APBac 11

UNIVERSIDADE DE CUIAB-UNIC
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Diagnstico Laboratorial em Microbiologia Clnica

BACTERIOLOGIA

Profa. Evelin Rodrigues Martins
Profa. Ana Caroline A. Yamamoto
Profa. Rosane Christine Hahn

Cuiab 2011
Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software
http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Apresentao

Esta apostila se destina a complementar as atividades de estgio supervisionado em
Bacteriologia Clnica ministrado aos alunos do curso de Farmcia da Universidade de Cuiab,
UNIC.
A prtica da Bacteriologia Clnica parte importante da formao do farmacutico para
proporcionar ao aluno concluinte do curso um alicerce de conhecimentos bsicos necessrios para:

Aplicar, na prtica diria do laboratrio, os princpios de biosegurana;

Conhecer e aplicar corretamente tcnicas de coleta, semeadura e processamento de
materiais biolgicos diversos;

Isolar e identificar microrganismos presentes em um material biolgico, relacionando-os
com a microbiota (quando houver) e possveis contaminantes, para que seja
diagnosticada a real etiologia de uma infeco;

Realizar teste de sensibilidade a antibacterianos, segundo tcnicas adequadas, para que
seja garantido um resultado fidedigno que oriente a teraputica aplicada ao paciente e
garantindo a qualidade dos resultados.

Todas as informaes contidas nesta apostila foram adaptadas conforme rotina do setor de
microbiologia do Laboratrio Escola de Anlises Clnicas do Hospital Geral Universitrio (LEAC-
HGU) como guia terico-prtico.
Entretanto vale ressaltar que outros laboratrios de anlises clnicas do Mato Grosso e de
diferentes Estados brasileiro adotam rotinas microbiolgicas diversificadas. Desse modo, no
decorrer dos anos e dcadas, novas informaes terico-prtico do mundo microbiolgico nos
enriqueceram durante nossa vida profissional, para que possamos contribuir com a sade e o bem
estar da populao.
As autoras.

Considerem a diferena de tamanho entre algumas das menores e das maiores criaturas
existente na terra. Uma pequena bactria pesa 0, 000 000 01 grama. A baleia azul pesa cerca
de 100 000 000 grama. Mas mesmo assim uma bactria capaz de matar uma baleia. So to
grandes a capacidade de adaptao e a versatilidade dos microorganismos, comparados aos
seres humanos e outros organismos tidos como superiores, que eles sem dvida continuaro
a colonizar e alterar a superfcie da Terra logo depois que ns e o resto de nossos co-
habitantes deixarmos a cena para sempre . Os micrbios, e no os macrbios, dominaro o
mundo.
Bernard Dixon, 1994.


ndice
1- Microbiota Corpo Humano 01
2-Biosegurana em Microbiologia 02
3-Meios de Cultura 06
3.1- Controle de qualidade dos meios de cultura. 10
4- Tipos de Semeadura 15
5- Processamento das Amostras Biolgicas nos Meios de Cultura em Bacteriologia. 17
6- Interpretao Macroscpica das Bactrias em Meios de Cultura. 26
6.1- Interpretao do crescimento microbiolgico nos meios de cultura. 29
7- Preparo e Fixao do Esfregao Bacteriolgico. 32
8- Principais Coloraes em Bacteriologia 35
9- Identificao Bioqumica de Bactrias de Importncia Mdica. 37
9.1- Cocos Gram Positivos (CGP) 37
9.2- Bacilos Gram Negativos (BGN) 46
9.2.1- Fermentadores de Glicose (Enterobactrias) 46
9.2.2- No Fermentadores de Glicose 51
9.3- Bacilos lcool cido Resistente (BAAR) 51
9.4- Diplococos Gram Negativos 53
9.5- Bacilos Gram Negativos Pleomrficos 54
9.6- Chlamydia spp. e Treponema spp. 56
9.7- Mycoplasma spp. e Ureaplasma spp. 57
10- Diagnstico laboratorial das Infeces Genitais. 58
11- Teste de Susceptibilidade Antibacteriana (TSA). 61
11.1- Mtodos Utilizados na Execuo do TSA. 61
11.2- Procedimentos de Execuo do TSA por Disco-Difuso. 62
11.3- Mecanismo de Ao dos Antibiticos. 63
12- Resistncia Bacteriana aos Antibiticos. 65
12.1- Principais Mecanismos de Resistncia Bacteriana. 65
12.2- Resistncia dos CGP e BGN Alguns Antibiticos. 67
12.3- Triagem Fenotpica de Resistncia Bacteriana Rotina Laboratorial. 68
13-Referncias Bibliogrficas 72
14- Anexos 73


1
1-Microbiota Corpo Humano

O corpo humano habitado por um grande nmero de microrganismo, que, juntos, so chamados
microbiota ou flora normal. A maioria dos membros da flora normal so bactrias, mas fungos e
protozorios tambm so encontrados.
No corpo humano sadio, os rgos internos como sangue, crebro, msculos e outros, so
normalmente livres de microrganismos. De modo contrrio, os tecidos superficiais como a pele e
membranas mucosas esto constantemente em contato com os microrganismos do meio ambiente e
so normalmente colonizados por certas espcies microbianas, conforme tabela abaixo.

Bactrias comumente encontradas no corpo humano.
Bactrias Pele Conjuntiva Nariz Faringe Boca Intestinos Uretra anterior Vagina
Staphylococcus aureus
S. epidermidis
Streptococcus mitis
Streptococcus salivarius
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Enterococcus faecalis
Neisseria spp.
Neisseria meningitidis
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Haemophilus influenzae
Bacterioides
Lactobacilos
Clostridium tetani
Corynebacterium
Micoplasmas
Legenda: comum; irregular ou incerto; proeminente.
Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratrio Clnico. Revinter: Rio
Janeiro. 2006. p70.

Os microrganismos da microbiota ou flora normal no causam doenas.
Eles so residentes de um corpo saudvel e so ocupantes permanentes.
J aqueles que so transitrios do corpo humano saudvel podem estabelecer-se brevemente, mas
tendem a ser excludos por competio com os residentes ou pelos mecanismos de defesa
imunolgicos do hospedeiro. Os microrganismos transitrios no so considerados como parte da
flora ou microbiota normal.
Alguns organismos da microbiota normal podem ser patgenos oportunistas, causam infeces se
ocorrer danos teciduais em stios corpreos especficos ou se a resistncia do corpo infeco
diminuda.
Deste modo, importante conhecer os tipos de microrganismos que habitam o corpo saudvel. Este
conhecimento fornece discernimento dos tipos de infeces que podem ocorrer, aps um trauma
tecidual, em vrios stios, bem como, a funo desempenhada pela flora normal de prevenir a
colonizao do nosso corpo pelos micrbios.


2
2-Biosegurana

A segurana da rotina laboratorial de suma importncia na organizao do ambiente de
trabalho, bem como para nossa proteo pessoal. Portanto, devemos usar corretamente os
equipamentos proteo individual (EPIs) e equipamentos de proteo coletivos (EPCs). Isso se deve
aos diferentes tipos de nveis de segurana classificados conforme a atividade e o microrganismo de
maior risco que venham ser manipulados por diferentes profissionais da rea de sade.

Classificao dos laboratrios segundo os nveis de biosegurana
Resumo dos nveis de segurana recomendados para agentes infecciosos
Agentes Condutas EPI e EPC Outros
Nvel 1
No causam
doenas ao
homem
-Boas prticas de
laboratrio
-Jaleco, luva*,
culos de
proteo (qdo
necessrio)
-Pia
-Lava olhos
Nvel 2
Associados com
doena infecciosa
-Condutas do nvel 1
-Acesso limitado
-Sinalizao de
infectante
-Cuidados com
perfurocortantes
-Normas para
descontaminao
-Cabine de
segurana (classe
II)
-Jaleco, luvas e
culos de
proteo
-Necessidades do
nvel 1
-Descontaminao
antes do descarte de
resduos (ex.:
autoclavao)
Nvel 3
Associados com
danos
potencialmente
letais
-Condutas do nvel 2
Acesso controlado
com ante-sala
Descontaminao de
todo o lixo (ex.:
autoclavao)
-EPI do nvel 2
-Jaleco adicional
(descartvel)
-Mscara
apropriada (N95)
-Necessidades do
nvel 2
-Sistema de exausto
controlado e
exclusivo de presso
negativa
-Porta com
fechamento
automtico

Nvel 4
Associados a
agentes de risco
de transmisso
desconhecida
-Condutas do nvel 3
-Troca de roupa na
entrada
-Ducha na sada
Descontaminao de
todo o material antes
de sair das instalaes
-EPI do nvel 3
-Cabine de
segurana classe
II B3 ou B2
-Roupas especiais
com sistema
individual de
presso positiva

-Necessidades do
nvel 3
-Laboratrio em
edifcio isolado
*O uso de luvas indicado quando existem leses em pele
Fonte: OPLUSTIL, C. P.; et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. 2 Edio. So Paulo. 2004.
Pg. 02.

Equipamentos de Proteo
Os equipamentos de proteo incluem cabine de segurana biolgica combinada com o uso
de EPIs (luvas, jalecos, gorros, pr-ps, mscaras ou culos de proteo), dependendo do nvel de
segurana necessrio.


3
Cabine de Segurana Biolgica
So trs os tipos de cabine de segurana biolgica:

Classe I
O fluxo de ar ocorre de fora para dentro, pela abertura frontal, sem recirculao do ar. O ar
da cabine passa por um filtro HEPA antes de ser liberado para o interior do laboratrio.

