QUÍMICA INSTRUMENTAL II

Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (HPLC)
Profº. Ricardo Reche

UniSalesiano - Araçatuba
 Introdução

Nas indústrias químicas, farmacêuticas, alimentícias,

refinarias, petroquímicas, laboratórios de análises clínicas, ambiental
e forense entre outras, frequentemente é necessário separar, isolar,
purificar, identificar e quantificar os componentes de misturas muitas
vezes bastante complexas.
SEPARAÇÃO

• Operação pela qual uma mistura é dividida em pelo menos duas

frações com diferentes composições.
• É obtida por meios físicos embora reações químicas podem ser
envolvidas no processo.
• Os métodos físico-químicos de separação são baseados na
utilização de alguma propriedade física das substâncias a serem
separadas.
Exemplos:
 Definição de cromatografia

A cromatografia é um método físico-químico de separação

dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição
desses componentes em duas fases, que estão em contato íntimo.
Uma das fases permanece estacionária, enquanto a outra se move
através dela.
Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária,
os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fases de tal
forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase
estacionária, o que resulta em migrações diferenciais desses
componentes.
Classificação dos métodos cromatográficos

Cromatografia

Planar Em coluna

Fluído super
Líquido Gás Líquido
crítico

Fase Fase Fase Fase

Líquido Sólido ligada Líquido sólido sólido Líquido Sólido ligada
ligada ligada
 High Performance Liquid Chromatography
CLAD = Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho
CLAE = Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência

DESCRIÇÃO GERAL DE HPLC

• A amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna
cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE)
• Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os
componentes da mistura através da coluna. Esses se distribuem
entre as duas fases de acordo com suas afinidades
• As substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais
lentamente. Já as substâncias com pouca afinidade com a FE
movem-se mais rapidamente.
• Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que
emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um
cromatograma.
EXEMPLOS DE CROMATOGRAMA HPLC
Mistura de aminoácidos
APLICAÇÃO

HPLC é utilizada em análises de compostos não voláteis ou instáveis

termicamente onde a cromatografia a gás não pode ser utilizada.
Como cerca de 80% dos compostos apresentam essas características,
o campo de aplicação de HPLC é extremamente vasto.

ALGUNS EXEMPLOS DE APLICAÇÕES E ANALITOS

 Vantagens

• FE é utilizada várias vezes

• Versatilidade: requisito é a solubilidade da amostra na fase móvel.
• Tempo reduzido de análise
• Alta resolução
• Ótima análise qualitativa
• Bons resultados quantitativos: desvios inferiores a 5 %.
• Boa sensibilidade:
Abdorção UV –Vis de λ variável : 10-10 g.
Fluorescência: 10-12 g.
• Automação
 Desvantagens

• Auto custo do equipamento.

• Auto custo de manutenção do equipamento
• Não existe detector universal.
• Experiência do operador.
 Instrumentação em HPLC

O cromatógrafo a líquido é constituído dos seguintes componentes:

1. Reservatório e sistema de bombeamento da fase móvel
2. Sistema de introdução de amostra
3. Sistema analítico: coluna cromatográfica e termostato
4. Sistema de detecção (um ou mais detectores)
5. Sistema de registro e tratamento de dados.
 Fase móvel

Reservatório da fase móvel

Filtro do Reservatório:
• Captar a FM e evitar que
partículas suspensas na FM
obstruam os capilares ou
contaminem a bomba.
• Filtros de 10 a 40 μm.
 Fase Móvel
• A fase móvel não pode conter partículas para evitar danos à
bomba, injetor e coluna, logo é necessário filtração antes de
armazenar a fase móvel no reservatório.
A figura abaixo ilustra um filtro para HPLC:

A escolha do filtro é função da

natureza da fase móvel. Usualmente
utiliza-se membranas de nylon (0,20 e
0,45 μm), celulose (0,22 μm) ou
TEFLON (1 e 1,5 μm)
• A fase móvel deve ser desgaseificada para evitar a formação de
bolhas no processo de separação.
A desgaseificação garante:
- Reprodutibilidade da vazão: retira ar dissolvido na FM e evita
bolhas na bomba;
- Estabilidade na linha de base: bolhas no detector causam
instabilidade da linha de base;

As técnicas de degaseificação são:

- Ultrasom: Muito lento, pouco eficiente, requer agitação, em geral
o pior método quando usado sozinho.
- Vácuo + Ultrasom: Rápido, eficiente, refazer de 12 em 12 horas.-
Vácuo (trompa d’água)
- Purga com Hélio: Contínuo, hélio é razoavelmente caro, leva a
aumento de vazamentos, maior custo operacional.
- Degaseificador “on-line”: Contínuo, remove o ar logo antes de
entrar na bomba, investimento alto inicial (melhor opção a longo
prazo).
• Deve ter alto grau de pureza.
- As impurezas da fase móvel podem absorver e diminuir a
sensibilidade do detector.

• Dissolver a amostra sem decompor seus componentes.

- O solvente da amostra, normalmente, é a própria FM ou um dos
seus componentes.
• Ter polaridade e viscosidade adequadas.
- Os mais indicados como FM são os solventes com baixa
viscosidade – menor perda de carga no bombeamento.

• Não degradar a fase estacionária.

- Quando se utilizar cromatografia líquido-líquido, a fase móvel
pode dissolver a fase estacionaria. Para evitar isto, satura-se a fase
móvel com a fase estacionaria utilizando-se para isso uma pré-
coluna contendo uma alta concentrado da mesma fase estacionaria.
• Ser compatível com o detector utilizado.
 Água como fase móvel

• Água mono-destilada e deionizada comum são inadequadas.

