Isolamento de Fungos

Fitopatogênicos
 CONCEITO

O isolamento de fungos fitopatogênicos

consiste na sua obtenção em cultura pura a
partir de tecidos doentes do hospedeiro,
solo ou substrato.
 As operações de isolamento são
executadas sob rigorosa assepsia, em
ambiente próprio, usando-se
ferramentas e material
desinfestados ou esterilizados.
MEIO DE CULTURA DE ROTINA
BDA
Batata ................... 200 g
Dextrose ................ 20 g
Agar ..................... 17 – 20 g
Água ..................... 1000 ml

Pode ser adiquirido no mercado o

BDA desidratado
MÉTODOS BÁSICOS DE
ISOLAMENTO

1. ISOLAMENTO DIRETO

2. ISOLAMENTO INDIRETO
 1. ISOLAMENTO DIRETO

consiste na transferência, com o auxílio de um

estilete, de estruturas do patógeno (esporas,
hifas, rizomorfos, escleródios) diretamente do
órgão infectado para o meio de cultura.
 ISOLAMENTO DIRETO COM INCUBAÇÃO
EM CÂMARA ÚMIDA

Quando a pretensão é trabalhar com esporos, mas

estes não estão presentes na amostra, pode-se
estimular a esporulação do fungo, mantendo o material
em câmara úmida (por um a três dias) a 25 oC.

A exposição do material à luz contínua, em câmara

úmida, é geralmente recomendável para favorecer a
esporulação.
INCUBAÇÃO EM CÂMARA ÚMIDA
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DO ISOLAMENTO DIRETO
 2. ISOLAMENTO INDIRETO

 Consiste na transferência, para o meio de

cultura, de porções infectadas de tecido
do hospedeiro ou amostras de solo e
sementes infestadas
 CARACTERÍSTICAS DO ISOLAMENTO
INDIRETO

1. Os métodos de isolamento indireto variam

com o tipo de órgão ou tecido infectado
(órgãos lenhosos ou carnosos, não-
lenhosos ou não­carnosos) ou substrato de
onde o organismo é recuperado.
 CARACTERÍSTICAS DO ISOLAMENTO
INDIRETO

2. A superfície dos tecidos mortos é

invadida por outros organismos saprófitas
(fungos e bactérias), o que dificulta a
obtenção do patógeno em cultura pura
 CARACTERÍSTICAS DO ISOLAMENTO
INDIRETO

3. Para evitar a incidência de

contaminantes, o isolamento deve ser
feito, sempre que possível, a partir de
material recém-infectado, onde o
patógeno se encontra em crescimento
ativo nos tecidos e há menos saprófitas
invasores
 CARACTERÍSTICAS DO ISOLAMENTO
INDIRETO

4. Empregam-se, também, métodos

especiais de isolamento conforme a
natureza do órgão infectado, visando
reduzir ou eliminar completamente os
contaminantes superficiais.
ISOLAMENTO DE FUNGOS DOS TECIDOS DE
ÓRGÃOS LENHOSOS OU CARNOSOS
(TRONCO,RAÍZES, GALHOS GROSSOS E FRUTOS)

1. Selecione áreas de transição entre o tecido

infectado e o sadio e, com o auxílio de um
escalpelo previamente flambado, remova a
porção superficial do tecido, expondo as
camadas infectadas mais profundas.
ISOLAMENTO DE FUNGOS DOS TECIDOS DE
ÓRGÃOS LENHOSOS OU CARNOSOS
(TRONCO,RAÍZES, GALHOS GROSSOS E FRUTOS)

2. Com o escalpelo flambado novamente, corte

pequenos fragmentos de tecidos infectados
recém-exposto e, com o auxílio de uma pinça ou
estilete, plante-os em placas com meio de
cultura. Posicione um fragmento no centro e três
outros em torno do primeiro, mais ou menos
eqüidistante.
ISOLAMENTO DE FUNGOS DOS TECIDOS DE
ÓRGÃOS LENHOSOS OU CARNOSOS
(TRONCO,RAÍZES, GALHOS GROSSOS E FRUTOS)

3. Mantenha as placas em incubadoras a 25 oC. A

temperatura ótima de crescimento varia com a
espécie do patógeno isolada, mas a maioria dos
fungos fitopatogênicos cresce na faixa de 20 a
30 oC.
Representação esquemática do isolamento de fungo de tecido lenhosos
ISOLAMENTO DE FUNGOS DOS TECIDOS DE
ÓRGÃOS NÃO LENHOSOS OU NÃO
CARNOSOS (FOLHAS, RAMOS FINOS, RADICELAS)

1. Lave o material infectado cuidadosamente

com água e detergente.

2. Enxugue-o com papel-filtro ou papel "Yes".

ISOLAMENTO DE FUNGOS DOS TECIDOS DE
ÓRGÃOS NÃO LENHOSOS OU NÃO
CARNOSOS (FOLHAS, RAMOS FINOS, RADICELAS)

3. Com o auxílio de escalpelo previamente flambado,

retire fragmentos tissulares das margens da lesão e
os transfira para uma solução aquosa de álcool 70%,
onde permanecerão por 60 s. O álcool, além de
funcionar como desinfestante, tem a propriedade de
reduzir a tensão superficial do tecido, facilitando a
ação da solução desinfestante propriamente dita.
 ISOLAMENTO DE FUNGOS DOS TECIDOS DE
ÓRGÃOS NÃO LENHOSOS OU NÃO
CARNOSOS (FOLHAS, RAMOS FINOS, RADICELAS)

4. Transfira os fragmentos de tecido para a solução

desinfestante (hipoclorito de sódio 1%), mantendo-
os imersos na solução por 1 min. Este tempo é o
bastante para eliminar os contaminantes superficiais
sem afetar o patógeno no interior dos tecidos.
ISOLAMENTO DE FUNGOS DOS TECIDOS DE
ÓRGÃOS NÃO LENHOSOS OU NÃO
CARNOSOS (FOLHAS, RAMOS FINOS, RADICELAS)

5. Com o auxílio de uma pinça flambada, remova os

fragmentos da solução desinfestante e elimine o
excesso de desinfestante, tocando os fragmentos
ligeiramente no papel-filtro ou papel "Yes“
esterilizados.
ISOLAMENTO DE FUNGOS DOS TECIDOS DE
ÓRGÃOS NÃO LENHOSOS OU NÃO
CARNOSOS (FOLHAS, RAMOS FINOS, RADICELAS)

6. Plante, eqüidistantemente, três ou quatro

fragmentos por placa contendo o meio de cultura
(geralmente, um no centro e três na periferia da
placa).
ISOLAMENTO DE FUNGOS DOS TECIDOS DE
ÓRGÃOS NÃO LENHOSOS OU NÃO
CARNOSOS (FOLHAS, RAMOS FINOS, RADICELAS)

7. Mantenha as placas em incubadora a 25 °C até o

crescimento do organismo.

8. Repique a colônia desejada para tubos com BDA

inclinado.
Representação esquemática do isolamento de fungo de tecido de folha