UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE BIOCINCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA

BIO12007- Biologia Molecular Bsica Roteiro de aulas prticas 1 Extrao de DNA de cebola: isolando DNA na cozinha. Objetivo: extrair DNA de cebola utilizando produtos de uso domstico (detergente para lavar loua, sal de cozinha e lcool). A extrao de cidos nuclicos (DNA e/ou RNA) geralmente a primeira de vrias etapas para o estudo da biologia molecular de qualquer organismo. Nesta aula, sero utilizados produtos de uso domstico para a extrao de DNA da cebola (Allium cepa), para demonstrar que procedimentos para extrao de cidos nuclicos so simples e podem ser executados mesmo em laboratrios sem infra-estrutura especfica para este fim. Referncia: Loreto, E. L. S. & Sepel, L. M. N. Atividades experimentais e didticas de Biologia Molecular e Celular. So Paulo, Editora da Sociedade Brasileira de Gentica, 2002. Material Uma cebola grande Ralador Sal de cozinha (NaCl) Detergente para lavar loua (lquido ou gel) gua quente (65C a 80C) Papel-filtro ou filtro de caf Funil ou suporte para filtro de caf Gelo lcool 96GL gelado Dois frascos de vidro (~200ml) Basto ou pipeta de vidro Recipiente (plstico ou isopor) para o banho de gelo Procedimento 1. Rale a cebola e coloque o material ralado em um dos frascos. 2. Adicione 100 ml de uma soluo feita com 80 ml de gua quente, 20 ml de detergente e uma colher de sopa de sal (NaCl). Misture bem a soluo com a cebola ralada. Aguardar aproximadamente 10 min. 3. Coloque o frasco com a cebola ralada em um banho de gelo (recipiente com um pouco de gua e gelo). medida que a suapenso onde est a cebola ralada esfriar, dever ser possvel observar que o lquido parece estar talhando (formando grumos). 4. Quando a suspenso com a cebola ralada estiver fria, filtre-a e colete o lquido filtrado em um frasco limpo. 5. Incline o frasco de vidro com o lquido filtrado (ngulo de 30 a 40) e derrame vagarosamente, pela parede lateral, o lcool gelado. Voc ver que o lcool no se mistura prontamente com a soluo filtrada, havendo a formao de duas fases (na superior fica o lcool). Entre as duas fases possvel observar a formao de um precipitado com aspecto de fiapos esbranquiados, que so os cidos nuclicos. 6. Com a ajuda do basto ou da pipeta de vidro, possvel enrolar os cidos nuclicos que esto precipitando, ou seja, voc pode pescar o DNA da cebola. 7. Uma vez enrolados no basto, os cidos nuclicos devem secar por alguns minutos ao ar para a evaporao do etanol; depois o material deve ser transferido da extremidade do basto para um tubo com 0,5 ml de gua destilada. Assim, a amostra ser

reidratada rapidamente e o DNA em soluo poder posteriormente ser analisado por eletroforese em gel de agarose.

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BIO12007- Biologia Molecular Bsica Roteiro de aulas prticas 2 Extrao de DNA plasmidial de Escherichia coli Objetivo: Isolar DNA plasmidial de Escherichia coli a partir de um pequeno volume de cultura (minipreparao de plasmdeo) pela tcnica de lise alcalina. Referncia: Birnboim H. C. & Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 7(6): 1513-1523, 1979. A tcnica fundamenta-se na remoo seqencial de barreiras e na precipitao seletiva de molculas de cidos nuclicos. A clula lisada por tratamento com detergente para remoo da parede celular e membrana plasmtica e liberao do contedo celular (incluindo cidos nuclicos). O DNA genmico (cromossmico) precipitado em uma primeira etapa na presena de SDS (detergente) em pH alcalino, ficando o DNA plasmidial em soluo. O DNA plasmidial ento precipitado com a adio de etanol e recuperado por centrifugao. Material: Clulas de E. coli portadoras de plasmdeo pUC18 Meio de cultivo Luria Bertani (LB) (Composio por litro de gua destilada) Triptona 10 g Extrato de Levedura 5g NaCl 10 g pH ajustado para 7 com NaOH 1N Ampicilina (50 mg/ml)

Soluo 1 50mM glicose 25mM Tris/Cl pH 8,0 10mM EDTA pH 8,0 Soluo 2 (preparar no momento do uso) 0,2 N NaOH 1% SDS Soluo 3 60 ml de Acetato de Potssio 5M 11,5 ml cido actico glacial 28,5 ml H2O TE Tris.HCl EDTA Isopropanol

10 mM, pH 8,0 1 mM

Etanol absoluto Etanol 70%

Procedimentos: 1. Inocular 1 colnia de E. coli contendo o plasmdeo pUC18 em 3 ml de meio LB contendo ampicilina (50 g/ml). Incubar por 14-16 h a 37 oC sob agitao. 2. Centrifugar 3 ml da cultura de bactrias a 13.000 rpm por 1 min, em duas etapas. Em um tubo de 1,5 ml, centrifugar aproximadamente a metade da cultura bacteriana. Aps a primeira centrifugao, desprezar o sobrenadante e adicionar ao sedimento o restante da cultura. Aps a segunda centrifugao, descartar novamente o sobrenadante, escorrendo bem para que no fiquem restos de meio sobre material precipitado (clulas de E. coli). 3. Ressuspender as clulas em 250 l da soluo 1, agitando vigorosamente em vrtex. 4. Adicionar 250 l da soluo 2 e misturar delicadamente por 2 a 5 min, at a obteno de uma soluo clara. 5. Adicionar 350 l da soluo 3 e misturar rpidamente, invertendo o tubo de 3 a 5 vezes (haver a formao de um precipitado branco, que inclui protenas, material de parede celular e DNA cromossmico). 6. Centrifugar a 13.000 rpm por 10 min. 7. Transferir 800 l do sobrenadante (que contm o DNA plasmidial em soluo) para outro tubo, tendo o mximo de cuidado para no carregar junto o material precipitado. 8. Adicionar 650 l de isopropanol e misturar por inverso (a adio do lcool levar precipitao do DNA plasmidial, mas isso no ser visvel). 9. Centrifugar a 13 000 rpm por 10 min. 10. Remover todo o sobrenadante (escorrendo bem) e lavar o material precipitado (nem sempre visvel) com 250 l de etanol absoluto, tomando cuidado para no ressuspend-lo. Repetir a lavagem com etanol 70%. O material precipitado inclui o DNA plasmidial e tambm RNA. Quando h uma maior quantidade de RNA na preparao, pode-se observar, no fundo do tubo, um pequeno sedimento branco. 11. Secar o material precipitado ao ar e ressuspend-lo em 50 l de TE. Alquotas de 5 a 10 l podem ser utilizadas para anlise do DNA plasmidial purificado por eletroforese em gel de agarose.