- Contaminação de orgânicos voláteis e de orgânicos da resina

• Água deve ser grau hplc .

- Purificada com resinas de troca iônica, carvão ativado, filtros
de membrana (livre de bactérias).
- Produzida no momento de uso pois é facilmente
recontaminável.
Relação entre seletividade com polaridade da fase móvel

Ao variar a polaridade da fase móvel, varia o fator de retenção

e consequentemente a seletividade na separação.
Variação de tr e resolução com a composição do solvente
água/metanol
 Bombas de Alta pressão

CARACTERÍSTICAS PRINCIPAIS
• Leva a fase móvel desde o reservatório até a coluna
• Vazão contínua sem pulso (amortecedor de pulsos)
• Vazão constante independentemente da pressão
• Alta resistência à corrosão – inércia química a solventes comuns
• Opera a altas pressões (6000 psi)

De acordo com as características de funcionamento e

desenho, podem-se considerar basicamente dois tipos de bomba: as
mecânicas e as pneumáticas. Entre as bombas mecânicas, existem
dois tipos diferentes: recíprocas (pistão ou diafragma) e seringa.
 CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES

Vazão constante é essencial para qualquer separação por HPLC. Alta

pressão é necessária para impulsionar o solvente através da coluna
cromatográfica vencendo a enorme resistência imposta pela fase
estacionária.

• Normalmente se utiliza bombas recíprocas com um ou

preferencialmente dois pistões o que minimiza pulsação.

• Preferencialmente devem operar com programação de vazão e deve

ser possível a interrupção do processo em pressões fora dos limites
máximos e mínimos pré-estabelecidos.
 Eluição
É o desenvolvimento da amostra no sistema cromatográfico.

Isocrática:
A composição da fase móvel é mantida constante durante toda
análise cromatográfica.
Nesse caso utiliza-se apenas uma bomba. A figura abaixo ilustra o
equipamento necessário para uma análise isocrática.
Gradiente:

Alguma análises necessitam alteração da composição da fase

móvel, sem alteração da vazão total, com a finalidade de diminuir
tempo de análise e/ou melhorar a separação dos componentes da
amostra.
O bombeamento por gradiente pode ocorrer à baixa pressão ou
a alta pressão.
No caso de baixa pressão utiliza-se uma única bomba e a
seleção do solvente a ser utilizado dá-se através de válvula de
múltiplas vias controladas pelo software do sistema.
Já no caso do bombeamento de alta pressão, cada solvente tem
uma bomba específica.
A figura abaixo ilustra o equipamento necessário para o a
análise por gradiente a baixa e alta pressão.
 A figura abaixo ilustra dois cromatogramas obtidos por
análises isocrática e por gradiente.
Bombas Recíprocas
São bombas que escoam volumes constantes de forma não-
contínua, isto é, pulsante.
Mediante o movimento de um pistão e por meio de um sistema
de válvulas unidirecionais, que alternadamente se abrem e se fecham,
enche-se e esvazia-se uma pequena câmera (de 35 – 400 μL)

Vantagens:
-Geral altas pressões e vazões de volume constante.
-Compatibilidade com eluição por gradiente.
-Reservatórios sem limite de volume (alimentação contínua)
 Bombas Recíprocas
Desvantagens:
-Sofre cavitação (formação de bolhas durante a compressibilidade dos
líquidos durante o movimento dos pistões).

-Os líquidos, apesar de pouco compressíveis, podem também fazer

que a vazão real difira um pouco da vazão escolhida pelo operador, se
não forem introduzidos fatores de correção de compressibilidade.

-Obtenção de uma vazão pulsante decorrente do movimento de ida e

volta do pistão.

Utilizar sistema de amortecedor

A melhor forma é utilizar uma bomba

constituída de pistão duplo.
 Bombas do tipo seringa
Um êmbolo os pistão é deslocado de forma contínua e
uniforme por um motor de precisão, comprimindo o líquido contido
em uma câmera de um certo volume.
O líquido flui através de uma abertura na mesma câmera, e se
obtêm assim uma vazão, que pode variar conforme se desloca o
êmbolo.

Vantagens:
-Vazão uniforme e contínua (livre de
pulsações).
-Necessita de pouca manutenção.
Desvantagens:
-Custo elevado.
-Capacidade da câmera limitada.
-Apenas eluição isocrática
 Bombas pneumáticas
O líquido é deslocado mediante mediante a pressão exercida
por um gás inerte sobre o líquido, ou sobre o recipiente comprimível
que o contém.

Vantagens:
-Vazão uniforme e contínua (livre de
pulsações).
Desantagens:
-Custo elevado.
-Incompatibilidade com eluição por
gradiente
-Capacidade da câmera limitada.
 Sistemas de injeção de amostra

Existem duas possibilidades para injeção da amostra:

- com válvulas manuais para amostragem.
- com um sistema de injeção automática (auto – injetor).

Injeção Manual
Em HPLC, a injeção de amostra é realizada com auxílio de válvulas
especiais que permitem introdução com grande precisão e exatidão de
volumes que variam, em geral, de 5 a 20μl. A figura abaixo, mostra um
esquema de uma válvula típica nas posições de carga e de injeção.