Classe II
Cabine de abertura frontal na qual uma parte do ar recirculado. Este tipo de cabine se
subdivide em:
AII
30% de ar ambiente entram pela abertura frontal; 70% recirculado para o interior da cabine
passando por um filtro HEPA; 30% so exauridos para dentro ou fora do laboratrio atravs de
outro filtro HEPA.
B3
70% de ar ambiente entram pela abertura frontal; 30% recirculado para o interior da cabine
passando por um filtro HEPA; 70% so exauridos para fora do laboratrio atravs de outro filtro
HEPA e por um sistema de exausto.
B2
100% de exausto. Sem circulao do ar protegendo o operador, o material manipulado e o
ambiente.

Classe III
Cabine hermeticamente fechada, impermevel a gases, e todo o trabalho realizado com
luvas de borracha que esto presas cmara.
O ar que entra passa por um filtro HEPA e o ar que sai pelo exaustor passa por outros filtros
HEPA dispostos sequencialmente.

Vias de Infeco
Existem diversas vias pelas quais podem ocorrer infeces no laboratrio de microbiologia.
Dentre elas podemos citar:
Inalao: provocada pela formao de aerossis.
Ingesto: provocada devido pipetagem da amostra com a boca e no lavar as mos
antes da refeio, de beber ou fumar.
Inoculao Direta: provocada por um acidente
Contato com membrana mucosa: contaminao com certos organismos atravs da
mucosa oral, ocular, etc.

Limpeza
Uma das atividades mais importantes para manter a rea fsica e os equipamentos em
condies adequadas a limpeza geral do laboratrio. A limpeza inclui o cuidado com as
superfcies e com o resduo gerado dentro do laboratrio.
Para descontaminao de artigos e superfcies do laboratrio podem ser utilizados alguns
procedimentos e produtos, tais como:
Autoclave:
Concentrao Vapor saturado 121C por 15 minutos
Tempo total de contato 50-90 minutos
Atividade Contra Bactrias, micobactrias, esporos, fungos e vrus.
Caractersticas Importantes Risco de queimadura se operado inadequadamente.

4
Aplicao resduos infectantes, lquidos e vidrarias.
Fenis
Concentrao 0,2-2%
Tempo de contato 10-30 minutos
Atividade Contra Bactrias, fungos, micobactrias, vrus hidroflico (germicida
varivel) e vrus lipoflicos.

Caractersticas Importantes Efeito residual, corrosivo, efeito irritante da pele e olhos e
txico se absorvido ou ingerido.
Aplicao Descontaminao ambiental, de bancadas, pisos e superfcies contaminados
com material infectante.

Cloro e compostos clorados
Concentrao 0,1-2% (1000 a 20000 ppm)
Atividade Contra Bactrias, micobactrias, fungos, esporos (germicida varivel) e vrus.
Caractersticas Importantes inativado por matria orgnica; efeito residual; corrosivos;
efeito irritante de pele, olhos e trato respiratrio; txico se absorvido ou ingerido.
Aplicao Descontaminao ambiental de bancadas, pisos e superfcies contaminados com
material infectante.

lcool etlico
Concentrao 70-85%
Atividade Contra Bactrias, micobactrias, fungos, vrus hidroflicos (germicida varivel)
e vrus lipoflicos
Caractersticas Importantes inativado por matria orgnica, efeito irritante da pele e dos
olhos, txico se absorvido ou ingerido.
Aplicao Superfcies de equipamentos e anti-sepsia de pele

Consideraes Gerais
Toda amostra biolgica deve ser considerada potencialmente contaminada.
Toda manipulao de material biolgico deve ser realizada com o uso de luvas e, ao trmino
desta, desinfet-las com cido fnico 5% antes de descarta-las e quando necessrio utilizar
tambm culos de proteo.
Usar mscara para evitar a inalao de esporos fngicos, pois, alm das espcies que podem
infectar pulmes, vrias outras so responsveis por fenmenos alrgicos, que se
manifestam tambm nas vias respiratrias.
Trabalhar com o bico de Bunsen aceso e interposto entre o tcnico e o material (clnico ou
cultura).
Todo procedimento em que houver risco de respingos ou formao de aerossis deve ser
manipulado dentro de uma cabine de segurana biolgica.
No pipetar nenhum tipo de soluo ou material com a boca.
No reencapar agulhas e descartar material perfurocortantes em recipiente apropriado.
Reduzir ao mximo a utilizao de materiais perfurocortantes.
O material contaminado deve ser descontaminado antes do descarte.
Determinar reas limpas e contaminadas.
Os equipamentos devem ser descontaminado antes de ser transportados.

5
Limpar e desinfetar todas as superfcies de trabalho aps respingos e ao incio e final de
cada jornada.
Manter organizadas todas as reas de trabalho.
No estocar grandes quantidades de itens contaminados em reas de trabalho (por exemplo,
placas com crescimento bacteriano).
Tirar o jaleco quando sair do setor e colocar em local designado.
Lavar as mos e/ou superfcie da pele imediatamente aps contato com amostra biolgica,
aps remover as luvas e ao completar qualquer atividade.
Segregar todo resduo infectante gerado e descarta-lo em embalagens prprias para
autoclavao (por exemplo, caixa de descarte, ou saco autoclavvel de polietileno de alta
densidade)

Cuidados com gases comprimidos
Posicionar os cilindros em local apropriado e de maneira segura.
Manter distante de fogo e fontes de calor.
Usar os reguladores de presso corretamente

Cuidados com agentes qumicos
Usar EPI quando da utilizao de produtos qumicos.
Rotular todos os reagentes com seu nome qumico ou tcnico e indicao de risco
qumico apropriado, como: inflamvel, corrosivo, txico, nocivo, e irritante.
Ter um manual de procedimentos em caso de acidente para todos os reagentes qumicos.
Estocar lquidos inflamveis e combustveis em reas apropriadas e ventiladas.
Deixar na bancada somente o volume necessrio para uso dirio.
Manter no laboratrio disponvel a todos os colaboradores as fichas contendo
informaes de segurana dos produtos qumicos utilizados.

Orientaes para descontaminao em caso de acidentes
Usar luvas e jalecos
Colocar sobre o sangue, fluido ou material contaminado papel absorvente (como papel
toalha)
Saturar o papel-toalha com hipoclorito de sdio a 1% por 10 minutos.
Remover os resduos e descarta-los em caixa apropriada ou em saco autoclavvel
(polietileno de alta densidade).
Fazer nova descontaminao de rea com hipoclorito de sdio a 1%.
Todo material utilizado na limpeza dever ser descartado em local apropriado
(fragmentos de vidro e outros materiais cortantes).


6
3-Meios de Cultura

O meio de cultura uma mistura de nutrientes necessrios ao crescimento microbiano. Basicamente
deve conter a fonte de energia e de todos os elementos imprescindveis vida dos microrganismos.
O meio de cultura deve ainda atender s necessidades especficas do grupo, da famlia, do gnero ou
da espcie que se deseja cultivar. Assim, imprescindvel acrescentar ao meio de cultura vitaminas,
cofatores, aminocidos etc.; quando estes compostos no so sintetizados por microrganismos que
se deseja cultivar.

Principais Componentes dos Meios de Cultura

gar
Agente gelificante para preparao de meios de cultura microbiolgicos, substncia obtida de
determinadas espcies de algas vermelhas marinhas, um poligalactosdeo em que a maioria dos
microrganismos incapaz de degrad-lo.

Bile de boi dessecada
Trata-se da bile natural purificada que foi submetida a um processo de dessecao.

Casena Hidrolisada
Esta substncia obtida pela hidrlise com cido clordrico (HCL).

Extrato de Carne
preparado a partir de carne desprovida de tendes e gordura.

Extrato de Levedura
obtida por extrao aquosa de levedo de cerveja autolisado. Devido ao seu elevado contedo em
nitrognio amnico e vitaminas, oferece excelentes condies de crescimento a uma gama de
microrganismos.

Peptona de Carne
obtida pela degradao proteoltica da carne por enzimas (pepsina, tripsina). um excelente
substrato nutritivo.

Proteose-Peptona
uma peptona, com uma elevada proporo de peptdeos, aminocidos livres e fatores de
crescimento. Constitui-se de uma excelente base nutritiva para o cultivo de Neisseria spp,
Staphylococcus spp, Haemophilus spp, Salmonella spp, Pasteurella spp e Corynebacterium spp.

Triptona
um digerido pancretico de casena. A casena, protena principal do leite, uma rica fonte de
nitrognio amnico. Tem um alto teor de triptofano e, consequentemente, pode ser usada em meios
para testar a reao de indol.

**Para o aprimoramento dos isolados bacterianos patognicos atualmente inmeros so os meios
de cultura produzidos comercialmente. Deste modo, vale ressaltar que sero descritos apenas os
utilizados na rotina do LEAC- HGU/UNIC.

7
Meios de Cultura para Transporte
Meio Stuart
- Princpio: Meio semi-slido comercial que impede consideravelmente a multiplicao dos
microrganismos pela carncia de fonte de nitrognio e ao mesmo tempo garante a sobrevivncia
atravs de sua composio nutritiva.
- Utilidade: Transportar diversas amostras biolgicas, principalmente secrees e
conservao de microrganismos patognicos.

gar Nutriente ou Nutritivo
- Princpio: Meio slido relativamente simples, composto de extrato de carne, peptona, gar-
gar e outras substncias. Muito utilizado nos procedimentos do laboratrio de bacteriologia.
- Utilidade: Conservao e manuteno de culturas bacterianas.