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BIO12007- Biologia Molecular Bsica Roteiro de aulas prticas 3 Clivagem de DNA plasmidial com endonucleases de restrio Objetivo: clivar DNA do plasmdeo pUC18 com a endonuclease de restrio EcoRI. Material Endonucleases de restrio: EcoRI (1U/l). Uma unidade de atividade de uma endonuclease de restrio (1U) corresponde quantidade de enzima necessria para digerir completamente 1 g de DNA do bacterifago em uma reao de 1 h na temperatura tima de atividade da enzima (37C, para a maioria da endonucleases de restrio utilizadas em biologia molecular). Qualquer endonuclease de restrio deve ser sempre estocada em tampo adequado, contendo 50% de glicerol (para evitar congelamento) a -20C. Durante o uso, o tubo com a enzima deve ser sempre mantido em banho de gelo (0C).

Tampo de reao 10X para EcoRI Cada endonuclease de restrio tem sua atividade tima em um determinado tipo de tampo, com composio definida e tamponado para o pH timo para a atividade da enzima. Para e concentrao salina. Para EcoRI e Sau3AI, o tampo 10X utilizado : Tris-HCl NaCl MgCl2 DTT Procedimento: 1. Em um tubo tipo Eppendorf de 0,5 ml montar a seguinte reao de clivagem (pipetando os componentes na ordem indicada): 6 l de gua 2 l de tampo de reao 10X para EcoRI 10 l de DNA de pUC18 (da amostra preparada conforme o roteiro 2) 2 l de EcoRI (1 U/l) Volume total 20 l 2. Incubar durante 1 h a 37C. 3. Aquecer a amostras a 65C por 5 min para a inativao da enzima. 4. Aps a inativao da enzima, a reao de clivagem pode ser estocada a -20 C at a sua utilizao. 5. A anlise do DNA plasmidial clivado poder ser feita por eletroforese em gel de agarose. 50 mM, pH 8,0 100 mM 10 mM 1 mM

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BIO12007- Biologia Molecular Bsica Roteiro de aulas prticas 4 Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose Objetivo: preparar um gel de agarose para anlise de cidos nuclicos e resolver eletroforeticamente amostras de DNA plasmidial (pUC18) clivado ou no com EcoRI. Material: TBE 5X (Composio para 1 litro) Tris-HCl 54 g cido brico 27,5 g EDTA 0,5 M pH 8,0 20 ml Gel de agarose 0,8% TBE 5X agarose gua bidestilada

20 ml 0,8 g q.s.p. 100 ml

Tampo de amostra 5X (em TBE) Ficoll 15% Azul de bromofenol 0,15% Xilenocianol 0,15%

(migrao na altura de ~1 kb) (migrao na altura de ~4 kb)

Brometo de etdeo 1 mg/ml (Cuidado! O brometo de etdeo mutagnico e cancergeno. No tocar nos gis corados com brometo de etdeo sem a devida proteo. O professor dar as orientaes de segurana para manipulao e descarte dos gis). Transiluminador ultravioleta e mscaras de proteo

Procedimentos Preparao do gel: Preparar a soluo de agarose em frasco de Erlenmeyer e aquec-la (at a fervura) em banho-maria ou forno de microondas at a sua completa solubilizao. O frasco deve ser coberto, mas nunca selado, durante o aquecimento. Ele tambm deve ser agitado freqentemente para homogeneizao e para evitar transboradamento. Aps a solubilizao, a soluo de agarose deve ser resfriada por alguns minutos e a ela devem ser adicionados 20 l de uma soluo de brometo de etdio 1 mg/ml (concentrao final de 0,2 g/ml). Depois disso, agitar a soluo e vert-la sobre uma placa-molde de gel com o pente j montado. Aguardar a gelificao a temperatura ambiente por 30 min a 1 h. O gel assim preparado pode ser envolvido em filme plstico e armazenado por at 10 dias a 4C.

Preparao das amostras: Em tubos de microcentrfuda de 0,5 ml misturar 5 l de cada amostra de DNA de interesse (DNA plasmidial ntegro, preparado conforme o roteiro 2, e DNA plasmidial clivado com EcoRI, preparado conforme o roteiro 3), 3 l de gua e 2 l de tampo de amostra 5X. Eletroforese:

1. Colocar o gel de agarose 0,8% na cuba de eletroforese e submergi-lo em TBE 1X. 2. Aplicar as amostras no gel com uma micropipeta 4. Submeter as amostras a eletroforese a uma voltagem de 100V (correpondente a 50-70 mA), por aproximadamente 60 min. 5. Visualizar as amostras de DNA resolvidads eletroforeticamente colocando o gel sobre transluminador com iluminao ultravioleta (Cuidado! O ultravioleta pode causar queimaduras e mutagnico. No visualizar os gis sem as devidas precaues de segurana, que sero informadas pelo professor). .

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BIO12007 - Biologia Molecular Bsica Roteiro de aulas prticas 5 Purificao de fragmentos de DNA de gel de agarose Objetivos: Isolar fragmentos de DNA de gel de agarose pelo mtodo de freeze-squeeze. Referncia: Tautz, D. & Renz, M. An optimized freeze-squeeze method for the recovery of DNA fragments from agarose gels. Anal. Biochem. 132(1):14-19, 1983. Material: Gel de agarose 0,8% contendo amostras de DNA clivadas j resolvidas por eletroforese. Transiluminador ultravioleta e mscaras de proteo Bisturi, tubos de microcentrfuga de 1,5 ml, nitrognio lquido Tubo de 0,5 ml perfurado no fundo e na tampa contendo l de vidro siliconizada Soluo equilibrante (SE) Acetato de Sdio 0,3 M, pH 7,0 EDTA 1 mM Etanol absoluto e etanol 70%