Posição de carga Posição de injeção

Alça de amostragem
Injeção Automática

Os auto-injetores trabalham de maneira similar ás válvulas de

amostragem e são operados eletricamente.
As vantagens desse injetor são que um grande número de amostras são
injetadas sem intervenção do analista, permitindo programar injeções.
Sobrecarga do volume da amostra

Para aproveitar todos os pratos que uma coluna possui, não se deve
injetar um volume maior que 1 % do volume da coluna vazia.

Vmáximo (μL) = π (raio)2(comprimento)(0,01)

 Colunas Cromatográficas

As colunas são constituídas de um pedaço de tubo de algum

material inerte, de diâmetro interno uniforme e capaz de resistir as
pressões em que será usado. O aço inoxidável é o mais usado entre
todos os materiais.
A capacidade da coluna e determinada pelo seu comprimento,
diâmetro e material de recheio. As colunas são normalmente retas
porque apresentam uma perda de eficiência quando são dobradas.
Nos extremos da coluna coloca-se um disco de teflon ou metal
poroso para evitar a perda do recheio ou mudanças na sua
compactação. É importante que este disco retenha as partículas do
recheio sem produzir um aumento muito grande na pressão
 Os tubos das colunas são preenchidos com a fase estacionária
conveniente, geralmente sílica ou seus derivados, com granulometria
de 3, 5, 7 ou 10 μm (em alguns casos, até de 1 μ m) de diâmetro
médio.
Devido a queda de pressão elevada nos tubos, as colunas são
relativamente curtas e de paredes espessas.
As colunas normais apresentam diâmetro interno variando de
4 – 6 mm e comprimento que depende da granulometria da fase
estacionária como mostra a tabela abaixo.
 Como o tempo de retenção depende da temperatura, as colunas
devem ser mantidas termostatizadas em um forno onde pode-se
selecionar a temperatura apropriada para a separação.

Em um cromatógrafo a líquido, podem ser usados três tipos de

coluna: coluna de saturação, coluna de guarda e coluna de separação.
 Coluna de Saturação (Pré-coluna)
É colocada entre a bomba e o injetor e é usada para
condicionar a fase móvel (FM).

Ela é usada para saturar a FM com o líquido estacionário da

fase estacionária (FE) da coluna de separação para que a FM, ao
penetrar na coluna de separação, não ataque a FE destruindo o recheio.

Esse tipo de coluna era muito usado quando usava-se a

cromatografia líquido-líquido, na qual a FE encontrava-se sorvida
sobre o suporte.

Hoje, com o sucesso das fases quimicamente ligadas, não há

necessidade de usar uma coluna de saturação.
Coluna de Guarda

- Coluna de 2 a 5cm localizada entre o injetor e a coluna de

separação.
- Diâmetro interno e FE igual ao da coluna de separação.
- Protege a coluna de separação, aumentando seu tempo de vida:
A filtração da fase móvel e da amostra nem sempre são suficientes
para a eliminação de impurezas prejudiciais à coluna. Dependendo
das características da fase estacionária e da natureza da amostra, pode
acontecer o que se chama de “retenção irreversível”, ou seja, a
afinidade do contaminante pela coluna é tão grande que ele não elui,
ficando retido nos primeiros centímetros do empacotamento. Retido
na cabeça da coluna, o contaminante pode provocar perda da
eficiência, aumento de pressão e cauda nos picos.
Coluna de Separação

- Responsável pela separação dos componentes presentes na amostra.

- As colunas são constituídas de um pedaço de tubo de algum material
inerte, de diâmetro interno muito preciso e paredes finamente
polidas, capaz de resistir à altas pressões.
- Dependendo do diâmetro interno (d.i.), têm-se as diferentes
classificações das colunas cromatograficas.
• Preparativa: d.i. > 10 mm
• Convencional: d.i. = 2 a 5 mm
• Microbore: d.i. = 1 a 2 mm
• Capilar: d.i. = 0,075 a 0,5 mm
- Para melhorar a eficiência das colunas, tenta-se diminuir o diâmetro
interno das colunas cromatográficas.
• Diminuição da vazão da fase móvel
• Diminuição do volume da cela do
Para isso é necessário o detector
aparelho ser de baixa • Tubos de conexão de menor
pressão diâmetro
• Trocar a câmera de mistura das
bombas por microcâmeras.
• Injetores de volumes reduzidos
- As colunas são normalmente retas porque apresentam uma perda de
eficiência ao serem dobradas. Quando é necessário usar colunas
compridas, utilizam-se colunas retas conectadas entre si com tubo
de comprimento e diâmetro interno o menor possível.
 Condicionamento da coluna

• Necessário para que haja um perfeito equilíbrio da FM e da FE.

- Coluna nova: 4 – 8 horas (0,2 mL/min).
- Coluna parada há alguns dias: 2 horas (0,2 mL/min).
- Coluna de uso diário: 15 minutos (0,2 mL/min).

Coluna deve ser guardada

em solvente orgânico
ou fase móvel
 Efeito da temperatura da coluna
Não é possível estabelecer uma regra a respeito da influência
da temperatura no desempenho da separação por CLAE.
VANTAGENS DE TEMPERATURAS ALTAS
•O aumento da temperatura frequentemente melhora o desempenho da
coluna, mas é possível que diminua;
•Maior a temperatura menores os tempos de retenção (diminuição da
viscosidade da fase móvel.