Salina 0,85% estril
Substncia que mantm a bactria vivel e utilizada como meio de transporte para exame a
fresco de secrees genitais.

Meios de Cultura para Crescimento e Isolamento

O crescimento do microrganismo nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as
primeiras informaes para a sua identificao.
importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao
perfil bacteriano esperado para cada material.

gar Chocolate (AC)
Meio rico e no seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactrias aerbias e
anaerbias facultativas.
- Princpio: base do meio, adicionado sangue de carneiro, coelho ou cavalo em
temperatura alta. Ocorre lise das hemcias, a partir do aquecimento da mistura meio cultura+sangue
de carneiro.
Utilidade: Crescimento de microrganismos exigentes como por ex.: Neisseria spp e
Haemophilus spp.
- Atmosfera de incubao: Anaerobiose facultativa - CO
2

gar Sangue (AS)
Meio rico, no seletivo e diferencial para hemlise. Permite o crescimento da maioria das
bactrias Gram negativos e Gram positivos, alm de fungos filamentosos (bolores) e leveduras,
exceto algumas espcies.
- Princpio: A base do meio composta exclusivamente de sangue de carneiro, coelho,
desfibrinado. Oferece timas condies ao crescimento a maioria dos microrganismos.
- Utilidade: Usado para o isolamento de microrganismos no fastidiosos. Verificao de
hemlise dos Streptococcus spp e Staphylococcus spp; bem como empregado na prova de
satelitismo (para identificao presuntiva de Haemophilus spp).
2

gar MacConkey (MC)
Meio seletivo para bactrias Gram negativa, e diferencial para a utilizao da lactose.

8
- Princpio: O cristal de violeta que compe o meio de cultura inibe o crescimento de
microrganismos Gram positivos especialmente estafilococos e enterococos.
- Utilidade: Isolar bacilos Gram negativos (enterobactrias e no fermentadores) e verificar a
fermentao ou no da lactose. As colnias lactose positiva, apresentam colorao rseo intenso e
as colnias lactose negativas apresentam colorao inalterada.
- Atmosfera de incubao: Aerobiose O
2

gar Salmonella Shigella (SS)
Meio seletivo para Salmonella spp e Shigella spp e diferencial para a utilizao de lactose
(colorao rsea) e produo de H
2
S (colorao negra).
Ateno: Outros bacilos entricos Gram negativos tambm crescem no meio SS.
- Princpio: Possui componentes tais como: sais de bile, verde brilhante e citrato de sdio
que inibem bactrias Gram positivos. A incorporao de lactose ao meio permite diferenciar se o
microrganismo lactose positivo (bactrias que fermentam a lactose produzem cido que na
presena do indicador vermelho neutro resultam na formao de colnias rseas e bactrias que no
fermentam a lactose formam colnias inalteradas). O tiosulfato se sdio presente permitem a
deteco de H
2
S evidenciado por formao de colnias de cor negra no centro.
- Utilidade: Selecionar e isolar espcies de Salmonella spp e Shigella spp, em amostras de
fezes, alimentos e gua.
2

gar CLED (Cystine Lactose Eletrolyte Deficient)
- Princpio: Devido a sua composio deficiente em eletrlitos inibe a formao do vu de
Proteus spp. um meio de cultura no seletivo e diferencial para a utilizao de lactose. Cepas
lactose positiva apresentam colnias de colorao amarela; j bactrias lactose negativas
apresentam-se inalteradas quanto colorao.
- Utilidade: Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e
leveduras.
2

gar Cromognico
Meio de cultura que utilizam substratos cromognicos, sobre uma base nutricional rica.
-Princpio: Aps a clivagem dos substratos cromognicos combinados presentes no meio de
cultura por enzimas bacterianas, tais como: beta-glicosidade, beta-galactosidade (grupo Klebsiella-
Enterobacter-Serratia) e triptofano-desaminase (grupo Proteus-Providencia-Morganella) ocorrem
liberao de radicais coloridos.
- Utilidade: Para facilitar o reconhecimento precoce de vrios grupos e espcies de
microrganismos (bactrias e fungos), tais como os uropatgenos.
-Atmosfera de incubao: Aerobiose O
2

gar Lowenstein-Jensen (LJ)
Meio seletivo para bactrias lcool cido resistente.
- Princpio: Possui incorporado ao meio de cultura uma grande quantidade de protena,
favorecendo no crescimento do BAAR.
- Utilidade: Isolamento e testes de identificao de micobactrias.
2

9
gar Thayer Martin
- Princpio: Possui incorporado ao meio de cultura os suplementos V e X, importantes para o
crescimento dos diplococos Gram negativos.
- Utilidade: Isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis em amostras
clnicas que podem conter uma microbiota mista.
2

Caldo Tetrationato (TETRA)
- Princpio: Os sais de bile contidos no meio tetrationato inibem microrganismos Gram
positivos. Com a adio da soluo de iodo ocorre inibio da microbiota intestinal de espcies
fecais.
- Utilidade: Meio de enriquecimento para Salmonella spp.
2

Caldo Todd-Hewitt
Meio lquido seletivo para o isolamento de estreptococos beta-hemolticos de amostras
clnicas contendo flora mista.
- Princpio: Tem em sua formulao a adio de alguns antibiticos que tornam o caldo
seletivo para o isolamento de estreptococos do grupo B.
- Utilidade: Meio de enriquecimento para o isolamento de Streptococcus agalactiae.
2

Caldo BHI (Brain Heart Infusion)
- Princpio: Meio derivado do nutriente do crebro e corao, peptona e dextrose. A peptona
e a infuso so fontes de nitrognio, carbono, enxofre e vitaminas; j a dextrose um carboidrato
que os microrganismos utilizam para fermentao.
- Utilidades: Auxilia no crescimento e motilidade bacteriana.
2

Meios para Provas Bioqumicas
Sero discutidos nos itens de identificao para cocos Gram positivos e bacilos Gram
negativos.
**Para o aprimoramento da identificao de bactrias patognicas, atualmente inmeros so os
meios de cultura e kits produzidos comercialmente. Deste modo, vale ressaltar que sero descritos
apenas os utilizados na rotina do LEAC- HGU/UNIC.

Meios para Testes de Susceptibilidade aos Antimicrobianos

gar HTM (Haemophilus Test Medium)
- Princpio: Apresentam incorporados ao meio de cultura os suplementos V e X,
importantes para o crescimento da bactria em questo.
- Utilidades: Realizao do antibiograma ou teste de sensibilidade aos antimicrobianos em
espcies de Haemophilus.
- Atmosfera de incubao: Anaerobiose facultativa CO
2


10
gar Mueller Hinton
- Princpio: Oferece condies de crescimento s principais bactrias, padronizada por Kirby
e Bauer e CLSI.
- Utilidade: Para realizar teste de avaliao da resistncia aos antimicrobianos pelos mtodos
de difuso em disco e fitas de ETest para enterobactrias, no fermentadores e Staphylococcus spp.
2

gar Muller Hinton Sangue
- Princpio: Idntico ao item acima.
- Utilidade: Meio utilizado para realizao do teste de resistncia aos antimicrobianos pelos
mtodos de disco difuso e fitas de E-Test de cepas de Streptococcus pneumoniae e estreptococos
dos grupos A, B, C e G de Lancefield.
2

3.1-Controle de Qualidade dos Meios de Cultura

Os meios de cultura produzidos em mdia e grande escala pelo setor de microbiologia clnica dos
laboratrios de anlises clnicas devem realizar o controle de qualidade para garantir e monitorar a
integridade dos mesmos, bem como para manter de forma contnua a qualidade dos resultados
microbiolgicos. O programa de controle qualidade para meios de cultura deve garantir:

Esterilidade

Todo novo lote de meio de cultura preparado no laboratrio de microbiologia deve ser testado para
prova em questo.
Procedimento:
Incubar em estufa de cultura microbiolgica a 352C, 5% do lote de meio de cultivo por 18 s
24h e mais 24h em temperatura ambiente.
Resultado:
Adequado: Ausncia de microrganismos contaminantes nos meios de cultura.
Inadequado: Aparecimento de contaminantes nos meios de cultura.
Causas provveis resultados inadequados:
Processo de autoclavao comprometida, contaminao do ambiente, do sangue ou outro
complemento adicionado contaminado.
Ao corretiva:
O lote de meio de cultivo desprezado e novo lote produzido antes da liberao para uso. Os
resultados devem ser anotados em planilha apropriada.

Viabilidade (crescimento)

A habilidade do meio de cultura de permitir crescimento de microrganismos definidos deve ser
determinada pela inoculao do meio com isolados especfico de microrganismo estoque, de acordo
com as caractersticas esperadas da cepa teste frente a cada tipo de meio de cultura.
Procedimento:
Preparar uma suspenso a 0,5 da escala de McFarland com soluo salina 0,95%;
Diluir a suspenso 1:10;

11
Homogeneizar e usar uma ala de 0, 001 mL (1L) para semeadura, equivalente a 1,5 X 10
4

unidades formadoras de colnias (UFC);
Semear a suspenso por esgotamento em quatro quadrantes;
Incubar em estufa microbiolgica por 24h para o crescimento do microrganismo a ser avaliado
frente ao meios de cultura selecionados para o controle de qualidade.
Resultado:
Adequado: crescimento bom em todos os quadrantes, colnias bacterianas tpicas.
Inadequado: Ausncia de crescimento ou crescimento de bactrias escassas em somente 01 ou 02
quadrantes. Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.
Preparao do inculo bacteriano na escala 0,5 de McFarland pouco carregado para este propsito.
Ao corretiva:
Realizar uma nova suspenso a 0,5 McFarland e repetir o procedimento de crescimento bacteriano.