Procedimentos: Os fragmentos de DNA foram previamente resolvidos por eletroforese em gel de agarose e corados com brometo de etdeo (gel agarose 0,8%; TBE 1X; brometo de etdeo 0,2 g/ml). 1. Visualizar os fragmentos de DNA no gel em transiluminador UV. Ateno: o UV induz quebras no DNA que prejudicam a clonagem; por isso, expor o DNA ao UV o mnimo de tempo necessrio). 2. Selecionar e cortar a(s) banda(s) de interesse do gel com auxlio do bisturi. Transferir o(s) fragmento(s) de gel cortado(s) para tubo(s) de microcentrfuga de 1,5 ml. 2. Estimar o volume do fragmento de gel. Adicionar um volume de SE correspondente a 10 vezes o volume estimado do fragmento de gel (por exemplo 1 ml para um fragmento com volume estimado de 100 l). Equilibrar o fragmento de gel de agarose no tampo SE a temperatura ambiente sob leve agitao durante 20 min. 3. Transferir o fragmento de gel para o tubo de microcentrfuga de 0,5 ml perfurado em ambas as extremidades e contendo l de vidro siliconizada no fundo. 4. Imergir o tubo em nitrognio lquido (-196C) at o total congelamento da amostra. Transferir imediatamente o tubo de 0,5 ml para um tubo de microcentrfuga de 1,5 ml sem tampa j posicionado na microcentrfuga. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min. 5. Medir o volume da soluo eluda no tubo de 1,5 ml e adicionar cerca de 2,5 volumes de etanol absoluto. Incubar a -70C por 10 min ou, alternativamente, manter o tubo por 1 h a -20C.

6. Centrifugar o tubo a 12.000 rpm durante 5 min. Descartar o sobrenadante e escorrer o excesso de lcool em papel absorvente. Lavar o precipitado com etanol 70%. Secar o precipitado deixando o tubo em estufa a 60C por 10 min. 7. Dissolver o precipitado de DNA (fragmento de DNA) em 10 l de gua bidestilada.

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BIO12007 - Biologia Molecular Bsica Roteiro de aulas prticas 6 Ligao de fragmento(s) de DNA purificado(s) de gel de agarose em vetor plasmidial clivado Objetivo: Ligar fragmentos de DNA separados eletroforeticamente e purificados de gel de agarose ao plasmdeo pUC18 clivado com EcoRI. Material: Fragmentos de DNA clivados com EcoRI, separados por eletroforese em gel de agarose e purificados de gel. DNA de pUC18 clivado com EcoRI. Tampo de ligao 10X Tris-HCl 300 mM, pH 7,8 DTT 100 mM ATP 10 mM MgCl2 100 mM DNA-ligase de bacterifago T4 (1 U/l) A enzima DNA-ligase do bacterifago T4 catalisa a formao de ligaes fosfodister entre as extremidades 5-fosfato e 3-hidroxila de fitas duplas de DNA justapostas. A ligao facilitada por pareamento, por pontes de hidrognio, entre extremidades coesivas, mas tambm acontece, com menor eficincia, entre molculas de DNA de extremidades cegas. Uma unidade de atividade de DNA-ligase definida como a quantidade de enzima necessria para catalisar a ligao de mais de 95% dos fragmentos gerados pela clivagem de 1 g de DNA do fago com HindIII, em 20 min a 16C.

Procedimento: Em tubos de microcentrfuga de 0,5 ml preparar a seguinte reao de ligao: 5 l de DNA de pUC18 clivado com EcoRI (preparado conforme o roteiro 3) 5 l de preparao de fragmento de DNA clivado e purificado (preparado conforme o roteiro 5) 2 l de tampo de ligao 10X 1 l de DNA-ligase de T4 (1U/l) 8 l de gua bidestilada _________________ Volume total: 20 l Incubar a reao de ligao a 16C por 14 a 16 h. Depois, estoc-la a -20C at a utilizao da mesma para transformao de clulas de E. coli (roteiro 7).

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BIO12007 - Biologia Molecular Bsica Roteiro de aulas prticas 7 Transformao gentica de bactrias I Objetivos: 1. Preparar clulas de E. coli competentes para transformao; 2. Tranformar clulas competentes de E. coli com DNA plasmidial por choque trmico. Material: Meio de cultivo Luria Bertani (LB). (Composio por litro de gua destilada) Triptona 10 g Extrato de Levedura 5g NaCl 10 g Ajustar o pH para 7 com NaOH 1N Ampicilina 50 mg/ml Frasco de Erlenmeyer (250 ml) Pipetas, placas de Petri e ponteiras Ala de Drigalski, copo de Becker com lcool Bico de Bunsen Gelo CaCl2 0,1 M Todo o material e solues devem ser esterilizados por autoclavao ou ultrafiltrao e manipulados em ambiente estril. Para tanto, trabalhe prximo ao bico de Bunsen (a uma distncia de at 20 cm da chama) ou em capela de fluxo laminar.

Ateno:

Procedimentos: Preparao de clulas de E. coli competentes (etapas 1 e 2 feitas previamente) 1. Inocular 1,5 ml de LB com uma colnia isolada de E. coli DH5 e incubar durante 16 h a 37C sob agitao. 2. Inocular 1 ml da pr-cultura em 100 ml (1/100) de LB em frasco Erlenmeyer de 250 ml. Incubar a 37C sob agitao at DO600 = 0,3 (aproximadamente 2h30min). 3. Transferir 20 ml da cultura para um tubo de centrfuga e centrifugar a 5.000 rpm por 5 min a 4C. Ateno: A partir deste passo, manter as clulas no gelo. 4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as bactrias em 5 ml de soluo de CaCl2 0,1 M gelada (4C). Incubar no gelo por 20 min. 5. Centrifugar a 5.000 rpm por 5 min a 4C. 6. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as clulas em 1 ml de CaCl2 0,1 M gelado. Manter as clulas no gelo. As clulas so agora consideradas competentes para transformao (permeveis a DNA exgeno).

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Tranformao bacteriana com DNA plasmidial 1. Em um tubo de microcentrfuga de 1,5 ml, misturar 100 l de clulas de E. coli competentes com a reao de ligao (preparada conforme o roteiro 6). Incubar no gelo por 20 min. 2. Durante o tempo de incubao da etapa 1, preparar uma placa de Petri com meio LB slido contendo ampicilina 100 g/ml: 25 ml de meio de cultura LB slido fundido por aquecimento em forno de microondas 50 l de ampicilina (50 mg/ml) 20 l IPTG 0,1 M 40 l X-gal 20 mg/ml 3. Transferir o tubo de microcentrfuga para um banho-maria a 42C por 2 min (choque trmico). Imediatamente recolocar o tubo no gelo. 4. Adicionar 0,9 ml de meio de cultura LB lquido e incubar a 37C por 30 minutos, sob agitao. Ateno: Durante a incubao, secar as placas de Petri (preparadas na etapa 2) em estufa a 60C. 5. 6. Espalhar 20 ou 100 l a suspenso de bactrias sobre a placa de Petri contendo meio LB/ampicilina com a ala de Drigalski Incubar as placas a 37C, invertidas, durante 16 h.