DESVANTAGENS DE TEMPERATURAS ALTAS

•Maiores temperaturas causam maior degradação da coluna;
•Pressão de vapor do solvente aumenta (maior formação de bolhas no
detector, causando instabilidade da linha de base);
•A solubilidade da sílica na fase móvel aumenta.
 Detectores

O detector é um dispositivo conectado na saída da coluna que

percebe a presença de componentes e emite um sinal elétrico a ser
registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade
do componente analisado.
Um detector ideal deve possuir as seguintes características:
•Alta Sensibilidade
•Estabilidade
- Mudanças de temperatura e vazão de fase móvel não devem
alterar o sinal
•Reprodutibilidade
•Resposta Linear
-A resposta do detector deve variar linearmente com a
concentração do analito numa extensa faixa de concentração
•Resposta rápida aos analitos
•Não contribuir para o alargamento do pico
- O volume da cela do detector deve ser o menor possível para evitar a
perda de eficiência do sistema.
- Celas de baixo volume, contribuem positivamente com a
sensibilidade.
•Confiabilidade
•Facilidade de manuseio
•Não destrutivo
- Condição necessária para cromatografia preparativa
•Seletividade
- Habilidade relativa de um detector medir um composto e não
outro.
TIPOS DE DETECTORES

Os principais detectores utilizados em HPLC são:

• Índice de refração

• Espectrofotometira UV-Visível

• Fluorescência

• Eletroquímico

• Espectrometria de massa LC/MS

 Detector de Índice de Refração
No momento da passagem do analito pelo detector, pode
ocorrer uma alteração do índice de refração. Essa alteração em relação
ao valor da fase móvel livre de analito é detectada.
A detecção só é possível quando o índice de refração do analito
é diferente do IR da fase móvel.
Esse detector é normalmente utilizado quando os analitos não
absorvem na região de comprimento de onda do UV-VIS.
Apresenta as seguintes desvantagens:
• baixa sensibilidade
• não permite a utilização em análises por gradiente (pois o IR
varia com a composição da fase móvel)
• temperatura deve ser constante (pois o IR varia com a
temperatura)

Aplicação
Análises de carboidratos e açúcares em geral.
 Detector de espectrofotômetro UV-Visível (UV-VIS)

Baseia-se na absorbância da luz pelo analito ao passar pelo detector.

É um detector seletivo pois só detecta os compostos que absorvem no

comprimento de onda em que o detector for ajustado.

É o detector mais utilizado em HPLC pois grande maioria das

substâncias absorvem radiação UV. Exemplos de substâncias são:
olefinas, aromáticos, compostos contendo ligações C=O, C=S, N=O.

CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES:
• A fase móvel utilizada não pode absorver no comprimento de onda
selecionado
• A pureza da fase móvel é extremamente importante (traços de
impurezas podem absorver intensamente no comprimento de onda
utilizado): UTILIZAR SOLVENTES GRAU HPLC
TIPOS DE DETECTORES UV-VIS:

•Fotométricos – comprimento de onda fixo: 254nm e 280nm.

•Espectrofotométricos – comprimento de onda variável: 190nm a
800nm.
•Arranjo de diodos – detecta vários comprimentos de onda ao mesmo
tempo.
DETECTORES FOTOMÉTRICOS
•É sensível, econômico e mais que suficiente para obter bons
resultados com os compostos que absorvem luz no comprimento de
onda em que ele opera.
•É relativamente insensível às variações de vazão e temperatura.
•A maior parte operam em comprimentos de onda de 254 nm (emissão
da lâmpada de mercúrio de baixa pressão) e de 280 nm (resultado da
absorbância de luz de 254 nm e da emissão de luz de 280 nm de uma
substância fosforescente).
DETECTORES ESPECTROFOTOMÉTRICOS

• O comprimento de onda é variável entre 190nm e 800nm

selecionado através do monocromador (UV = lâmpada de deutério e
VIS = lâmpada de tungstênio).
• Possui maior aplicação pois permite selecionar o comprimento de
onda mais adequado para os componentes a serem analisados.
• Maior sensibilidade: escolha do comprimento de onda de maior
absorbância.
• Maior seletividade: escolha do comprimento de onda onde o soluto
de interesse absorve e outros não.
• Permite a utilização de análise por gradiente: escolha do
comprimento de onda onde os constituintes da fase móvel não
apresentam variação de absorbância.
• Permite obter o espectro de absorbância de cada componente
separado interrompendo o fluxo da fase móvel e assim selecionar o
melhor comprimento de onda.
 Como mostra o esquema do detector, o comprimento de onda é
selecionado através do monocromador do feixe de luz emitido pela
lâmpada de deutério ou tungstênio e incide na cela por onde passam os
componentes da amostra que absorve parte da luz dependendo de sua
absortividade molar e concentração. A quantidade de luz não absorvida
é detectada pela fotomultiplicadora.
DETECTOR DE ARRANJO DE DIODOS – DIODE ARRAY

• Nesse tipo de detector, toda luz passa pela cela. A luz emergente é
dispersada em uma grade holográfica e os comprimentos de onda
resultantes são focalizados em uma rede de fotodiodos (256 a 1024).
Assim, todo o espectro do componente pode ser armazenado. Com o
auxílio de um computador, pode-se reproduzir um cromatograma para
um determinado comprimento de onda ou produzir uma série de
espectros em intervalos de tempo fixos.
Vantagens do arranjo de diodo em relação ao detector uv-vis
No detector UV-VIS, seleciona-se o comprimento de onda que
pode não ser o mais adequado para todos os componentes da amostra.
Isso resulta na perda de sensibilidade de alguns componentes da
amostra.
A figura abaixo ilustra a diferença de intensidade do pico para um
composto em função do comprimento de onda.

