QFL1345 – Fundamentos de Espectroscopia e Métodos

Espectroscópicos

Massuo Jorge Kato (Bloco 11 T, sala 1124, 3091-1886/3813, majokato@iq.usp.br)

Material: STOA-USP

Aula 15 de maio de 2023

Programa
Princípios da espectrometria de massas e suas aplicações.
Princípios da espectroscopia RMN uni e bidimensionais: fundamentos,
deslocamentos químicos, constantes de acoplamento, interpretação
de espectros, métodos bidimensionais.
 QFL1345 – Fundamentos de Espectroscopia e
Métodos Espectroscópicos

MÊS / DIA ASSUNTO

Maio
15 Espectrometria de massas. Modos de ionização. Reações de fragmentação.
17 Reações de fragmentação.
22 Resolução de exercícios.
24 Técnicas modernas de EM.
29-31 SBQ (Resolução de exercícios)
Junho
5 Fundamentos de RMN de 1H; Informações obtidas (deslocamento químico,
constantes de acoplamento)
7 Resolução de exercícios
12 Constantes de acoplamento.
14 Constantes de acoplamento.
19 Fundamentos de RMN de 13C.
21 Uso de DEPT 135
26 RMN Bidimensionais; COSY
28 HSQC e HMBC
Julho
03 Resolução de problemas
05 Prova 2
10 Revisões
12 SUB (fechada)REC
LITERATURA

Introduction to Spectroscopy, Fifth Edition (2013)

Donald L. Pavia, Gary M. Lampman, George S. Kriz, and James R.
Vyvyan. Cengage Learning.

Identificação Espectrométrica de Compostos Orgânicos (2019)

Robert M. Silverstein, Francis X. Webster, David J. Kiemle. Editora
LTC.
Leitura sugerida: capítulos do Pavia
Leitura sugerida: capítulos do Pavia
 Leitura sugerida:
capítulos do Pavia
Períodicos especializados em espectrometria de massas:

1. International Journal of Mass Spectrometry

2. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes
3. Journal of Chromatography. A (Electrophoresis, Mass
Spectrometry and other Separation and Detection Methods)
4. Journal of Mass Spectrometry
5. Journal of the American Society for Mass Spectrometry
6. Mass Spectrometry for Biotechnology
7. Mass Spectrometry Reviews
8. Rapid Communications in Mass Spectrometry
 2. Results and discussion
2.1. Isolation and structural analysis of compounds

Compound 1 was isolated as a white amorphous powder, [a]D20 −23.2 (c 0.025,

MeOH).
The positive ion determined the molecular formula of C55H82O21
at m/z 1101.5273 [M+Na]+ (calcd. for C55H82NaO21+, 1101.5246) in high-
resolution electrospray ionization mass spectrometry (HRESI-MS).

https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2023.113688
 General scheme for structural elucidation of novel compounds

Fractionation and
Plant tissue, Extraction by Chromatographic
purification
microorganism stem distillation, Pure profile, melting point,
(solvent extractions,
and etc organic solvent compound boiling point,
column chromatography,
or CO2 refraction index, etc)
HSCC, etc)

Determination of
molecular formula
(elemental analysis
or HRMS)
What about of
known compounds?
Determination of Determination of
absolute configuration
(optical rotation, Or a mix of compounds? functional groups
(IR, UV,
circular dichroisms and R-X) 1
H and 13C NMR)

Determination of Determination of types of carbons

tridimensional structures
or spatial relationships
(J3 1H-1H;
13
C NMR: NOESY, TOCSY)
Determination of
(CH3, CH2, CH, C)
connectivities and planar
and sub-structures
structures (J3 1H-1H;
13 (1H NMR: multiplicities and integration;
C NMR: HSQC; HMBC)
13
C NMR: chemical shifts and DEPT 135)
Determinação de grupos funcionais em
compostos orgânicos

Análise funcional
orgânica

Teste - Teste +

https://www.chemicalbook.com/Article/The-reaction-of-2-4-
Dinitrophenylhydrazine-to-test-the-existing-of-aldehyde-or-ketone.htm
Determinação de grupos funcionais em compostos orgânicos
Teste do bafômetro