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BIO12007 - Biologia Molecular Bsica Roteiro de aulas prticas 8 Transformao gentica de bactrias II Objetivos: identificar colnias bacterianas transformantes portadoras de plasmdeos parentais daquelas portadoras de plasmdeos recombinantes. Procedimentos: Avaliao do resultado da transformao e da clonagem 1. Contar o nmero de colnias transformantes (nmero total de colnias: azuis + brancas). Estimar a eficincia de transformao (nmero de colnias por micrograma de DNA utilizado na transformao).

2. Contar o nmero de colnias recombinantes (brancas). Calcular a eficincia da clonagem (nmero de colnias brancas/nmero total de colnias x 100%). 3. Para confirmao da clonagem, pode ser extrado DNA plasmidial das provveis colnias recombinantes (roteiro 2) e ele pode ser clivado com EcoRI para liberao do inserto (roteiro 3) ou amplificado por PCR (roteiro 9) e analisado por eletroforese em gel de agarose (roteiro 4). Questes para discusso: 1. Como podemos diferenciar as colnias transformantes das no transformantes? 2. Qual a diferena entre as colnias brancas e as colnias azuis? 3. Qual a diferena entre um plasmdeo parental e um plasmdeo recombinante? 4. No plasmdeo pUC18, qual a importncia do stio de policlonagem estar localizado dentro do gene lacZ, que codifica a enzima -galactosidase. 5. Por que necessrio utilizar ampicilina no meio de cultura no qual so espalhadas as bactrias submetidas transformao por choque trmico?

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BIO 12007 - Biologia Molecular Bsica Roteiro de aulas prticas 9 Reao em cadeia da polimerase (PCR) Objetivo: amplificar um fragmento de DNA clonado no vetor pUC18. Introduo Em 1985, foi descrita a metodologia da reao em cadeia da polimerase (PCR, de polymerase chain reaction). Seu idealizador, Kary Mullis, recebeu, por isso, o Prmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1993. A PCR permite a produo de grandes quantidades de um determinado segmento de DNA in vitro a partir de uma pequena quantidade de DNA-molde, evitando assim a necessidade de introduo (clonagem) do DNA de interesse em bactrias. Referncias: Kubista, M.; Andrade, J.M.; Bengtsson, M.; Forootan, A.; Jonak, J.; Lind, K.; Sindelka, R.; Sjoback, R.; Sjogreen, B.; Strombom, L.; Stahlberg, A. & Zoric, N. The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects. Med., 27(2-3): 95-125, 2006. Mullis, K.; Faloona, F.; Scharf, S.; Saiki, R.; Horn, G. & Erlich, H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 51 Pt 1: 263-273, 1986. Saiki, R.K.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.B.; Horn, G.T.; Erlich, H.A. & Arnheim, N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230(4732): 1350-1354, 1985. Material: Iniciadores de cadeia direto (anela na extremidade 5 do molde) (20 pmol/l) Iniciadores de cadeia inverso (anela na extremidade 3' do molde) (20 pmol/l) DNA-molde (pUC18 recombinante, obtido conforme roteiro 8) dNTPs (desoxirribonucleotdeos): dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (10mM) Tampo da Taq DNA-polimerase (10X) Taq DNA-polimerase (1 U/l) Os iniciadores (primers) direto e inverso so oligonucleotdeos complementares a seqncias do vetor (conhecidas) que flanqueiam o stio no qual est inserido o fragmento clonado. A seqncia e a Tm de cada iniciador sero fornecidas pelo professor. A temperatura de anelamento dos iniciadores ao DNA-molde na PCR definida com base na Tm. Geralmente, ela deve ser de cerca de 20 a 25C abaixo da Tm dos iniciadores. Estimativa da Tm de iniciadores A seguinte frmula pode ser utilizada para estimar a temperatura mdia de fuso (Tm) de um iniciador: Tm (C) = 4 x (G + C) + 2 x (A + T)

Procedimentos: 1. Pipetar as seguintes solues em um tubo de centrfuga de 0,5 ml:

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gua bidestilada DNA molde (50 ng/l) Iniciador 5' (20 pmol/l) Iniciador 3' (20 pmol/l) Tampo da Taq DNA-polimerase (10X)* dNTP's (10 mM) Taq DNA-polimerase (0,5 U/l)** Volume total leo Mineral

__________

38 l 1,0 l 1,0 l 1,0 l 5,0 l 2,0 l 2,0 l

50,0 l 50,0 l

* 100mM Tris-HCl (pH 9,0), 15mM MgCl2, 500mM KCl ** em 50mM Tris-HCl (pH7,5); 0,1mM EDTA; 5mM DTT, e 50% glicerol Nota: Uma unidade enzimtica da DNA-polimerase definida como a quantidade de enzima necessria para catalizar a incorporao de 10 nmol de dNTP durante 30 min 74C. 2. Colocar a reao em um termociclador com a seguinte programao de ciclos de temperatura: 95C - 2 min DESNATURAO 95C - 45 s 65C - 45 s 72C - 45 s DESNATURAO ANELAMENTO EXTENSO

30 ciclos

4 C - indefinidamente ARMAZENAMENTO 3. Transferir cerca de 40l da fase inferior do tubo de reao (lembre que a camada superior o leo mineral) para um outro tubo. 4. Preparar uma amostra de 10 l do produto da reao para eletroforese em gel de agarose (conforme roteiro 4), adicionando 2 ml de tampo de amostra 5X. 5. Submeter a amostra a eletroforese em gel de agarose 0,8% (conforme roteiro 4).