Com o arranjo de diodo,

pode-se selecionar o melhor
comprimento de onda para cada um
dos componentes, otimizando dessa
forma a sensibilidade. Isso é
extremamente importante na
determinação de impurezas nas
sínteses e controle de qualidade de
princípios ativos de produtos
farmacêuticos.
 Detector de Fluorescência
• O princípio de funcionamento desses detectores é que a luz de
comprimento de onda adequado passa através da cela de amostra, que
é excitada por ela. No retorno ao estado fundamental, a molécula
excitada emite luz de comprimento de onda maior, que é detectada a
um ângulo reto da radiação incidente.
•É utilizado para compostos que fluorescem. Em boa condições, é
possível detectar na ordem de picograma (10 -12).
• A fase móvel empregada nos
detectores de fluorescência deve
ser cuidadosamente selecionada,
porque a intensidade de emissão
depende do meio em que se
encontra a amostra.
• A presença de oxigênio na fase lâmpada

móvel pode anular o sinal de

fluorescência.
 Detectores Eletroquímicos

Baseia-se na possibilidade de muitos compostos serem

oxidados ou reduzidos quando se aplica um potencial elétrico.

Em um processo eletroquímico, um par de eletrodos é

colocado na cela e um potencial suficientemente elevado é aplicado
provocando uma reação de oxidação ou redução gerando uma
corrente que é medida em um detector eletroquímico. A corrente
gerada é proporcional a concentração do composto.

É importante destacar que, neste tipo de detecção, a amostra

tem que ser constituída de íons ou compostos que sofram ou
oxidação ou redução (detectores polarográficos). Este detector é
seletivo, porque detecta somente as espécies que se oxidam (ou
reduzem) em um potencial inferior ou igua1 ao fixado.
Comparação de detectores HPLC.
 Aquisição de dados

Atualmente utilizam-se softwares que permitem:

•Processar os dados de cromatograma.

•Armazenar e registrar

•Controlar a composição da fase móvel (isocrática e por gradiente),

vazão da bomba, amostrador automático, temperatura da coluna.

•Realizar cálculos
 Preparação da Amostra

A preparação de amostras tem como objetivo a remoção dos

componentes interferentes das amostras e o enriquecimento seletivo
das substâncias a analisar.

PRINCIPAIS PARA CLAE:

•Filtração;

•Extração em fase sólida;

•Extração líquido-líquido.
 Filtração
FILTROS DE SERINGA: os filtros de seringas são utilizados
rotineiramente para remover contaminantes particulados de amostras
antes de análises cromatográficas.

A eficiência destes dispositivos é determinada principalmente

pelo fato de remover estes contaminantes, porém sem liberar
artefatos indesejáveis (p.ex., extraíveis) no filtrado.
Diferentes membranas apresentam compatibilidade química
diferente. Em geral, um tipo de filtro não será adequado para todas as
aplicações.
MATERIAIS:
CA: Acetato de Celulose
GF: Fibra de Vidro
MCE: Mistura Esteres de Celulose
NY: Nylon 66 (Poliamida 66)
PES: Polietersulfonado
PP: Polipropileno
PTFE: Politetrafluoroetileno
PVDF: Polifluoreto de vinilideno
EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

A extração em fase sólida (SPE) permite a extração seletiva de

analitos a partir de amostras complexas, bem como de amostras de
grande volume, previamente às análises de CLAE.
Exemplos
EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO
 Separação Cromatográfica

Em função da fase estacionária utilizada tem-se os seguintes

mecanismos de separação:

•Adsorção
•Partição
•Troca iônica
•Exclusão
•Bioafinidade
ADSORÇÃO

A fase estacionária é um sólido contendo grupos (sítios

ativos) que podem adsorver certas substâncias.
Baseia-se na competição entre moléculas da amostra e da fase
móvel por sítios ativos.
PARTIÇÃO
A fase estacionária é um líquido depositado ou quimicamente
ligado a um suporte sólido.
As moléculas dos componentes a serem separados se
distribuem entre a fase estacionária ligada e a fase móvel líquida de
acordo com sua afinidade relativa:

A FM carrega as moléculas nela dissolvidas. Para

reestabelecer o equilíbrio, moléculas na FE passam para a FM e são
arrastadas. Tem-se um equilíbrio dinâmico em cada segmento da
coluna. Como a FM está em contínuo movimento, esta acaba
retirando todas as moléculas da coluna.
TROCA IÔNICA
A fase estacionária é uma resina catiônica ou aniônica.
O esquema abaixo ilustra o processo:
POR EXCLUSÃO

•A separação é efetuada de
acordo com o tamanho das
moléculas.
•A fase estacionária tem poros
de tamanho controlado
•Moléculas pequenas podem
penetrar na maioria dos poros e
apresentam um maior tempo de
retenção
•Moléculas grandes movem-se
rapidamente através da coluna
pois não entram nos poros
•A técnica é utilizada na análise
de compostos de alta massa
molecular
BIOAFINIDADE

Nessa técnica somente componentes que possuem bioafinidade com a

fase estacionária são retidos.
 PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS

Uma série de parâmetros cromatográficos são importantes para serem

utilizados na identificação dos compostos separados, avaliar o
desempenho cromatográfico e auxiliar na otimização do processo de
separação.
Os parâmetros cromatográficos a serem discutidos são:
• TEMPO DE RETENÇÃO
• FATOR DE SEPARAÇÃO
• NÚMERO DE PRATOS
• RESOLUÇÃO
TEMPO DE RETENÇÃO

