = zona de frutificação) e colocar em uma
lâmina;

3. Colocar 1 a 2 gotas de azul de lactofenol-algodão e cobrir com

lamínula, comprimindo levemente;

4. Observar ao microscópio em aumento de 40x a presença de hifas,

conídios, esporos ou estruturas de frutificação para auxiliar a
identificação do fungo em conjunto com a macromorfologia.
Identificação de Fungos Filamentoso Técnica do Microcultivo para Fungos Filamentosos

• Empregada para identificação de fungos filamentosos por

meio da caracterização dos aspectos macroscópicos;
• Observação de micélios vegetativos, reprodutivos e de
frutificação (utilizado com Ágar Batata, que estimula a
produção de macro e microconídeos e pigmentos que na
maioria das vezes são suficientes para identificar o fungo);
 Identificação de Fungos Filamentoso Técnica do Microcultivo para Fungos Filamentosos

1. Colocar sobre uma lâmina esterilizada, contida em uma placa de Petri

estéril, um cubo de ágar ASD ou ágar batata (mais recomendado por alguns
autores).
2. A lâmina deve estar sobre um suporte, que pode ser formado por outra
lâmina, ou um pequeno bastão de vidro recurvado, ou ainda, dois palitos de
fósforo.
3. Semear o fungo, a partir de repique recente, nos 4 lados do cubo de ágar.
4. Recobrir com uma lamínula esterilizada.
5. Fazer uma câmara úmida, umedecendo um pequeno chumaço de algodão
estéril, para evitar a dessecação do meio de cultura durante o crescimento
do fungo.
6. Tampar a placa e deixar à temperatura ambiente por 7 a 10 dias.

Créditos pelo vídeo: Carolina Queiroz M Pereira

Identificação de Fungos Filamentosos
Técnica do Microcultivo para Fungos
Filamentosos
1. Retirar a lamínula com auxílio de uma pinça, cuidadosamente,
uma vez que nela deverão estar aderidas as hifas e esporos do
fungo.
2. Pingar uma gota de corante lactofenol azul algodão (“Cotton
Blue”) e montar sobre uma outra lâmina.
3. Na lâmina do microcultivo, desprezar o cubo de ágar e, em seu
lugar, pingar outra gota de corante lactofenol-azul algodão e
recobrir com lamínula, para visualizar esporos e hifas também
aderidos à lâmina.
4. Observar em microscópio ótico com objetiva de 40 X, o tipo e cor
da hifa, forma, disposição e formação de esporos.
Glossário
 Glossário

• Artrósporo ou artroconídio: esporo formado pela

desarticulação da hifa de fungos filamentosos ou leveduras.
• Blastosporo ou blastoconídio: esporos formados por
brotamento ou gemulação.
• Bolor: fungo filamentoso, multicelular, constituído de hifas.
• Brotamento ou gemulação: reprodução com divisão de
citoplasma através de estrangulamento.
• Cenocítica: hifa desprovida de septos, o mesmo que hifa
contínua.
• Clamidósporo: estruturas de resistência, constituídas de reserva
nutritiva e membrana bastante espessa, permitindo resistir aos
fatores externos, semelhante aos esporos.
• Conídio: esporo assexuado externo.
• Dimórfico: que apresenta duas formas: leveduriforme e
filamentosa.
 Glossário

• Esporângio: órgão de reprodução assexuada interna,

geralmente em forma de vesícula e contêm inúmeros esporos
denominados de esporangiosporos.
• Hialino: que não tem cor, translúcido, assumindo a cor do
corante utilizado.
• Hifa: reunião de células justapostas, formando estrutura
tubular, filamentosa, que compõe o corpo vegetativo dos
bolores e de alguns gêneros de leveduras (por ex., Candida
spp.).
• Demácio ou demaciáceo: fungos negros que têm pigmento
melanóide (acastanhado), na parede celular.
• Levedura: fungo em regra, unicelular que se reproduz
geralmente por brotamento.
• Tuberculado: com granulações ou nodosidades.
 Referências Bibliografias

Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Microbiologia Clinica para o Controle de Infecção Relacionada a Assistência a
Saúde. Módulo 8: Detecção e identificação de fungos de importância médica. Brasília: Anvisa, 2013.

OPLUSTIL, C. P. et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica 4ª Ed. São Paulo: Sarvier, 2019.

OPLUSTIL, C. P. et al. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica 3ª Ed. São Paulo: Sarvier, 2010.

TORTORA, L. R. Microbiologia 12º Ed. Rio de Janeiro: Artmed, 2017.

KONEMAN, E. W. Diagnóstico microbiológico texto e atlas colorido 7ª Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2017.

https://antigo.saude.gov.br/saude-de-a-z/criptococose

https://www.gov.br/saude/pt-br/assuntos/saude-de-a-a-z/m/mucormicose-fungo-negro

https://antigo.saude.gov.br/saude-de-a-z/paracoccidioidomicose

Powers-Fletcher MV, Kendall BA, Griffin AT, Hanson KE. Filamentous Fungi. Microbiol Spectr. 2016 Jun;4(3). doi:
10.1128/microbiolspec.DMIH2-0002-2015. PMID: 27337469.

Egbuta MA, Mwanza M, Babalola OO. Health Risks Associated with Exposure to Filamentous Fungi. Int J Environ Res Public
Health. 2017 Jul 4;14(7):719. doi: 10.3390/ijerph14070719. PMID: 28677641; PMCID: PMC5551157.
 Obrigado!!
“Nunca sem boas razões admita
um microrganismo como
contaminante porque ele não é
B ru n o B ru n etti
um patógeno aceito.
LinkedIn Nunca sem boas razões aceite um
www.linkedin.com/in/brunobrunetti microrganismo como a causa de
Instagram @microbiologia.pratica
uma doença infecciosa
meramente porque é um
patógeno aceito.”

Carmen Paz Oplustil