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Roteiro de aula prtica 10 Seqenciamento de DNA pelo mtodo de terminao de cadeia por didesoxirribonucleotdeos (mtodo de Sanger) Objetivo: compreender o seqenciamento de DNA pelo mtodo de terminao de cadeia por didesoxirribonucleotdeos. O mtodo de terminao da cadeia por didesoxirribonucleotdeos (ddNTPs), descrito Frederick Sanger, em 1975, o mtodo de seqenciamento de DNA mais utilizado, devido sua praticidade. Pelo trabalho de desenvolvimento deste mtodo, Sanger recebeu, em 1980, o seu segundo Prmio Nobel de Qumica (ele j havia ganho um em 1958, pela elucidao da estrutura da insulina). O mtodo desenvolvido por Sanger pode ser utilizado tanto no seqenciamento de DNA manual como no automatizado, sendo que, neste ltimo caso, algumas adaptaes ao mtodo original so necessrias. Ele um mtodo enzimtico, baseado na atividade natural de polimerizao de nucleotdeos da DNA-polimerase, que capaz de estender uma cadeia polinucleotdica adicionando nucleotdeos complementares a uma fita-molde. Referncias: Sanger, F. & Coulson A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol., 94(3): 441-448, 1975. Sanger, F. The early days of DNA sequences. Nat Med., 7(3): 267-268, 2001. Atualmente, o seqenciamento pelo mtodo de terminao de cadeia com ddNTPs associado tcnica de PCR, o que confere uma srie de vantagens em relao a estratgias convencionais. Dentre estas vantagens, podemos citar: amplificao exponencial do DNA-molde, reduzindo a quantidade de DNA necessria. a alta temperatura utilizada durante cada ciclo de desnaturao elimina a necessidade da desnaturao alcalina e precipitao do DNA de fita-dupla. os ciclos de desnaturao tambm ajudam a evitar o rpido reanelamento dos moldes de DNA fita dupla. as elevadas temperaturas de anelamento aumentam a especificidade da hibridizao dos iniciadores ao DNA molde. a alta temperatura de polimerizao diminui a formao de estruturas secundrias do DNA molde e, deste modo, permite a polimerizao atravs de regies de DNA altamente estruturado. Reagentes e material necessrio: Termociclador Tampo de reao 10X DNA-molde de fita dupla (500fmol = 500 x 10-15mol) Desoxirribonucleotdeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) didesoxirrinucleosdeos trifosfatos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) marcados radioativamente ([-33P]-ddNTPs) ou com algum cromforo (em geral, corantes fluorescentes). Iniciador de cadeia (oligonucleotdeo complementar a uma das fitas do DNA-molde) DNA-polimerase Procedimentos bsicos:

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 Devem ser montadas quatro reaes diferentes, cada uma delas incluindo os componentes descritos acima e com a seguinte composio de nucleotdeos: Reao A: com ddATP, dATP, dCTP, dGTP e dTTP Reao C: com ddCTP, dATP, dCTP, dGTP e dTTP Reao G: com ddGTP, dATP, dCTP, dGTP e dTTP Reao T: com ddTTP, dATP, dCTP, dGTP e dTTP A proporo entre o ddNTP e os dNTPs deve ser cuidadosamente equilibrada em cada reao, de forma a permitir o mximo de alongamento possvel s cadeias sintetizadas, mas com uma probabilidade relativamente elevada de incorporao do ddNTP e trmino da cadeia na qual isso ocorre. Os componentes de cada reao permitiro que a DNA-polimerase estenda a cadeia de DNA, a partir do iniciador anelado ao DNA-molde, at que haja a incorporao de um ddNTP marcado. A base seguinte no ser incorporada devido ausncia da hidroxila na posio 3' necessria para a extenso da fita pela DNA-polimerase. Amostras de 5 l de cada uma das 4 reaes (A, C, G e T) so submetidas, em paralelo, a eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante (uria) e a temperatura elevada (40-50C). Estas condies desnaturantes no permitem que haja o reanelamento do DNA de fita dupla ou a formao de pareamentos intracadeia em cada amostra. Assim, as cadeias de DNA sintetizadas em cada reao permanecem na forma de fita simples linear, sendo separadas apenas de acordo com as diferenas de tamanho. Aps a eletroforese, o gel de poliacrilamida colocado sobre uma folha de papel filtro e secado sob vcuo a alta temperatura. O papel filtro seco com o gel de poliacrilamida aderido transferido para um cassete e um filme radiogrfico exposto a ele. O filme revelado aps 1 a 3 dias de exposio, dependendo do sinal radioativo.

Questes para discusso: 1. Qual o resultado experado para a anlise das amostras na auto-radiografia (nmero de bandas e tamanho de cada uma delas em cada amostra? 2. Como o resultado da auto-radiografia interpretado de modo a permitir a determinao da seqncia de DNA do molde? 3. Qual a orientao da seqncia lida a partir do gel? 4. Qual a seqncia e a orientao da fita utilizada como molde no seqenciamento?

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE BIOCINCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA BIO 12007 - Biologia Molecular Bsica

INFORMAES ADICIONAIS SOBRE REAGENTES E METODOLOGIAS COMUMENTE UTILIZADOS EM MTODOS EXPERIMENTAIS PARA A MANIPULAO DE CIDOS NUCLICOS

Soluo de lise (NaOH e SDS): saponificao de lipdeos e rompimento da parede bacteriana pela solubilizao da bicamada lipdica. O pH elevado do Tris-HCl inibe a ao das DNAses. EDTA: (cido etilenodiaminotetractico) inibe a atividade de desoxirribonucleases (DNases) pois atua como agente quelante de ons essenciais para a atividade destas enzimas (Mg2+) SDS: um detergente aninico que solubiliza lipdeos. um desnaturante de protenas e tambm rompe ligaes no-covalentes inter-subunidades de protenas oligomricas. Tambm utilizado para se certificar que nenhuma nuclease que no depende de Mg2+ cause qualquer degradao no DNA. NaCl: ons no meio aquoso podem romper ligaes inicas de cadeias polipeptdicas. Tambm auxiliam na dissociao das protenas ligadas aos cidos nuclicos. Solventes orgnicos: aqueles que tm uma poro hidrofbica (lipoflica) e uma poro polar so agentes de precipitao de macromolculas. Os grupos polares interagem com grupos polares proticos em competio com molculas de gua. Os grupos hidrofbicos podem romper interaes intramoleculares estabilizantes da estrutura da protena. Um volume elevado de solvente orgnico reduz a concentrao efetiva da gua, deixando menos molculas de gua para hidratao da protena. Isto , modificam a camada de solvatao das protenas. Fenol-clorofrmio: contaminantes proticos so desnaturados e h partio das mesmas na fase orgnica ou interface entre as fases orgnica e aquosa, enquanto que cidos nuclicos permanecem na fase aquosa. A utilizao de fenol-clorofrmio mais eficiente do que a utilizao de somente um deles. Lipdeos, grandes polissacardeos e protenas complexadas ao SDS permanecem na fase fenlica. lcool isoamlico: reduz a formao de espuma e ajuda a separao e a manuteno da estabilidade das camadas orgnica e aquosa aps a separao por centrifugao. Etanol: utilizado para precipitar cidos nuclicos com mais do que 15 nucleotdeos. Sais e outros solutos tais como fenol e clorofrmio ficam em soluo enquanto que cidos nuclicos formam um precipitado branco que pode ser coletado por centrifugao. Tampes contendo > 1mM fosfato ou > 10mM EDTA no devem ser utilizados para precipitao com etanol, pois estas substncias co-precipitam com os cidos nuclicos. Acetato de sdio: utilizado para a precipitao de DNA e RNA. mais solvel em etanol do que NaCl. Plasmdeos: so elementos genticos extracomossmicos com capacidade de replicao autnoma. Alguns plasmdeos podem conferir vantagens s clulas hospedeiras, como por exemplo, proporcionar resistncia a substncias anti-microbianas. Caractersticas desejveis para plasmdeos utilizados como vetores para clonagem molecular: Tamanho relativamente pequeno (3 a 5 kb)