Por definição chamamos de TEMPO DE RETENÇÃO, tr, de

uma substância ao tempo decorrido do instante em que a amostra foi
introduzida até o instante do máximo do pico.
Na análise cromatográfica, mantido constantes a vazão da fase
móvel e a temperatura da coluna, o tempo de retenção é constante.
FATOR DE SEPARAÇÃO (α)
Para a cromatografia em coluna, o fator de separação é
calculado pela razão entre os tempos de retenção ajustados:
α = t’r2 / t’r1

O fator de separação sempre trata com dois picos adjacentes

NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (n)
    A EFICIÊNCIA de uma coluna é expressa em número de pratos
teóricos (n). Assume-se que a coluna possa ser visualizada como uma
divisão de seções imaginárias chamadas de pratos. A cada prato a
partição do soluto entre a fase móvel e a fase estacionária é rápida e o
equilíbrio é alcançado antes do soluto se mover para o próximo prato
n = 16(tr / wb )

quanto > n > rendimento da coluna (picos mais finos)

RESOLUÇÃO

Fornece uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar

duas substâncias.
Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)

Quando Rs =1, os dois picos são razoavelmente separados,

com somente 2% de superposição. Maiores valores de resolução
indicam melhor separação: Rs = 1,25 é suficiente para fins
quantitativos e Rs > 1,5 indica separação completa
 FASES ESTACIONÁRIAS

As FE são constituídas de material sólido, granulado,

finamente dividido e densamente empacotado dentro de um tubo
feito de material inerte, normalmente aço. O material sólido pode
estar revestido ou ligado quimicamente a um líquido.

TIPOS DE FASES ESTACIONÁRIA

FE SÓLIDA
FE POR EXCLUSÃO
FE POR TROCA IÔNICA
FE POR BIOAFINIDADE
FE QUIMICAMENTE LIGADA
NORMAL
REVERSA
FASE ESTACIONÁRIA SÓLIDA

Separação realizada por mecanismo de adsorção

• Utiliza partículas porosas em geral de 5 micra ou 10 micra
• Solventes mais utilizados são de média e baixa polaridade
• Adsorventes mais utilizados: alumina e principalmente sílica
 A sílica possui grupos siloxano, Si-O-Si e grupos silanol, Si-
OH vicinal e germinal. Os grupos silanol são os mais importantes
devido a sua polaridade.
Quanto mais polar o composto, maior a retenção.
FASE ESTACIONÁRIA POR EXCLUSÃO

A separação baseia-se no tamanho das moléculas dos componentes da

amostra em relação ao diâmetro dos poros da fase estacionária.
As fases estacionárias podem ser sílica ou polímeros de poliestireno-
divinilbenzeno, poliacrilamidas e outros, com distribuição de
diâmetro dos poros controlada.
Moléculas pequenas entram nos poros pequenos enquanto as
moléculas grandes não conseguem entrar nos poros. Desta forma elas
são permeadas seletivamente.
A técnica é denominada cromatografia de exclusão por tamanho.
FASE ESTACIONÁRIA POR TROCA IÔNICA
Na cromatografia por troca iônica (CTI), a fase estacionária possui
grupamentos iônicos quimicamente ligados que podem ser trocadores
de cátions ou de ânions. Esses grupamentos apresentam contra-íons
que são deslocados pelos íons da amostra. Por exemplo, admitindo
uma amostra com um cátion M+, tem-se:
M+ + R-SO-3Na+ ↔ Na+ + R-SO-3M+
Os grupos quimicamente ligados presentes em todo tipo de material
de troca iônica são:
SO3 - : trocadores fortes de cátions
CO2 - : trocadores fracos de cátions
NR3 + : trocadores fortes de ânions
NH2R+ : trocadores fracos de ânions
 Os materiais usados como recheio para CLAE por troca iônica
tem grupos (cátions ou ânions) quimicamente ligados a partículas
porosas de resinas poliméricas, a sílica com camada pelicular, as
micropartículas porosas de sílica e as micropartículas porosas de
resinas poliméricas.
FASE ESTACIONÁRIA QUIMICAMENTE LIGADA

São as fases mais importantes da cromatografia líquida

Obtidas pela reação dos grupos silanois da sílica com compostos
contendo grupos polares (Fase Normal) ou apolares (Fase Reversa).

Na fase Quimicamente Ligada, a sílica gel, através dos

grupamentos Si - OH, se liga quimicamente a um grupo funcional
que lhe confere grande estabilidade química.

A “Cromatografia de Fase Ligada” é subdividida em Fase

Normal e Fase Reversa de acordo com a polaridade dos grupos
funcionais ligados à sílica gel.

As notáveis propriedades deste tipo de material fazem da

cromatografia de Fase Ligada a mais utilizada em todo o mundo.
FASE ESTACIONÁRIA NORMAL

Grupos Funcionais Polares são ligados à matriz de sílica. A técnica,

em geral, substitui com vantagens a Cromatografia por Adsorção.