Inibio (meios seletivos)

Os meios seletivos so designados no apenas para permitir crescimento de alguns microrganismos,
mas tambm para inibir o crescimento de outros.
Procedimento:
O meio deve ser inoculado com bactrias representativas de ambos os grupos (bactria para o meio
de cultura especfico e outra para controle seletivo de inibio). Por ex: no meio MacConkey
semear cepa padro de Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) e Staphylococcus aureus (ATCC
25923).
Preparar uma suspenso a 0,5 da escala de McFarland com soluo salina 0,95%;
Diluir a suspenso 1:10;
Homogeneizar, usar ala 0,01 mL (10L) para semeadura, equivalente a 1,5 X 10
5
UFC;
Semear a suspenso por esgotamento em quatro quadrantes;
Incubar em estufa microbiolgica por 24h para o crescimento do microrganismo a ser avaliado
frente ao meios de cultura selecionados para o controle de qualidade.
Resultado:
Adequado: Inibio do crescimento do microrganismo.
Inadequado: Crescimento abundante do microrganismo seletivo de inibio.

Contaminao dos complementos adicionados de meios de cultura vencidos.
Processo de autoclavao de meios de cultura que no devem ser autoclavados.
Ao corretiva:
Verificar data de validade dos meios de culturas.
Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.

Resposta bioqumica

Verifica se os meios de cultura produzidos para reaes especficas de identificao microbiolgica
produzem mesmo essa reao.
Procedimento:
Utilizar cepas que produzam reaes especficas para sua identificao em nvel de gnero ou
espcie.
Por exemplo:

12
Inocular na superfcie do meio FENIL (Fenilalanina) uma cepa de Proteus spp ou Morganella spp.
ou Providencia spp.
Incubar em estufa microbiolgica a 352C por 18 s 24h.
Em seguida adicionar 20 gotas do cloreto frrico 10%. Aguardar a reao.
Resultado do exemplo acima citado:
Adequado: Formao de colorao VERDE na superfcie do meio FENIL.
Esta reao ocorre devido produo de uma enzima especfica (fenilalanina desaminase) presente
nos gneros bacterianos citados acima para o consumo do aminocido fenilalanina, que revelada
pela adio de um reagente qumico.
Inadequado: Ausncia de colorao verde na superfcie do meio fenil.
Causas provveis resultado inadequado no exemplo acima citado:
Reagente qumico e meio de cultura vencidos.
Ao corretiva:
Verificar data de validade do meio de cultura e cloreto frrico.
Os resultados devem ser anotados em planilha apropriada.

## Para os meios de cultura e kits de identificao comerciais, o certificado do controle de
qualidade fornecido pelo fabricante.

Todos os meios de cultura devem ser armazenados em geladeira em temperatura entre 2 - 8C e
condicionados em embalagens para manter a umidade do meio.
Em todas as placas de meio de cultura produzidas deve conter nmero do lote, datas de fabricao e
validade e inicial do meio de cultura.
Desprezar meios de cultura slidos que apresentem sinais de ressecamento e meios lquidos que
apresentem diminuio do volume original e qualquer sinal de contaminao, mesmo que estejam
dentro da data de validade.

Cepas bacterianas para teste dos meios de cultura

Para realizao dos testes de meio de cultura pode-se utilizar tipos diferentes de cepas:
o Cepas congeladas a partir de cepas padro (ATCC), adquiridas comercialmente.
o Cepas isoladas de pacientes no laboratrio para controle de crescimento de meios de cultura,
aps terem suas identificaes confirmadas.

Controle de qualidade do gar Mueller-Hinton (MH)
Provas de controle de qualidade devem ser realizadas no gar Mueller-Hinton para viabilizar a
utilizao deste meio de cultura, responsvel pela avaliao da sensibilidade aos antimicrobianos.
Devem ser realizada a cada nova produo de MH, os seguintes testes de controle de qualidade:

Dosagem do pH
O pH do meio Mueller-Hinton deve estar entre 7,2 e 7,4.
Procedimento:
Separar uma poro pequena do gar Mueller-Hinton em becker aps esterilizao;
Aps gelificao em temperatura ambiente, macerar o gar e colocar o eletrodo de superfcie do
pHmetro para medir o pH;
Ateno!

13
Resultado:
O pH do meio de cultura MH deve estar entre 7,2 e 7,4.
Espessura do meio MH em placas
Para ter halos de inibio de forma fidedignos a espessura do gar Mueller-Hinton deve ser
mensurada com paqumetro ou rgua.
Procedimento:
Aps esterilizao do gar Mueller-Hinton deve-se distribuir em placas de petri sobre superfcie
absolutamente plana para obter profundidade uniforme de aproximadamente quatro milmetro (04
mm), com auxlio de pipeta graduada estril. 0
Em placas de 150 mm o volume ideal de meio MH cerca de 60 mL. J em placas de 90 mm o
volume ideal de meio de 25 mL.
Com uma rgua ou paqumetro mensurar 04 mm de espessura de gar MH na placa petri.
Resultado:
A espessura do gar MH deve ser de 04 mm.

Dosagem dos nveis de Ca
2+
e Mg
2+
em gua destilada para preparao do meio de
cultura Mueller-Hinton
A dosagem de Clcio e Magnsio na gua potvel que passa por processos de purificao como
destilao e deionizao so de suma importncia na qualidade da produo dos meios de culturas,
principalmente do Mueller-Hinton; bem como no resultado final do antibiograma (leitura e
interpretao dos halos de inibio).
Procedimento:
# Dosagem de Ca
2+
na gua destilada
Colocar 02 ml de gua destilada no tubo de ensaio, adicionar 03 gotas de NaOH 03 mol/L e 05
gotas (NH
4
)
2
C
2
O
4
1% agitar. Aguardar reao.
# Dosagem de Mg
2+
na gua destilada
Colocar 02 ml de gua destilada no tubo de ensaio, adicionar 03 gotas de NH
4
OH 05 mol/L e 05
gotas Na
2
HPO
4
0,2 mol/L agitar. Aguardar reao.
Resultado:
Dosagem de Clcio
Resultado positivo: Formao Precipitado Branco.
Resultado negativo: No h formao de precipitado.
Dosagem de Magnsio
Resultado positivo: Formao Precipitado Branco.
Resultado negativo: No h formao de precipitado.

Variveis que podem interferir no resultado do antibiograma pelo gar Mueller-Hinton.
*Nveis de Ca
2+
e Mg
2+

Altas concentraes levam diminuio na atividade de aminoglicosdeos diante de bactrias como
Pseudomonas aeruginosa e da atividade de tetraciclinas para todas as bactrias. Concentraes
diminudas levam a resultados contrrios.
*pH
Em pH baixo se observa halos de inibio reduzidos para aminoglicosdeos, quinolonas,
macroldeos e lincosaminas e halos aumentados para outros antibiticos por ex: penicilina e
tetraciclinas. O aumento do pH leva a resultados opostos ao anteriores.
*Espessura do meio MH
Menor que 03 mm leva falsa sensibilidade geral, e maior que 04 mm falsa resistncia.
Importante!

14
Causas de alterao nas caractersticas e qualidade dos meios de cultura
Problema

A B C D E F G Outras Causas
Cor anormal do
meio
x x
pH incorreto

x x x x x x Armazenamento em alta temperatura. Hidrlise dos
componentes.
pH determinado temperatura incorreta.
Precipitado atpico x x x x
Solubilidade
incompleta

x Aquecimento inadequado.
Conservao inadequada em frasco muito pequeno.
Escurecimento ou
caramelizao
x x x
Perda capacidade
de gelificar

x x x Hidrlise do gar por desvio no pH.
Meio de cultura que no deve ser fervido.

Perda capacidade
nutritiva

x x x x x x Presena de eletrlitos fortes aucares, detergentes, anti-
spticos, metais venenosos, materiais proticos ou outras
substncias que podem inibir o inculo.
Superaquecimento.

Contaminao

x x Esterilizao ineficaz.
Tcnica inadequada de adicionar solues de
enriquecimento e distribuio nas placas.

Legenda: A: meio deteriorado ou desidratado, B: vidro mal lavado, C: erro de pesagem,
D: mistura incompleta, E: reaquecimento repetido, F: diluio excessiva, G: qualidade gua.


15
4-Tipos de Semeadura em Bacteriologia Clnica

Semeadura Qualitativa
Permite o isolamento de todas as colnias microbiolgicas diferentes, atravs do decrescente
gradiente de concentrao do inculo (amostra biolgica).
Utiliza-se ala microbiolgica de 0,01mL (10L), conforme figura abaixo.

Procedimento da semeadura qualitativa:
Homogeneizar a amostra biolgica;
Flambar a ala microbiolgica (10L), deixar esfriar;
Introduzir ala microbiolgica 10L na amostra biolgica;
Observar a integridade da pelcula de amostra formada na ala at descarregar o
inculo em um canto da placa;
Estriar partindo da ponta da primeira semeadura;
Repetir o procedimento anterior por duas vezes.
No Esquecer
Semear seguindo a sequncia dos meios de cultura mais ricos para os mais seletivos.

Fonte: MENEZES e SILVA. C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia Para o Laboratrio Clnico. 2006. p120.