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Multicpia Possuem gene marcador que permite a seleo de bactrias transformantes (gene que confere resistncia a um antibitico, por exemplo) Possuem gene marcador que permite a seleo de recombinantes (gene que confere resistncia a um segundo antibitico ou que codifica uma proena/enzima que confere fentipo visualmente identificvel a uma colnia de bactria portadora do plasmdeo, por exemplo) Stio(s) nico(s) para endonuclease(s) de restrio (preferencialmente um ou mais sobre a seqncia de um gene marcador). Endonucleases de restrio e sistemas de restrio/modificao em bactrias Endonucleases de restrio so enzimas que reconhecem e clivam ligaes fosfodister de seqncias especficas de DNA. As endonucleases de restrio no clivam a seqncia de seu stio de reconhecimento no DNA quando ela tiver um ou mais nucleotdeos modificados enzimaticamente. Estas modificaes enzimticas so feitas, por exemplo, por metilases que adicionam grupos metila a nucleotdeos em seqncias especficas, as mesmas reconhecidas e clivadas pela endonuclease de restrio correspondente. Diferentes espcies e cepas de bactrias possuem pares nicos de enzimas de restriomodificao, de modo que o DNA de uma bactria imune (por ser modificado) clivagem pela enzima de restrio que ela produz. Quando um DNA exgeno, como, por exemplo o de um bacterifago (vrus que infecta bactrias), introduzido numa clula bacteriana com sistema de restrio-modificao, ele imediatamente clivado pela endonuclease de restrio e rapidamente degradado. Uma unidade enzimtica de restrio (1U) a quantidade de enzima necessria para clivar completamente 1g de DNA do bacterifago , em 1 hora, na temperatura tima de atividade da enzima (em geral, 37C). Anlise eletrofortica em gel de agarose A agarose um polmero linear extrado de algas marinhas, composto de D-Galactose e LGalactose. Quando a agarose fundida e posteriormente resfriada, ocorre a formao de uma matriz ou gel, que serve como uma peneira para a separao de fragmentos de DNA de diferentes tamanhos. A eletroforese em gel de agarose uma tcnica simples, fcil e sensvel, capaz de separar fragmentos com maior resoluo do que outros mtodos, como a centrifugao em gradientes de CsCl (cloreto de Csio), por exemplo. Outra vantagem que os cidos nuclicos podem ser visualizados no gel, pelo uso do corante fluorescente Brometo de Etdeo (exc300nm; 590nm, vermelho-laranja). Este corante se intercala entre os pares de bases empilhados da molcula de DNA/RNA. A fluorescncia do Brometo de Etdeo associado a cidos nuclicos maior do que livre em soluo, permitindo, deste modo, que pequenas quantidades de DNA/RNA sejam detectadas (cerca de 10ng DNA ou RNA por banda). Fatores que influenciam a migrao em gel de agarose: Concentrao da amostra. Tamanho dos fragmentos de DNA: fitas lineares duplas passam atravs da matriz do gel a uma velocidade inversamente proporcional ao log pb (fragmento menor mais rpido). Conformao do DNA: o formato do fragmento de DNA de um determinado tamanho influencia a velocidade de migrao (circular fechado: + rpido; circular aberto: mais lento; linear: intermedirio). Corrente aplicada: maior voltagem resulta em migrao mais rpida. (voltagens muito altas ou muito baixas no so recomendadas). Voltagem normal: 5-10 V/cm Direo do campo eltrico: DNA migra em direo ao nodo (carga positiva) devido aos grupamentos fosfato de carga negativa. Composio do tampo de eletroforese: na ausncia de ons a condutncia eltrica mnima e o DNA migra bem devagar. Em tampes de alta fora inica a condutncia eltrica alta e uma grande quantidade de calor gerada - no pior caso o gel derrete e o DNA desnatura. Tambm a carga funo do pH do tampo.