GRUPOS FUNCIONAIS MAIS COMUNS:

•DIOL (CH2OH)2
•CIANO (CN)
•AMINO (NH2)
•NITRO (NO2)

FASE MÓVEL
Polaridade alterada com isopropanol,
• Hexano
acetato de etila, tert-butilmetil éter
• Diclorometano
FASE ESTACIONÁRIA REVERSA
Em Cromatografia de Fase Reversa, os grupos funcionais
ligados à base de sílica são apolares. Os analitos são atraidos para a
superficie pelos seus grupos funcionais não polares.
O analito mais polar elui primeiro, seguidos pelos outros em
ordem decrescente de polaridade. Os grupos butil, octil, octadecil e
fenila são os mais utilizados. O grupo octadecil é responsável pela
maioria das separações em fase reversa.
 Infelizmente, devido a efeitos
estéricos, muitos grupos SiOH
não reagem permanecendo ativos
e provocando encaudamento dos
picos.

Ligação química tradicional usando silano monofuncional

alcança um máximo de 50% . Para atenuar este problema, emprega-se
um processo conhecido como “Endcapping”.
FASES ESTACIONARIAS ENDCAPPING

Para minimizar o efeito dos grupos silanol residuais é necessário um

passo secundário de ligação para cobrir esses grupos ainda presentes
na sílica.
• O processo denominado endcapping efetua-se em geral com
trimetilclorosilano (TMS). Ainda assim restam grupos silanol livres.

• As sílicas usuais só podem ser utilizadas na faixa de pH 2 – 8, pois

os grupos TMS sofrem hidrolise a pH menor que 2 e a sílica se
dissolve em fase móvel contendo água em pH maior que 8.
EXERCÍCIOS
1) Um experimento de cromatografia produziu a figura abaixo.
Sabendo que o eluente era água, e que a amostra continha os 3
compostos ilustrados, relacione o número de cada pico com a estrutura
dos compostos.

A B C

2) Em uma análise utilizando um cromatógrafo a líquido utilizou-se

uma coluna de Octadecil para eluição. Sabendo que a amostra é
constituída dos compostos A + B + C e que a ordem de polaridade dos
compostos é B < A < C e a ordem dos respectivos pontos de ebulição
é: A>C>B, qual deverá ser a ordem de eluição?
3) Porque é necessário utilizar uma solução tampão na cromatografia
em camada reversa?

4) Dados os cromatogramas individuais dos compostos a seguir,

podemos afirmar que qual desses compostos NÃO está presente na
amostra?
5) Uma amostra contêm os três compostos a seguir. Quais desses
compostos não poderá ser identificado por CLAE com detecção por
ultravioleta?

6) Numa separação por HPLC numa coluna polar obteve-se um

cromatograma com três picos, A, B e C com os tempos de retenção de
4, 6 e 25 minutos, respectivamente.
Sabendo que o tempo de eluição do eluente é de 2 minutos, diga,
justificando que alteração faria no eluente de modo a melhorar a
resolução ente A e B e diminuir o tempo de retenção de C.
7) Os cromatogramas abaixo mostram as separações em fase reversa
de algumas drogas básicas em uma coluna com fase C-8 ligada, em
duas condições:
a. Fase móvel CH3CN/0,01 mol.L -1 H3PO4, pH 2,5;
b. Fase móvel CH3CN/0,01 mol.L -1 H3PO4 + 0,005 mol.L-1
nonilamina, pH 2,5.
Porque a adição da nonilamina causa uma drástica redução no tempo
de análise e uma significativa melhora nos formatos dos picos?
8) Ainda, quanto ao modo de separação em HPLC é incorreto afirmar:
a) no modo normal, o aumento da polaridade da FM diminui o tempo de
eluição
b) no modo reverso, o aumento da polaridade da FM eleva o tempo de eluição
c) no modo reverso, o componente menos polar é eluído por último
d) no modo reverso, o componente mais polar é eluído primeiro
e) no modo normal, o componente mais polar é eluído primeiro

9) Quanto às Fases Estacionárias utilizadas em HPLC é incorreto afirmar:

a) no modo normal, utilizar como FE a sílica quimicamente ligada com
grupos -CN
b) no modo normal, utilizar como FE a sílica quimicamente ligada com
grupos Octila
c) no modo reverso, utilizar como FE a sílica quimicamente ligada com
grupos fenila
d) no modo reverso, utilizar como FE a sílica quimicamente ligada com
grupos butila
e) no modo reverso, utilizar como FE a sílica quimicamente ligada com
grupos C18
10. Quanto ao modo de separação em HPLC é incorreto afirmar:
a) no modo normal temos uma FE mais polar que a FM
b) no modo reverso temos uma FE mais apolar que a FM
c) no modo normal, o componente menos polar é eluído primeiro
d) no modo reverso podemos utilizar como FE a sílica e como FM o Hexano
e) no modo reverso podemos utilizar como FE o C18 como FM o metanol
11. Eluição é o desenvolvimento da amostra no sistema cromatógráfico.
Considerando essa afirmação, pode-se dizer que:
I - a eluição por gradiente apresenta a desvantagem de aumentar o tempo de análise;
II - denomina-se eluição isocrática, quando a composição química da fase móvel é
alterada durante a eluição;
III - a separação por gradientes tem a vantagem de aumentar a resolução e
reproduzir picos mais finos e simétricos;
IV - a separação por gradiente apresenta as desvantagens de aumentar o custo, já que
necessita de bomba com misturador, e não ser compatível com todos os detectores.
Está correto apenas o contido em
a) I e II.
b) I e III.
c) II e III.
d) III e IV.
e) II, III e IV.
12. A separação cromatográfica de duas substâncias é feita usando fase estacionária
apolar e fase móvel polar de composição constante (água/ propanol 40/60% v/v).
Nessas condições, a substância “M” aparece com tempo de retenção (tR1) igual a
10,2 min, enquanto o tempo de retenção (tR2) da substância “N” é 15,2 min.
A respeito desse procedimento de separação, afirma-se que a (o):
a) separação ocorre em regime de gradiente de fase móvel.
b) substância “M” é mais polar que a substância “N”.
c) procedimento descrito é típico de cromatografia líquida de fase normal.
d) aumento da polaridade da fase móvel não afetará os valores de tR1 e tR2
e) aumento da proporção de propanol na fase móvel aumentará a polaridade da fase
móvel.
13. A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) é uma técnica de separação
que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos analíticos mais
utilizados para fins qualitativos e quantitativos.
Quanto à técnica de cromatografia líquida, está correto afirmar que:
a) a qualidade de coluna deve ser verificada quando houver variações de
reprodutibilidade.
b) na cromatografia líquida de fase reversa, o analito mais polar elui depois do
analito menos polar.
c) os solventes em cromatografia líquida são injetados sob baixa pressão.
d) uma pré-coluna com composição de fase estacionária distinta da coluna
cromatográfica deve ser instalada para aumentar a vida útil do sistema.
e) quanto mais apolar for o solvente, maior a sua força eluente, e quanto maior a
força eluente, mais rapidamente os solutos serão eluídos da coluna.