Semeadura por Rolagem (Tcnica de Maki)

A tcnica de semeadura por rolagem utilizada para semear cateteres.
Procedimento da semeadura:
Retirar o cateter do tubo estril com auxlio de uma pina estril;
Colocar na superfcie do AS;
Com o auxlio da pina, rolar o cateter por toda a superfcie do meio para frente e para trs,
duas vezes. Conforme ilustrao abaixo.

Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. 2004. p80.

16
Semeadura Quantitativa

A semeadura quantitativa se baseia na semeadura de um volume conhecido de material e a
contagem do nmero de UFC (Unidades Formadoras de Colnias) obtidas aps incubao.
Utilizam-se dois artifcios para o efeito de diluio do material:
# Uso de pequenos volumes: normalmente de 1, 10 ou 100L. O nmero de UFC obtido dever ser
multiplicado pelo fator de correo para 1ml, relativo ao volume inoculado; 1000, 100 ou 10,
respectivamente. Pode ser realizada utilizando-se volume de material definido por ala calibrada.
#Tcnicas dilucionais: costuma-se utilizar a diluio seriada do material em escala decimal, isto
1:10, 1: 100, 1: 1000. O nmero de UFC obtido dever ser multiplicado pelo fator de correo para
01 ml, relativo diluio utilizada: 10, 100, 1000, respectivamente.

Utiliza-se ala microbiolgica calibrada 0,001mL (1L), conforme figura abaixo.

Procedimento semeadura quantitativa:
Homogeneizar a amostra biolgica;
Flambar a ala microbiolgica (1L), deixar esfriar;
Introduzir ala microbiolgica 1L na amostra biolgica;
Observar a integridade da pelcula de amostra formada na ala at descarregar o
inculo em um nico sentido;
Estriar o inculo inicial de forma perpendicular e paralelo a este.

Fonte: Apostila ANVISA - Procedimentos Laboratoriais.

Fonte: LEACHGU/UNIC 2010


17
5-Processamento das Amostras Biolgicas nos Meios de Cultura em
Bacteriologia

Os procedimentos as serem realizados em diferentes materiais clnicos e a cada situao especfica
de fundamental importncia para o sucesso final do exame microbiolgico.

Cateter
As infeces relacionadas a cateteres so em geral importantes, pois auxilia no diagnstico para
deteco de bacteremia, fungemia e complicaes no local da insero do cateter.

Amostras inaceitveis para processamento
De cateter encaminhado em meios de cultura em caldo ou em meio de transporte;
Ponta de cateter vesical (Foley), uma vez que o crescimento de microrganismos representa a
microbiota da uretra distal.
De cateteres maiores que cinco (05) cm.

Procedimento
Limpar a bancada com gaze ou papel toalha umedecida em hipoclorito de sdio 2% ou cido fnico
2% ou lcool 70%;
Trabalhar dentro da rea de segurana do bico de Bunsen ou cabine de segurana;
Conferir o nome do paciente na amostra e no mapa de trabalho impresso;
Antes de semear necessrio realizar uma triagem do material recebido para assegurar que seja de
boa qualidade, conforme j descrito;
Identificar a placa com nome completo do paciente, data, hora da coleta e tipo de material biolgico
semeado.
Meio de cultura utilizado: gar Sangue (AS)
Para semeadura de cateteres, deve ser utilizada pina estril para fazer o processo de rolagem.
importante observar, no momento da semeadura, que o cateter est rolando na placa e no sendo
esfregado. Isso fundamental para obter colnias isoladas.
Aps realizao da semeadura por rolagem em AS do cateter colocar a placa de AS invertida
imediatamente na jarra de vela (microaerofilia) e incubar em estufa microbiolgica a 352C por
at 72h.

Escarro
A cultura de escarro importante para deteco de patologias pulmonares, pois cerca de 30 a 50%
das infeces so atualmente causadas por outras espcies que no as bactrias lcool cido
resistente (micobactrias).

Quantidade muito pequena e/ou saliva.
Amostras em temperatura ambiente por mais de 24 horas, mantidas refrigeradas por mais de sete
(07) dias e expostas luz solar.
Utilizao da poro no purulenta do escarro.

Procedimento
2% ou lcool 70%;

18
semeado.
Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey (MC)
e quando solicitado em gar Lowenstein-Jensen (LJ).
Utilizar a poro mais purulenta do escarro e semear por esgotamento (Tcnica qualitativa) com
ala bacteriolgica de 10L nos meios de gar sangue (AS), Chocolate (AC) e Mac Conkey (MC).
As placas de AS e AC devem ser colocadas invertida imediatamente na jarra de microaerofilia com
a vela acesa e incubadas em estufa microbiolgica a 352C por at 72h. J a placa de MC em
aerobiose em estufa microbiolgica a 352C tambm por at 72h.
O gar Lowenstein-Jensen (LJ) deve ser semeado por estriamento na superfcie inclinada do meio,
em seguida fechar o frasco. Incubar em estufa microbiolgica a 352C por 30 dias ou mais.

Fezes
O cultivo de fezes fundamental para o isolamento de microrganismos causadores de
gastroenterites agudas e/ou crnicas de origem bacteriana.

Sem conservantes que foram obtidas e armazenadas h mais de 3 horas;
Mistura de vrias amostras colhidas no mesmo dia;
Fezes lquidas colhidas ou enviadas em fralda;
Amostras de fezes contaminadas com urina;
Amostras coletadas h mais de trs dias;
Fezes de pacientes fazendo uso de antimicrobianos;

Procedimento
2% ou lcool 70%;
semeado.
Meios de cultura utilizados: Caldo Tetrationato (CT), gar Mac Conkey (MC) e gar
Salmonella/Shigella (SS).

*Amostra obtida de swab:
Introduzir swab no tubo com o meio de cultura em caldo Tetrationato e esgotar o algodo molhado
nas paredes internas do tubo.
Incubar o caldo Tetrationato em estufa bacteriolgica 35 2C por 18 a 24 horas.
Decorrido o perodo de incubao primaria do caldo Tetrationato deve-se semear por esgotamento
(Tcnica qualitativa) com ala bacteriolgica de 10L nos meios de gar MacConkey (MC) e gar
Incubar as placas semeadas em aerobiose, estufa bacteriolgica a 35 2C por 18 24h.


19
*Amostra obtida in natura:
Primeira etapa
Inocula-se uma poro da amostra biolgica com auxlio ala bacteriolgica de 10L no tubo
contendo salina estril 0,95%.
Incubar a salina com fezes estufa bacteriolgica a 35 2C por 15 minutos.
Aps 15 minutos semear por esgotamento (Tcnica qualitativa) com ala bacteriolgica de 10L
nos meios de gar MacConkey (MC) e gar Salmonella/Shigella (SS).
Segunda etapa
Inocular outra poro da amostra biolgica com auxlio ala bacteriolgica de 10L em caldo
tetrationato com 02 gotas de soluo de iodo.
Incubar o caldo Tetrationato em estufa bacteriolgica 35 2C por 18 a 24 horas.
Decorrido o perodo de incubao do caldo Tetrationato deve-se semear por esgotamento (Tcnica
qualitativa) com ala bacteriolgica de 10L nos meios de gar MacConkey (MC) e gar
semeado.

Lavado Bronco Alveolar e Aspirado Traqueal
As infeces do trato respiratrio inferior so em geral importantes, pois auxilia no diagnstico para
deteco de um grande nmero de etiologias principalmente: pneumonia adquirida na comunidade e
as hospitalares.

Procedimento
2% ou lcool 70%;
semeado.
Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey
(MC).
Homogeneizar o material (LBA ou aspirado traqueal) e imergir a ala bacteriolgica calibrada de
1L na amostra de forma vertical.
Semear por Tcnica quantitativa utilizando ala calibrada de 1L em placa de gar AS, AC e MC.
Em seguida colocar as placas de meios de cultura AS e AC em estufa com 5 a 10% de CO2 (jarra
vela) a temperatura de 35 2C e MC em aerobiose na estufa microbiolgica por 24 a 48 horas, com
leituras dirias.

Lquidos Cavitrios Estreis (Asctico, Amnitico, Lquido Cefalorraquidiano-LCR
ou Lquor, Pleural, Peritoneal, Pericrdico e Sinovial).

20
Qualquer fluido estril do corpo pode ser infectado por bactrias ocasionando patologias graves.
Apesar de esses materiais clnicos serem de diferentes reas do corpo humano, so processados de
forma semelhante.

Frascos com conservantes, por ex: Formal ou Soro fisiolgico;
Amostras colhidas e enviadas em frascos no estreis ou, congelados.

Procedimento
2% ou lcool 70%;
Meios de cultura utilizados: gar Sangue (AS), gar Chocolate (AC), gar MacConkey (MC)
e Caldo BHI.

*Amostras purulentas
No h necessidade de centrifugar.
*Amostras pouco ou no purulentas
Separar parte do material em tubo estril. Centrifugar por 15 minutos a 3.000- 5.000 rpm. Remover
o sobrenadante, suspender o sedimento para semear.

Em ambos os casos deve ser semear em meios de culturas slidos padronizados AS, AC, MC pela
Tcnica qualitativa por esgotamento, utilizando ala bacteriolgica de 10L. Uma pequena poro
do material biolgico a ser processado deve ser coloca em meio de cultivo lquido o caldo BHI.
Em seguida colocar as placas de meios AS e AC em estufa microbiolgica com 5 a 10% de CO2
(jarra vela) a temperatura de 35 2C e o MC e caldo BHI em aerobiose na estufa microbiolgica
por at 72h, com leituras dirias.
semeado.