A legislação brasileira:

A concentração de álcool no
sangue não deve ser > 0,8 g/L.
(5 mL de álcool puro, que é o
que tem em 1 copo pequeno de
cerveja ou 1/3 dose de uísque).
 Characterization of compounds
(Ex: hydrocarbons)
Physical properties: mp, bp, density, solubility

Chemical properties:
Halogenation,
H+ catalyzed polymerization for alkenes
Acidity of terminal alkynes (reaction with strong bases)

Spectroscopy:
mass spectrometry, infrared,
ultraviolet and 1H NMR
Determinação de grupos funcionais em
compostos orgânicos

Análise funcional
orgânica

IV e UV

RMN de 1H e 13C
 Métodos modernos
Métodos clássicos
 Espectrometria de massas

Informações obtidas:

Massa molecular da substância

Composição isotópica dos átomos
Informações sobre sub-estruturas
Identificação e quantificação de substâncias
 Aplicações de técnicas
espectrométricas/espectroscópicas
• Análises (identificação e quantificação) de moléculas
orgânicas; inorgânicas; macromoléculas;

• Determinação estrutural;

• Aplicações modernas: MRI (RMN); sequenciamento

(EM); forense (EM); ambiental (EM); metabolômica
(EM ou RMN), etc.
 Espectrometria de massas – Histórico
1898: Wien demonstrou que íons positivos podem ser desviados pelo efeito
de campo elétricos e magnéticos
1913: J.J. Thompson descobriu os isópotos do Ne [Ne-20 (90,02%), Ne-21
(0,26%) e Ne-22 (8,82%)]
 Development of Mass spectrometers
1913: Experimentos de J.J. Thompson com isópotos do Ne

http://masspec.scripps.edu/MSHistory/histpers.php
 Espectrometria de massas – Histórico
1898: Wien demonstrou que íons positivos podem ser desviados pelo efeito
de campo elétricos e magnéticos
1913: J.J. Thompson descobriu os isópotos do Ne
1942: Demster & Aston desenvolve a fonte de impacto de elétrons
1942: Primeiro instrumento comercial para análise orgânica
1953: Quadrupolo e ion trap (W. Paul e H.S. Steinwedel, Nobel 1989)
1956: GC-MS
1974: HPLC-MS
1987: Demonstração de MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization)
1988: Demonstração de ESI (ElectroSpray Ionization)
1990: Crescimento explosivo da MS, devido a ESI e MALDI
2002: Nobel para inventores da técnica electrospray (ESI) (Fenn e Tanaka)
The mass analysis process as compared
to the dispersion of light by a prism.
 What is Mass Spectrometry?
John B. Fenn, the originator of electrospray
ionization for biomolecules and the 2002 Nobel
Laureate in Chemistry, probably gave the most
apt answer to this question:

Mass spectrometry is the art of measuring atoms and molecules to determine their
molecular weight. Such mass or weight information is sometimes sufficient,
frequently necessary, and always useful in determining the identity of a species.
To practice this art one puts charge on the molecules of interest, i.e., the analyte,
then measures how the trajectories of the resulting ions respond in vacuum to
various combinations of electric and magnetic fields.

Clearly, the sine qua non of such a method is the conversion of neutral analyte
molecules into ions. For small and simple species the ionization is readily carried
by gas-phase encounters between the neutral molecules and electrons, photons,
or other ions. In recent years, the efforts of many investigators have led to new
techniques for producing ions of species too large and complex to be vaporized
without substantial, even catastrophic, decomposition.
“Electrospray Wings for Molecular Elephants”

Looking on quizzically is Charlie the Caveman, who appears often in

cartoons Fenn included in his book on thermodynamics.

Drawn by his daughter, Marianne Steinberg.

 Componentes de um
espectrômetro de massas
Geração de íons Separação de Detecção
(ionização) íons

◼ Impacto de elétrons ◼ quadrupolo

◼ Ionização química ◼ Ion trap
◼ Electrospray (ESI) ◼ TOF
◼ MALDI

Veja o video (para IE):

https://www.youtube.com/watch?v=22dr-3XDNmQ
Other ion source of ion generations:

AMS APCI APLI APPI CI DAPPI DART DESI DIOS EESI EI ESI FAB FD GD IA ICP LAESI MALDI MALDESI MIP PTR SESI
SIMS SS SSI SELDI TI TS
 Espectrômetros de Massas
(ionização por impacto de eletrons e analisadores por quadrupolo)

Quadrupolo
Mass Spectrometer

=>
 O que será que acontece quando
moléculas em alto vácuo são impactadas
por um bombardeio de elétrons?