14) Uma amostra sólida de um medicamento pesando 2,0000 g foi dissolvida em

água e transferida para um balão volumétrico de 250 mL, completando-se a solução
aquosa com o mesmo solvente. Injetou-se a solução aquosa, obtendo-se no
cromatógrafo a área que numa curva de calibração corresponde a 6mg/L. Determinar
a concentração de ácido ascórbico em % 
15) A figura abaixo mostra dois cromatogramas obtidos em condições isocráticas idênticas,
em fase reversa e em duas colunas diferentes. As colunas possuem fases ligadas
quimicamente, sendo uma com grupo octadecil (-C18) e a outra com grupo ciano (-CN). Os
analitos injetados foram 4- metoxibenzaldeído, 2-fenoxietanol, álcool benzílico e fenilmetil-
eter.

Condições:
Fase móvel: água: acetonitrila 80:20 v/v
Velocidade do fluxo: 2 mL/min
Detector: UV em 254 nm
Dimensões da coluna: 15 cm de comprimento, 3,9 mm de diâmetro interno Fase
estacionária: Partículas de 4 mm
a)Qual coluna corresponde cada um dos cromatogramas?
b)Efetue a atribuição dos picos a cada composto.
c)Qual será o efeito observado no cromatograma (i) se a composição da fase móvel for
mudada para acetonitrila/água 50:50 v/v?
16) Para as questões de 90 a 103, considere o cromatograma e o texto a seguir. Pesquisadores da
Universidade de Campinas (UNICAMP) estudaram as substâncias responsáveis pelo aroma do suco de
cupuaçu usando a técnica de cromatografia com detecção por espectrometria de massa (EM) do tipo
aprisionamento de íons (ion trap). O resultado é mostrado na figura acima. Considerando essas informações
e sabendo que entre os principais componentes encontrados nesse aroma destacam-se o 3-metilbutanal
(pico 3) e a tetrametilpirazina (pico 18), julgue (V) ou (F) os itens a seguir.

I.Nas condições dessa corrida cromatográfica, o tempo de retenção da tetrametilpirazina é maior que o do
3-metilbutanal.
II.O 3-metilbutanal interage mais com a coluna cromatográfica utilizada que a tetrametilpirazina.
III.A largura do pico cromatográfico 3, na linha de base, é inferior à do pico 2.
IV.A resolução existente entre os picos 9 e 10 é superior àquela existente entre os picos 15 e 16.
V.Um aumento da eficiência dessa coluna cromatográfica poderia aumentar a resolução de alguns picos.
VI.O tempo de retenção ajustado é a diferença entre o tempo de retenção do soluto e o tempo de retenção
da frente de solvente.
17) No que se refere à cromatografia em fase líquida, julgue os itens
subsequentes.

I. Nos detectores espectroscópicos, a absorvância é logaritmicamente

proporcional ao comprimento da célula de detecção.
II. Nos cromatógrafos líquidos de alta eficiência, o solvente é injetado sob alta
pressão.
III. Na cromatografia líquida de fase reversa, o analito mais polar elui depois
do analito menos polar.
IV. Dois problemas tendem a encurtar a vida de uma coluna analítica. Primeiro,
solutos que se ligam irreversivelmente à fase estacionária podem degradar o
desempenho da coluna e diminuir a fase estacionária disponível. Segundo,
materiais particulados injetados com a amostra podem entupir a coluna
analítica. Para minimizar esses problemas, pode-se usar uma pré-coluna (guard
column), posicionada antes da coluna analítica. Normalmente, essas pré-colunas
contêm o mesmo material particulado empacotado e a mesma fase estacionária
da coluna analítica, mas são significativamente menores e mais baratas.
V. Na eluição isocrática, a composição da fase móvel permanece constante ao
longo de toda a separação.
18) Em uma coluna de C18 encontra-se um composto com tempo de
retenção igual a 14 min quando a FM é metanol. Qual solvente, água
ou éter etílico, aparentemente reduziria o tempo de retenção?
Justifique.
19) Uma mistura contendo 7 compostos foi separada em três
colunas diferentes (contendo grupos quimicamente ligados: C1 , C6
e C14).

Justifique o tempo de retenção do composto fenilfenol nos

cromatogramas.