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Transformao: A transformao a introduo de molculas de DNA em uma clula hospedeira (bactrias e clulas eucariticas, incluindo clulas vegetais e animais). Vrias tcnicas tm sido descritas para a introduo de DNA em clulas bacterianas, como choque trmico e eletroporao. a) Choque trmico: as clulas hospedeiras (preparadas com cloreto de clcio) so misturadas com molculas de DNA e submetidas a um choque trmico que resulta num aumento da eficincia da transformao. Os mecanismos envolvidos na transformao de DNA no so completamente conhecidos. Mas os requerimentos essenciais para uma transformao eficiente so a presena de ctions multi-valentes, incubao a 0C e controle rigoroso do choque trmico a 42C. A proporo de clulas que se tornam competentes para transformao de aproximadamente 10% da populao total. Eficincia: 105-106 colnias transformadas/g de DNA plasmidial. b) Eletroporao: um processo fsico que transitoriamente permeabiliza membranas de clulas procariticas e eucariticas a partir de um pulso eltrico. Eficincia: 109 - 1010 colnias transformadas/g de DNA plasmidial. A eletroporao feita a baixa temperatura (0-4C), pois a eficincia reduzida em cerca de 100 vezes temperatura ambiente. c) Balstica de Micropartculas: Projteis de ouro (ou tungstnio) so cobertos com molculas de DNA e utilizados para bombardear clulas hospedeiras. Anlise de colnias: As colnias so analisadas utilizando algum marcador que permita a diferenciao entre as clulas no-transformadas, clulas portadoras do plasmdeo (transformadas) e clulas contendo o plasmdeo recombinante. Reao em cadeia da polimerase (PCR) Dois desenvolvimentos tecnolgicos simplificaram e tornaram mais eficiente a PCR: 1) a utilizao de DNA-polimerase termoestveis, principalmente a enzima isolada de Thermus aquaticus (Taq DNA-polimerase), que permanece ativa mesmo em temperatura altas o suficiente para desnaturarem a fita dupla do DNA. A Taq DNA-polimerase tem uma meia-vida de 40 min a 94 - 95C. Esta enzima consiste de uma nica cadeia polipeptdica, com uma massa molecular de 95 kDa. A Taq DNA-polimerase tem atividade mxima em uma temperatura em torno de 75C e no pH 9. Uma unidade de atividade de uma DNA-polimerase definida como a quantidade de enzima necessria para catalizar a incorporao de 10 nmol de dNTP em uma reao de polimerizao de 30 min nas condies timas para a enzima. 2) o desenvolvimento do termociclador programvel permitiu que a alternncia das etapas de aquecimento e resfriamento de cada ciclo da PCR pudesse ser automatizada, o trabalho manual tedioso de transferncia das amostras entre blocos de aquecimento em diferentes temperaturas. Os componentes bsicos necessrios para a execuo de uma PCR so: DNA-molde contendo a seqncia de DNA a ser amplificada DNA-polimerase (preferencialmente uma termo-estvel) dois oligonucleotdeos iniciadores (primers) complementares a seqncias (conhecidas) que flanqueiam o segmento de DNA a ser amplificado. Os iniciadores devem ter orientaes opostas, isto , cada um deve anelar em uma fita diferente do DNA-molde de fita dupla. desoxirribonucleotdeos trifosfatados (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) tampo de reao da DNA-polimerase (contendo MgCl2, DTT) As etapas de uma PCR A PCR consiste de vrias etapas que so repetidas durante o processo de amplificao do DNA molde: 1) Desnaturao: a fita dupla do DNA-molde desnaturada termicamente em suas fitas simples (94-95C, por 15 s a 2 min)

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2) Anelamento: os iniciadores (oligonucleotdeos) anelam por complementaridade s fitas do DNA-molde a uma temperatura mais baixa (20 a 25C abaixo da Tm dos iniciadores) do que a utilizada na etapa anterior (40-60C, por 30 s a 1 min) 3) Extenso (sntese): os iniciadores anelados ao DNA-molde servem como pontos de partida para que a DNA-polimerase os alongue, sintetizando uma fita de DNA complementar e de orientao inversa quela do DNA-molde. Isso feito a partir da incorporao seqencial de dNTPs na extremidade 3 da cadeia nascente. Ao trmino desta etapa, foi dobrado o nmero de fitas correspondente a regio amplificvel do molde (entre os stios de anelamento dos iniciadores). A temperatura para extenso geralmente de 72C e a sua durao de 1 min por kb do produto de amplificao esperado. As 3 etapas descritas acima constituem um ciclo, que repetido vrias vezes (de 20 a 40 vezes). Ao final de cada ciclo, ocorre a duplicao do nmero de molculas de DNA de fita dupla que havia no ciclo anterior. Isto , h uma amplificao exponencial da seqncia do DNA-alvo: 2n, onde n = nmero de ciclos. Por exemplo, ao trmino de 20 ciclos haver 220 (mais de 1 milho) cpias da poro amplificada do DNA-molde. A concentrao dos iniciadores alta (em excesso), o que faz com que a hibridizao (anelamento) dos mesmos ao DNA-molde ocorra rapidamente (em segundos), aps a desnaturao e o resfriamento. O DNA amplificado pode ento ser analisado (quanto ao tamanho, quantidade e seqncia) por eletroforese em gel de agarose, clonagem e/ou seqenciamento. RT-PCR para a amplificao de seqncias derivadas de produtos de transcrio (RNA) As DNA-polimerases utilizadas na PCR utilizam fitas de DNA como molde (so DNApolimerases DNA-dependentes) e, portanto, a metodologia tem sua aplicao limitada amplificao de molculas de DNA. A amplificao de seqncias derivadas de RNA (especialmente mRNA), para anlise qualitativa e quantitativa de produtos de transcrio, depende, ento, de uma etapa inicial, na qual a seqncia de RNA convertida em uma seqncia de DNA. Para isso, so utilizadas DNA-polimerases RNA-dependentes de vrus eucariticos, chamadas de transcriptases reversas. Estas enzimas utilizam uma fita-molde de RNA para a sntese de uma fita de DNA correspondente (complementar e de orientao oposta do molde). A fita de DNA complementar (cDNA) sintetizada pode ento ser utilizada como molde em uma reao de PCR tradicional. A metodologia de PCR precedida pela sntese de cDNA por transcrio reversa para a amplificao de seqncias correspondentes a um RNA chamada de RT-PCR (RT = reverse transcription).

Cuidados para evitar produtos de amplificao decorrentes de contaminao da amostra (falsos positivos) A contaminao com cpias idnticas ou seqncias muito similares do DNA-molde e passveis de hibridizao com os iniciadores. Este o problema mais srio e tambm o de ocorrncia mais provvel, devido grande sensibilidade da tcnica. Mesmo a presena de poucas molculas contaminantes poder levar gerao de produtos de amplificao em quantidades detectveis. As seguintes precaues devem ser tomadas a fim de evitar contaminaes: utilizar material descartvel. utilizar reagentes previamente aliquotados em lotes submetidos a um controle de qualidade exigente. utilizar pipetadores automticos (nunca pipetar reagentes com a boca). analisar os produtos da amplificao em uma rea fisicamente separada da rea onde reagentes e amostras so preparados. sempre utilizar um controle negativo de amplificao (reao sem DNA-molde).