• Energia adicional é convertida em rotações, vibrações e

rearranjos, resultando na fragmentação
 Reações de produção de íons em EM
Electrospray
Impacto de elétrons
Protonação

Remoção de elétrons M + H+ [MH]+

– e-
M M+• Cationização

Captura de elétrons M + Na+ [MNa]+

+ e- Desprotonação
M M– •
– H+
MH M–
 Como detectar os pigmentos
antraquinônicos em uma mistura?

Alizarina
Purpurina

Rubiadina
Pseudopurpurina
CO2H
Moodle, Lista 1:
1) O que são alizarinas?
2) Como determinar a presença dessas quatro alizarinas em uma mistura por IV, UV e EM?

Alizarina
Purpurina

Rubiadina
Pseudopurpurina
CO2H
 Análise de uma mistura de compostos em
espectrometria de massas (sem separação cromatográfica)

Alizarina

Rubiadina

Purpurina

Pseudopurpurina
CO2H
Espectrometria de massas com separação cromatográfica

GC-MS

HPLC-MS
 Cromatógrafo a gás acoplado a um
Espectrômetro de massas

injetor
Gás de
arraste

controlador

Espectrômetro
de massas
Cromatógrafo

https://www.youtube.com/watch?v=0xNkuqNd4cA
Coluna HP-5: 5% de fenil e metilsilicone,
0,25 mm de diâmetro interno e 25 metros de
comprimento e 0,2 micrometro de fase estacionária

http://www.unsolvedmysteries.oregonstate.edu/
Detection of Nepetalactone in the Nepeta cataria plant by thermal desorption GC/MS

Chromatogram from the analysis of 2.7 mg of a

portion of the lead stem of the plant.

Mass spectrum generated from

nepetalactone found in the lead stem.