Sangue
A cultura de sangue ou hemocultura de fundamental importncia para deteco de septicemia.
Principal causa de morbidade e mortalidade no mbito hospital mundialmente.
Procedimento
Em frascos de hemocultura manual
Aps coleta do sangue em frascos especficos para hemocultura manual, o(s) frasco(s) deve ser
colocado em estufa por 24 horas.
Aps 24h de incubao, realizar o primeiro repique da amostra de sangue nos meios de cultura:
AS, AC e MC com auxlio de agulha, seringa estreis e ala de 10L.
2% ou lcool 70%;

Como proceder?
Identificar as placas com nmeros de identificao do paciente(s).

21
Realizar descontaminao da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (lcool
70%, hipoclorito ou cido fnico).
1 Etapa: Transferir at 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura para seringa e colocar
01 ou 2 gotas nos meios de cultura acima citados.
2 Etapa: Desfazer a gota com auxlio de ala bacteriolgica de 10L, aps flambagem.
Conforme figura abaixo.

Fonte: OPLUSTIL, C.P, et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. Sarvier: So Paulo. 2004.

3 Etapa: Deixar as placas semeadas por 05 minutos na bancada at que o sangue seja absorvido no
meio de cultura.
4 Etapa: Colocar as placas depois de semeadas em meios AS e AC em estufa microbiolgica com
5 a 10% de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e o MC em aerobiose na estufa
microbiolgica. Verificar crescimento ou no de colnias microbianas no dia seguinte.
5 Etapa: Retornar os frascos de hemocultura em estufa.
Aps 48h de incubao, realizar o segundo repique da amostra de sangue nos meios de cultura:
AS, AC e MC com auxlio de agulha, seringa estreis e ala de 10L.
Repetir as etapas 1, 2, 3 e 4 acima descritas.
Aps 04 dias da segunda semeadura, realizar o terceiro repique da amostra de sangue nos meios
de cultura: AS, AC e MC com auxlio de agulha, seringa estreis e ala microbiolgica de 10L.
Repetir as etapas 1, 2, 3 e 4 acima descritas.

Em frascos de hemocultura automatizados
OBS: Ser descrita apenas a metodologia implantada pelo LEAC-HGU. Vale ressaltar que existem
outras metodologias de hemocultura, utilizando equipamentos automatizados.

Aps deteco de positividade do(s) frasco(s) de hemocultura cadastrados no equipamento
BacTAlert 3D (Biomerieux), realizar o repique da amostra de sangue. com auxlio de seringa e
agulha estreis.
- Identificar as placas de meio de cultura com nmeros de identificao do paciente(s).
- Realizar descontaminao da tampa do frasco hemocultura com degermante da sua escolha (lcool

22
- Transferir at 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura com auxlio de seringa e agulha
estreis e colocar 01 ou 2 gotas do sangue em uma das extremidades dos meios de cultura AS, AC e
MC.
-Em seguida realizar tcnica de semeadura qualitativa por esgotamento utilizando ala
microbiolgica de 10L.
- Deixar as placas semeadas por 05 minutos na bancada at que o sangue seja absorvido no meio de
cultura.
- Colocar as placas depois de semeadas em meios AS e AC em estufa microbiolgica com 5 a 10%
de CO2 (jarra vela) a temperatura de 35 2C e o MC em aerobiose na estufa microbiolgica.
Verificar crescimento ou no de colnias microbianas no dia seguinte.

Secrees Genitais: Masculina e Feminina
No trato genital feminino e masculino podem ocorrer diversas doenas, de etiologia bacteriana,
fngica, parasitria e viral.
Portanto devido grande variedade de agentes possveis de serem pesquisados, importante que a
suspeita clnica seja bem direcionada para que os exames laboratoriais mais indicados sejam
realizados atravs de coletas especficas (dependendo microrganismo) em meios de cultura lquidos
e slidos padronizados pelo servio de sade que se trabalha.

Procedimento para secreo vaginal

2% ou lcool 70%;
semeado.
(MC).
Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a amostra biolgica em uma pequena
rea das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela tcnica qualitativa utilizando
ala bacteriolgica 10L.
leituras dirias.

Para processar o caldo Todd-Hewitt indicado para pesquisa de estreptococos do grupo B
(Streptococcus agalactiae) em gestantes deve-se:
Aps o caldo Todd ter sido incubado por 18-24h em estufa microbiolgica a temperatura de 24h a
35 1C, semear o mesmo em AS pela tcnica qualitativa por esgotamento utilizando ala 10L.
semeado.
Incubar por 24h a 35 2C em estufa microbiolgica com 5 a 10% de CO2 jarra vela.

Procedimento para secreo uretral masculina
2% ou lcool 70%;

23
semeado.
(MC).
Rolar o swab uretral masculino contendo a amostra biolgica em uma pequena rea das placas AS,
AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela tcnica qualitativa utilizando ala bacteriolgica
10L.
leituras dirias.

Em caso de:
Procedimento para cultura de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum em secrees
vaginal e uretral.
Realizar procedimento do Kit comercial adotado por padronizao de cada laboratrio.

Secrees em Geral (Feridas cirrgicas, Fstulas, lceras, Abscessos e Exsudatos).
importante cultivar secrees oriundas de feridas, lceras, abscessos entre outras, pois inmeros
so os microrganismos patognicos causadores de infeces cutneas, subcutneas e profundas da
pele que acometem pacientes que realizam procedimentos cirrgicos ou que esto hospitalizados h
algum tempo.

Procedimento

2% ou lcool 70%;
semeado.
(MC).
Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a secreo em uma pequena rea das
placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela tcnica qualitativa utilizando ala
bacteriolgica 10L.
leituras dirias.

Secreo Ocular
Vrias so as patologias responsveis por infeces nos olhos, dentre elas vale ressaltar por exemplo a
conjuntivite e ceratite.

Procedimento


24
2% ou lcool 70%;
semeado.
(MC).
Rolar o swab do meio de Stuart (meio de transporte) contendo a amostra biolgica em uma pequena
rea das placas AS, AC e MC. Em seguida realizar a semeadura pela tcnica qualitativa utilizando
ala bacteriolgica 10L.
leituras dirias.

Urina
Atualmente o aumento do nmero de casos de infeces do trato urinrio complicados vem
alarmando o mbito hospitalar nacional e mundial, devido ao isolamento de bactrias com alto grau
de resistncia as diferentes classes de antibiticos atravs do cultivo em meios de cultura.

Jato primrio (exceto se houver pedido especfico do mdico);
Amostra colhida com menos de 4 horas antes da ltima mico (segunda mico da manh);
Amostra colhida sem higiene prvia;
Amostra em frasco no estril;
Amostra colhida com coletor e contaminada com fezes;
Amostra de coletores auto aderente que permaneceram por mais de uma hora aderidos criana;
Amostra colhida da bolsa coletora de pacientes com sonda;
Amostra sem refrigerao e cujo prazo entre a coleta e o transporte ao laboratrio for superior a
2 horas.
Amostra com conservantes como o formol

Procedimento
2% ou lcool 70%;
semeado.
Meio de cultura utilizado: gar CLED
Homogeneizar a urina.
Introduzir a ala calibrada de 0,001ml ou 1l aps flambagem, verticalmente na amostra biolgica e
realizar a semeadura quantitativa.
Incubar por 18 a 24 horas a 35 2C em estufa microbiolgica.
Este procedimento permite que se distribua o material de maneira uniforme na placa de meio de
cultura para auxiliar na contagem de colnias microbiolgicas.

25

A urocultura tambm pode ser realizada atravs de outros procedimentos, tais como:

Pour plate
Realiza a diluio da urina para obteno de um fator a ser utilizado na interpretao.
Por exemplo: diluir 9,9 ml de salina estril + 0,1ml de urina (10-2); diluir 9,9 ml de salina estril +
0,1 ml da 1 diluio (10-4).
Adicionar 01 ml da ltima diluio em placa de petri estril (150 mm).
Acrescentar o gar Mueller-Hinton (fundido), homogeneizando e incubando a 35-37C em estufa,
incubado em aerobiose durante 24 horas.
A leitura feita multiplicando o nmero de colnias obtido, pelo fator de diluio.

Lamino-Cultivo
Consiste de um recipiente plstico cilndrico com uma tampa ligada a um suporte plstico com duas
faces contendo meios de cultura como CLED e MacConkey ou outras combinaes. A leitura feita
contando o nmero de unidades formadoras de colnias e o resultado interpretado seguindo as
orientaes do fabricante, conforme figuras abaixo.

Laninocultivo contendo gar CLED e gar A contagem de colnias estimada e dada
MacConkey (direita). em Unidades Formadoras Colnias-UFC/ml.

Interessante!

26
6-Interpretao Macroscpica das Colnias Bacterianas e seu crescimento nos
Meios de Cultura

Aps 18 a 24 horas de incubao (estufa microbiolgica) em temperatura adequada, ou em prazos
maiores para determinados microrganismos, as placas onde o material clnico foi semeado devem
ser examinadas para verificar se existe crescimento de algum microrganismo. Deve ser levada em
considerao a presena de microbiota quando existente.
A primeira etapa para interpretao do crescimento na cultura primria a identificao
macroscpica das colnias, como:

TAMANHO
O tamanho das colnias bacterianas dever ser considerado na placa como um todo; uma mesma
cepa pode formar colnias de tamanhos variados em diferentes pontos da placa de meio de cultura.