Exemplos de aplicaes da PCR

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 Caracterizao estrutural e funcional de genes. A PCR permite analisar a estrutura e a organizao de genes e seus produtos de RNA. Amplificao de DNA para posterior clonagem, seqenciamento e caracterizao estrutural e funcional. Estudos genticos e taxonmicos, para identificao e anlise de marcadores moleculares associados a caractersticas fenotpicas. Identificao de variabilidade entre indivduos e anlises filogenticas. Controle de qualidade, para avaliao da origem e composio de amostras derivadas de material biolgico e/ou deteco de material oriundo de organismos contaminantes. Diagnstico molecular de doenas infecciosas e genticas. Alguns exemplos prticos da utilizao da PCR: Diagnstico de infeces por Mycobacterium tuberculosis: a microscopia de escarro seguida pela cultura o mtodo tradicional para o diagnstico da tuberculose. No entanto, estes mtodos bacteriolgicos so lentos e caros. Alm disso, estes mtodos apresentam baixa sensibilidade quando as amostras clnicas tm um pequeno nmero de clulas do patgeno. A seqncia de insero IS6110 especfica do complexo M. tuberculosis e est presente em diversas cpias no genoma da bactria, tornando a IS6110 um alvo excelente para amplificao visando deteco do patgeno em amostras de escarro de pacientes com suspeita de tuberculose. A visualizao do produto de PCR em gel de agarose ou em dot-blot colorimtrico indica a presena deste patgeno na amostra. Nota: os elementos de insero (IS) so elementos genticos transponveis que carregam apenas a informao gentica essencial para a prpria transposio. Esta informao gentica constituda por seqncias de DNA repetidas e invertidas que flanqueiam um gene codificador de uma transposase, que reconhece as seqncias repetidas e catalisa o processo de transposio da IS. Referncia: Sperhacke RD, Mello FC, Zaha A, Kritski A, Rossetti ML. Detection of Mycobacterium tuberculosis by a polymerase chain reaction colorimetric dot-blot assay. Int J Tuberc Lung Dis., 8(3): 312-317, 2004. Diagnstico da AIDS (infeco pelo human immunodeficiency virus type 1, HIV-1). O HIV-1 um dos agentes etiolgicos da sndrome da imunodeficincia adquirida (AIDS) em seres humanos. A presena do vrus em leuccitos pode ser detectada por ensaios de PCR de amostras de sangue do paciente com suspeita da infeco, utilizando iniciadores derivados de seqncias do genoma viral. Referncia: Sahni AK, Gupta RM, Jena J, Nair MN. Early detection of HIV-1 in infants by PCR. Indian J Pathol Microbiol., 48(1): 49-52, 2005. Identificao de cepas de Staphylococcus aureus (Gram+) resistentes meticilina. Cepas de S. Aureus resistentes ao antibitico meticilina so responsveis por um grande nmero de infeces hospitalares. A amplificao por PCR do gene mecA da bactria, que codifica a protena responsvel pela resistncia ao antibitico (penicillin-binding protein-2a, PBP-2a), permite distinguir cepas resistentes (que possuem o gene) de cepas sensveis (que no o possuem) ao tratamento com antibiticos -lactmicos. Referncia: Carroll, R.B. Leonard, P.L. Newcomb-Gayman and D.R. Hillyard, Rapid detection of staphylococcal mecA gene from Bactec blood culture bottles by the polymerase chain reaction. Am. J. Clin. Pathol. 106: 600605, 1996.

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A PCR pode ser usada para diagnsticos de doenas de etiologia gentica, como a fibrose cstica A fibrose cstica do pncreas, ou mucoviscidose, uma das doenas genticas mais comuns, tendo um padro de herana autossmico recessivo. Se um casal tiver uma criana afetada, o risco de que uma segunda criana venha a apresentar a mesma sndrome de 25%. Mutaes no gene CFTR so responsveis pelo quadro clnico. Essas mutaes podem causar as formas clssicas de fibrose cstica (caracterizadas por pneumonias de repetio com ou sem envolvimento pancretico) bem como sinais mais leves da doena, como pancreatite ou esterilidade masculina em decorrncia de agenesia dos vasos deferentes. J foram descritas mais de 1000 mutaes diferentes no gene CFTR e, portanto, a triagem de todas as mutaes invivel economicamente. Na populao brasileira, as mutaes mais freqentes so DF508 (no xon 10 do gene) e G542X (no xon 11 do gene) e sua anlise permite confirmar o diagnstico clnico em 39% dos casos com a forma clssica de fibrose cstica. A presena destas mutaes detectada pela amplificao, por PCR, e o posterior seqenciamento das regies do gene CFTR correspondentes aos xons 10 e 11. Referncia: Raskin S, Phillips JA, Kaplan G, McClure M, Vnencak-Jones C, Rozov T, Cardieri JM, Marostica P, Abreu F, Giugliani R, Reis F, Rosario NA, Ludwig N, Pereira L, Faucz F, Gabardo J, Culpi L. Geographic heterogeneity of 4 common worldwide cystic fibrosis non-DF508 mutations in Brazil. Hum Biol., 71(1): 111-121, 1999. Otimizao da PCR [MgCl2] DNA molde, agentes quelantes na amostra (ex. EDTA), dNTPs e protenas alteram a [Mg2+] livre. Ausncia de [Mg2+] adequada: Taq DNA Polimerase inativa. Excesso de Mg2+ livre: reduo da fidelidade enzimtica e aumento de produtos no especficos. Importante: determinar empiricamente [Mg2+] tima para cada reao. Tampo Ausncia de Triton X-100: pouca ou nenhuma atividade da Taq DNA-polimerase. [Enzima] Recomendado: 1,25U da Taq DNA-polimerase em reao de 50 l. A adio de mais enzima no altera a quantidade de produto formado ao final da reao. Rastro de DNA em gel de agarose: tempos de extenso muito longos e/ou excesso de enzima levam ao aumento da atividade de exonuclease 5'3' da Taq DNA-polimerase, levando gerao de produtos de degradao exonucleoltica.

Projeto dos iniciadores de cadeia Tamanho ideal: entre 15 e 30 nt Contedo de G+C: entre 40 e 60% Evitar seqncias que permitam a formao de estruturas secundrias exemplo: 5' CCCCATTGGGG 3' T A T C G C G C G C G

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As extremidades 3' dos dois iniciadores da reao no devem ser complementares, de modo a evitar a formao de dmeros de iniciadores na reao de PCR 5' ATCGTAATGCGC 3' 5' CTAATTGCGCA 3' 5' ATCGTAATGCGC 3' 3' ACGCGTTAATC 5'

As Tm dos dois iniciadores devem ser similares. Em caso de diferena, a temperatura de anelamento deve ser calculada com base no iniciador com menor Tm. Qualidade da soluo com o DNA-molde Contaminao com reagentes utilizados na preparao de amostras de DNA, como sais, guanidina, proteases, solventes orgnicos e SDS, pode inibir a atividade da Taq DNA-polimerase. Quantidade de DNA Erros muito comuns: DNA-molde em excesso Aconselha-se iniciar com pelo menos 104 cpias da molcula do DNAmolde, mas a concentrao do DNA-molde na reao deve ser 10ng/l. (1 g de um fragmento de DNA de fita dupla de 1 kb = 9,12 x 1011 molculas)

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