http://www.sisweb.com/referenc/applnote/app-94.htm
Figure 1 : GC-MS of technical grade nonylphenol and detailed mass spectrum
of isomer 363-NP.
The principles of Fast GC can be applied to do exactly this. Fast GC was successfully used
to reduce the analysis time for the GC-MS analysis of 86 semivolatile analytes in just 8.2
minutes. This analysis typically requires 15-20 minutes using conventional GC.
Peak IDs
1. n-Nitrosodimethylamine
2. Pyridine
3. 2-Fluorophenol (surr.)
4. Phenol-d6 (surr.)
5. Phenol
6. Aniline
7. Bis(2-chloroethyl)ether
8. 2-Chlorophenol-d4 (surr.)
9. 2-Chlorophenol
10. 1,3-Dichlorobenzene
11. 1,4-Dichlorobenzene-d4 (I.S.)
12. 1,4-Dichlorobenzene
13. Benzyl alcohol
14. 1,2-Dichlorobenzene-d4 (surr.)
15. 1,2-Dichlorobenzene
16. 2-Methylphenol
17. Bis(2-chloroisopropyl)ether
Column: SLB-5ms, 20 m x 0.18 mm I.D., 0.18 µm 18. n-Nitroso-di-n-propylamine
19. 4-Methylphenol
Oven: 40 °C (0.7 min.), 55 °C/min. to 240 °C, 28 20. Hexachloroethane
21. Nitrobenzene-d5 (surr.)
°C/min. to 330 °C (2 min.) 22. Nitrobenzene
23. Isophorone
inj.: 250 °C MSD interface: 330 °C 24. 2-Nitrophenol
scan range: m/z 40-450 25. 2,4-Dimethylphenol
26. Bis(2-chloroethoxy)methane
carrier gas: helium, 40 cm/se 27. Benzoic acid
28. 2,4-Dichlorophenol
29. 1,2,4-Trichlorobenzene
https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/marketing/global/documen
ts/193/828/fast-gc-overview.pdf
30. Naphthalene-d8 (I.S.)
31. Naphthalene
32. 4-Chloroaniline
33. Hexachlorobutadiene
34. 4-Chloro-3-methylphenol
35. 2-Methylnaphthalene
36. Hexachlorocyclopentadiene
37. 2,4,6-Trichlorophenol
38. 2,4,5-Trichlorophenol
39. 2-Fluorobiphenyl (surr.)
40. 2-Chloronaphthalene
41. 2-Nitroaniline
42. Dimethyl phthalate
43. 2,6-Dinitrotoluene
44. Acenaphthylene
45. 3-Nitroaniline
46. Acenaphthene-d10 (I.S.)
47. Acenaphthene
48. 2,4-Dinitrophenol
49. 4-Nitrophenol
50. Dibenzofuran
51. 2,4-Dinitrotoluene
52. Diethyl phthalate
53. 4-Chlorophenyl phenyl ether
54. Fluorene
55. 4-Nitroaniline
56. 2-Methyl-4,6-dinitrophenol
57. n-Nitrosodiphenylamine
58. Azobenzene
59. 2,4,6-Tribromophenol (surr.)
60. 4-Bromophenyl phenyl ether
61. Hexachlorobenzene
62. Pentachlorophenol
63. Phenanthrene-d10 (I.S.)
64. Phenanthrene
65. Anthracene
66. Carbazole
67. Di-n-butyl phthalate
68. Fluoranthene
69. Benzidine
70. Pyrene
71. Terphenyl-d14 (surr.)
72. 3,3’-Dimethylbenzidine
73. Butylbenzyl phthalate
74. 3,3’-Dichlorobenzidine
75. Benzo(a)anthracene
76. Bis(2-ethylhexyl)phthalate
77. Chrysene-d12 (I.S.)
78. Chrysene
79. Di-n-octyl phthalate
80. Benzo(b)fluoranthene
81. Benzo(k)fluoranthene
82. Benzo(a)pyrene
83. Perylene-d12 (I.S.)
84. Indeno(1,2,3-cd)pyrene
85. Dibenzo(a,h)anthracene
86. Benzo(g,h,i)perylene
 GC Chromatogram of gasoline

column: Petrocol DH, 100 m x 0.25 mm I.D., 0.50 μm (24160-U)

Espectrometria de massas com separação cromatográfica

GC-MS

HPLC-MS
Espectrometria de massas - aplicações
Omics age
 Banco de dados com
espectrometria de massas
1. NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library (NIST 20): Contém espectros de massas e
informações estruturais para milhares de compostos orgânicos, contém espectros de
referência para GC/MS (por ionização de elétrons) e LC-MS/MS (por espectrometria de
massa em tandem), bem como índices de retenção de fase gasosa para GC.
https://chemdata.nist.gov/

2. Wiley Registry of Mass Spectral Data: É a maior coleção de espectros de massa de alta
qualidade, incluindo Wiley Registry, KnowItAll Spectral Library, NIST e outras importantes
coleções de banco de dados espectrais para MS. Essas bibliotecas podem ajudar à análises
não direcionadas ou direcionadas. https://sciencesolutions.wiley.com/mass-spectral-
databases/

3. Spectral Database for Organic Compounds (SDBS): É uma base de dados que contém
espectros de RMN (1H e 13C), IV, Raman, ESR e outras informações espectroscópicas para
uma ampla variedade de compostos orgânicos (34600 compostos).
https://sdbs.db.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi

4. MassBank: É um banco de dados público que armazena espectros de massas adquiridos

de uma variedade de técnicas, incluindo EI-MS. Contém dados de espectrometria de
massas de compostos orgânicos e inorgânicos. https://massbank.eu/MassBank/
 Banco de dados com
espectrometria
de massas 1) chemical data, 2) clinical data, and
3) molecular biology/biochemistry data.
The database contains 220,945 metabolite entries including both
water-soluble and lipid soluble metabolites. Additionally, 8,610
protein sequences (enzymes and transporters) are linked to these
metabolite entries.

https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp

https://massbank.eu/MassBank/ https://metlin.scripps.edu/landing_page.php?pgcontent=mainPage