Colnias Pequenas
At 02 mm de dimetro, bem caracterstico de alguns gneros:
# Enterococcus spp.; # Alguns estafilococos coagulase negativa (ECN);
# Streptococcus spp.; # Stenotrophomonas maltophilia; # Shigella spp.

Colnias Mdias
At 03 mm de dimetro, como por exemplo:
# Escherichia coli; # Bacilos Gram negativos no fermentadores de glicose (alguns).

Colnias Grandes
Mais de 04 mm de dimetro, bem caracterstico dos gneros:
# Proteus spp pela formao do vu. # Pseudomonas spp;
# Klebsiella spp.; # Enterobacter spp.,

Colnias Pequenas Colnias Pequenas Colnias Mdias
ECN-gar Chocolate ECN-gar Sangue Escherichia coli/gar MacConkey

Colnias Grandes
Pseudomonas spp / gar CLED

27
FORMA
As colnias bacterianas tambm apresentam formas variadas.
Redonda
A forma redonda das colnias bacterianas so sugestivas dos gneros Klebsiella, Serratia,
Acinetobacter, Estafilococos, Estreptococos e da espcie Escherichia coli.

Irregular
A forma irregular das colnias bacterianas so sugestivas dos gneros Pseudomonas e Proteus
(formao de vu).

Elevada
A forma elevada sugestiva do gnero Klebsiella.

Chata
Esta forma observada nas colnias de Enterobacter spp. e Pseudomonas spp.

Colnias redondas e elevadas gar MH- Colnias redondas E. coli e
Klebsiella spp./ gar MacConkey Irregulares de Proteus spp.(formao vu)

COR
A colorao das colnias bacterianas depender do meio de cultura utilizado.

Meios no seletivos, pode-se identificar a colorao caractersticas de alguns microrganismos.
Por exemplo:
- Staphylococcus aureus e Micrococcus spp. Cor Amarela.
- Serratia spp. Cor Vermelha.
- Pseudomonas spp. Diferentes tons de verde e castanho.
Meios seletivos, a colorao da colnia sofre interferncia das reaes que ocorrem com
substratos dos meios de cultura.
- Utilizao da lactose no gar MacConkey, colnias bacterianas rseas.
- Utilizao da lactose no gar CLED, colnias bacterianas amarelas.
- Utilizao do gar Manitol Salgado pelas bactrias, cor amarela.
- Produo de H
2
S (gs sulfdrico) no gar Salmonella/Shigella, colnias negras.

Colnias H
2
S+ em gar SS Diferentes isolados de Pseudomonas spp. gar MH
Variaes de pigmentao dependendo espcies.

28
CONSISTNCIA e DENSIDADE
As bactrias quando manuseadas podem apresentar uma consistncia mucide como ocorre com os
gneros Klebsiella e Pseudomonas; bem como serem secas, casos este evidncia em colnias de
Escherichia coli, Staphylococcus aureus ou Citrobacter spp. As colnias bacterianas tambm
podem ser opacas ou com brilhantes.

PRODUO de ODOR
O odor produzido por muitas bactrias em determinados meios de cultura caracterstico e utilizado
em bacteriologia para sugerir algumas espcies, por exemplo:
Odor adocicado Pseudomonas aeruginosa;
Odor de gua sanitria Shigella spp;
Odor de queijo Staphylococcus spp;
Odor de vinagre Escherichia coli;
Odor de fermento de po Klebsiella pneumoniae;

PRODUO de HEMLISE
Baseada na lise de hemcias contidas no gar sangue (AS), conforme figura abaixo.

Lise Total ocorre formao de halo de transparncia ao redor e/ou sob as colnias, denominada
Beta-Hemlise (-hemlise).
Lise Parcial h formao de halo com colorao esverdeada ao redor das colnias, denominada
Alfa-Hemlise (-hemlise).
Ausncia de lise meio de cultura AS inalterado, definido como Gama-Hemlise (-hemlise).



29
6.1- Interpretao do Crescimento Microbiolgico nos Meios de Cultura.
E agora? Infeco ou Contaminao?

importante lembrar que a presena de microrganismos na cultura no significa necessariamente
que eles sejam causadores da infeco. Deve ser observado atenciosamente o isolado bacteriano, a
amostra clnica em questo e o nmero de colnias presentes na placa de meio de cultura.

Amostras geralmente estreis
A presena de bactrias nesses materiais clnicos (sangue, lquor, pleural, sinovial, pericrdico,
medula ssea e bipsias) geralmente indica presena de infeco.

Amostras que apresentam microbiota normal
Geralmente amostras do trato respiratrio, de fezes, secrees genitais e swabs de stios
anatomicamente infectados apresentam uma colonizao, Portanto devem ser analisadas todas as
colnias bacterianas que cresceram.

Nmero de colnias
As culturas semi-quantitativas e quantitativas so importantes para determinar uma possvel
infeco ou contaminao em diferentes amostras biolgicas, atravs de nmeros pr-estabelecidos
pela literatura.

Interpretao do crescimento bacteriano em diferentes materiais clnicos

ASPIRADO TRAQUEAL e LBA
A cultura quantitativa do aspirado traqueal e lavado bronco alveolar-LBA em AS, AC e MC com
semeadura por ala de 0,001mL (1l) deve ser valorizada, quando a contagem de colnias
bacterianas for maior ou igual 20.000 Unidade Formadora de Colnias (UFC).

Isso se deve a ala de 0,001 ml; pois 01 colnia = 20.000 ou 2 x 10
4
UFC/ml

Amostra biolgica

Significativo se contagem for maior ou igual a (UFC)
Lavado bronco alveolar

20.000 UFC/ml
Aspirado traqueal

20.000 UFC/ml
UFC = Unidades Formadoras de Colnias

OBS 01: Qualquer nmero de colnias crescidas no meio especfico para micobactrias deve ser
valorizado laboratorialmente.

OBS 02: Se o aspirado traqueal estiver muito espesso, deve-se realizar uma diluio de 1:10 com
agente mucoltico, ou seja:

Diluir 100L do aspirado traqueal ---------------- 900L agente mucoltico.
Homogeneizar e semear com ala de 0,001mL (1L) em meios de AS, AC e MC.


30
CATETER
A cultura semi-quantitativa dos cateteres com pina estril deve ser valorizada, quando a contagem
de colnias bacterianas apresentarem um nmero maior ou igual a 15 unidades formadora de
colnias de um nico tipo de microrganismo; desse modo sugere-se que a ponta de cateter pode ser
fonte de infeco (critrio de Maki). Com uma contagem menor, o cateter tem baixa probabilidade
de ser fonte de infeco.

Crescimento de um nmero 15 UFC/ placa = CULTURA POSITIVA.

ESCARRO
A cultura qualitativa do escarro com ala de 0,01ml (10l) nos meios AS, AC e MC deve ser
valorizada se houver:

Crescimento de colnias bacterianas puras, ou seja, mesmas caractersticas macroscpicas em
grande quantidade e em todos os meios de cultura acima citados em 24, 48 at 72h = Cultura
Positiva.

Crescimento de colnias bacterianas mistas, ou seja, diferentes caractersticas macroscpicas, em
pouca ou em grande quantidade das mesmas nos meios de cultura citados acima em 24 at 72h.
Cultura Sem Valor Diagnstico. Provvel contaminao de flora de orofaringe.

FEZES
A cultura qualitativa das fezes com ala de 0,01mL (10L) nos meios de cultura SS e MC devem
ser valorizadas se houver:

# Colnias lactose negativa no meio SS;
# Colnias H
2
S positivas (negras) no SS;
# Colnias lactose positiva e/ou negativa no meio de cultura MacConkey.

O crescimento de diferentes colnias bacterianas = Cultura positiva.
A ausncia de crescimento de colnias bacterianas = Cultura negativa**.

**Caso incomum, pois sabido que a distribuio da microbiota do intestino grosso por ex: de
10.000.000.000.000 (dez trilhes). Deste modo deve-se verificar o quadro patolgico do paciente,
ou possveis erros pr-analticos.

LQUIDOS CAVITRIOS ESTREIS
A cultura qualitativa do lquor e lquidos (asctico, amnitico, pleural, peritoneal, pericrdico e
sinovial), com ala de 0,01ml (10l) nos meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver:

Crescimento no AS, AC e MC de um nico tipo de colnia.
Caso haja pouco crescimento microbiolgico insuficiente para prosseguir a identificao deve ser
realizado o reisolamento.
Reisolamento o procedimento de semear o microrganismo que se deseja isolar em outra placa de
meio de cultura, com a finalidade de obter o microrganismo em quantidade de crescimento
suficiente para que possam ser realizados, todos os testes de identificao e sensibilidade a
antimicrobianos.


31
SANGUE
A presena de microrganismos viveis no sangue do paciente representa, em algumas situaes, um
agravamento do processo infeccioso, o que torna a hemocultura um exame crtico e de grande
importncia.
Portanto deve-se valorizar a presena de crescimento bacteriano nos meios de cultura AS, AC e
MC; atravs da semeadura qualitativa pela ala de 10L. Aps deteco de positividade da amostra
em questo pelo equipamento automatizado.

SECREES GENITAIS E
A microbiota normal da uretra feminina e masculina constituda por vrios microrganismos.
Assim, a interpretao dos resultados microbiolgicos deve ser feita com cautela, certeza de
ausncia de outros patgenos potenciais e com nfase na sintomatologia descrita pelos dados clnico
do paciente.
A cultura qualitativa das secrees genitais com ala de 0,01ml (10l) nos meios AS, AC e MC
deve ser valorizada se houver:

# Colnias pequenas -Hemolticas no AS sugestivas do microrganismo Streptococcus agalactiae
(cocos Gram positivos).
# Colnias pequenas translcidas ou amarelas no AC sugestiva dos microrganismos Haemophilus
spp. e Neisseria spp.

OBS: Para cultura de Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum em secrees vaginal e
uretral, a interpretao do crescimento bacteriano depender do Kit adotado por padronizao de
cada laboratrio.

SECREES em GERAL
A cultura qualitativa de feridas, lceras, abscessos entre outras com ala de 0,01ml (10l) nos
meios AS, AC e MC deve ser valorizada se houver:

Crescimento de colnias bacterianas, exceto colnias bacterianas identificadas como microbiota de
pele; proveniente de uma coleta superficial das diferentes amostras biolgicas acima citadas.

SECREO OCULAR
A cultura qualitativa da secreo ocular com ala de 0,01ml (10l) nos meios AS, AC e MC deve
ser valorizada se houver:

Crescimento de colnias bacterianas, exceto colnias bacterianas identificadas como microbiota de
pele; proveniente de uma coleta superficial.

URINA
A cultura quantitativa da urina em CLED com semeadura por ala de 0,001mL (1l) de ser valoriza
se houver:
Crescimento de colnias de mesma forma e caracterstica macroscpica.
Crescimento de colnias diferentes em quantidades e que reflitam a presena de microbiota uretral
na amostra biolgica, deve solicitar nova coleta.


32
#Cultura Positiva: nmero de colnias bacterianas significativa, por exemplo:

11 a 100.000 UFC/ml: suspeita de infeco urinria deve ser associado piria e sintomatologia
do paciente.
Acima de 100.000 UFC/ml: infeco urinria instalada.

#Cultura Negativa: ausncia ou nmero insignificante de colnias bacterianas.

0 a 10.000 UFC/ml: no se considera infeco urinria.

7-Preparo do Esfregao Bacteriolgico

A confeco do esfregao depender do tipo de material biolgico e a partir de amostras com
consistncia diversas.

Materiais lquidos estreis
Para os lquidos estreis asctico, amnitico, lquor, pleural, peritoneal, pericrdico e sinovial:
Pouco Turvo
Deve-se homogeneizar e aliquotar o material em tubo cnico estril;
Centrifugar a 2.500 3.000 rpm por 05 minutos, (quando volume da amostra for superior a 1mL)
caso o volume dos lquidos estreis for inferior a 1 mL, a amostra total deve ser apenas
homogeneizada em agitador mecnico por alguns segundos.
Do tubo do centrifugado, deve-se retirar o sobrenadante com pipeta estril, reservando de 0,5 a 1
mL de sedimento. O sobrenadante pode ser conservado para ensaios bioqumicos (caso for coletado
apenas um frasco do lquido estril).
Ressuspender o sedimento (no deve ser utilizada pipeta para misturar o sedimento), pegar duas
aladas do material, colocar sobre lmina limpa e desengordurada e espalhar realizando
movimentos ovais.
Deixar secar a temperatura ambiente ou utilizar fixador qumico ou fsico.
Realizar colorao conforme solicitao mdica.
Turvo
Os mesmos procedimentos acima citados podem ser realizados, sendo importante analisar a
consistncia da turvao.

Purulento
No h necessidade de centrifugao da amostra biolgica estril.
Com auxlio de ala bacteriolgica estril de 10L pegar a amostra, colocar sobre lmina limpa e
desengordurada e espalhar realizando movimentos ovais.

Para amostra de sangue proveniente das hemoculturas positivas, deve-se:

*Etapa A: Transferir at 01 mL do sangue contido no frasco de hemocultura para a seringa e
colocar 01 ou 2 gotas em uma lmina de vidro limpa.
*Etapa B: Colocar uma segunda lmina a um ngulo de 45 tocando a gota.
*Etapa C e D: Com um movimento leve, espalhe a gota ao longo da lmina.
Deixar secar a temperatura ambiente, fixar e realizar a colorao conforme solicitao mdica.


33

Passos para realizao do esfregao em sangue.

Material lquido (URINA)
# Homogeneizar a urina contida no frasco estril.
# Colocar 10L de urina no centrifugada, sobre uma lmina limpa e espalhar realizando
movimentos ovais de forma concentrada.
# Deixar secar a temperatura ambiente e fixar o material biolgico.
# Realizar colorao conforme solicitao mdica.

OBS: No recomendado pela literatura realizar esfregao do sedimento urinrio.

Materiais Serosos e Purulentos
Para secrees genitais, oculares, abscessos, fstulas, lceras e feridas cirrgicas.

O esfregao deve ser preparado aps coleta da amostra biolgica com swab estril.
Com o auxlio do swab estril, realizar movimentos circular e oval sobre a lmina (limpa e
desengordurada).
A lmina deve ser seca em temperatura ambiente e fixada pelo calor.

Materiais Mucides

Escarro Expectorado
Separar os grumos purulentos ou com sangue da saliva com auxlio de haste de madeira e
placa de petri estril (ao arrastar o grumo de pus, o excesso de saliva fica aderido
superfcie, e o material purulento deve ser preferencial para o esfregao).
Com o auxlio de haste de madeira (palito de picol), realizar movimento em uma nica
direo sobre uma lmina nova, limpa e desengordurada, repetir o movimento.
A lmina deve ser seca em temperatura ambiente e fixada pelo calor.

Lavado Bronco Alveolar e Aspirado Traqueal
Pouco Turvo
Deve-se homogeneizar e aliquotar o material em tubo cnico estril;
Centrifugar a 2.500 3.000 rpm por 05 minutos, (quando volume da amostra for superior a 1mL)
caso o volume dos lquidos estreis for inferior a 1 mL, a amostra total deve ser apenas
homogeneizada em agitador mecnico por alguns segundos.

34
Do tubo do centrifugado, deve-se retirar o sobrenadante com pipeta estril, reservando de 0,5 a 1
mL de sedimento. O sobrenadante pode ser conservado para ensaios bioqumicos (caso for coletado
apenas um frasco do lquido estril).
Ressuspender o sedimento (no deve ser utilizada pipeta para misturar o sedimento), pegar duas
aladas do material, colocar sobre lmina limpa e desengordurada e espalhar realizando
movimentos ovais.

Turvo
Os mesmos procedimentos acima citados podem ser realizados, sendo importante analisar a
consistncia da turvao.

Fixao do Material Biolgico

Fixao pelo calor
Aps o esfregao secar ao ar, passar duas a 3 vezes pela chama do bico de bunsen, tomando cuidado
para evitar distores pelo superaquecimento; deixar esfriar o esfregao antes de corar.


Fixao por Substncia Qumica
O esfregao pode ser fixado por substncias qumicas, tais como: metanol, albumina ou
propilenoglicol (fixadores comerciais).
Previne a lise de eritrcitos, bem como a retirada do material biolgico (esfregao) pouco espesso
presente na lmina.
Procedimento de fixao por Metanol ou Albumina.
Deixar o(s) esfregao(s) secarem a temperatura ambiente;
Cobrir o esfregao com metanol ou albumina, por aproximadamente 1 minuto;
Retirar o excesso destas substncias qumicas, sem lavar a lmina e deixar secar ao ar;
No usar calor antes de corar.


35
8-Principais Coloraes em Bacteriologia

As coloraes em bacteriologia clnica so de suma importncia, pois:
Classificam os microrganismos com base em suas caractersticas tintoriais, tamanho, forma
e arranjo;
Auxilia no diagnstico presuntivo rpido do processo infeccioso;
Indica uma terapia antimicrobiana direcionada;
Quantificam relativamente os microrganismos visualizados no esfregao podendo avaliar o
equilbrio da microbiota;
Auxilia na seleo de meios de cultura mais apropriados para semeadura inicial;
A presena de microbiota anaerbia pode ser suspeitada justificando assim a falta de
crescimento microbiano em culturas, com bacterioscopia positiva;
Avaliao quantitativa de elementos figurados (clulas epiteliais, eritrcitos, leuccitos...)
que podem auxiliar na interpretao da resposta inflamatria.

COLORAO de GRAM
Descoberto por Hans Cristian Joaquim Gram, bacteriologista dinamarqus, a colorao de Gram
tem importncia crucial na microbiologia de urgncia.
A tcnica se baseia na composio da parede celular bacteriana para diferenci-las e classific-las.
Utilizam-se dois corantes neste mtodo: violeta de genciana e fucsina diluda. Ainda empregado
um mordente (ou fixador): lugol e uma soluo diferenciadora (descorante): lcool-acetona.
Esta diferena devido composio da parede celular: nos microrganismos Gram positivos, a
parede rica em peptideoglicano, formando uma espessa camada que retm o complexo Violeta-
Lugol dentro da clula e pouco permevel ao lcool-acetona. Ao contrrio, a parede celular de
microrganismos Gram negativos apresenta uma camada mais delgada de peptideoglicano, que so
mais permeveis ao lcool e permitem a remoo do corante do interior da bactria.
Para evidenciar estas caractersticas, utiliza-se um corante de contraste, a fucsina diluda que vai
corar as clulas Gram negativas.

** Tcnica
Confeccionar o esfregao, com auxlio de ala bacteriolgica ou swab;
Aguardar a secagem natural do esfregao e fixar o mesmo pelo calor;
Colocar a lmina sobre o suporte na cuba de colorao e cobrir com violeta de genciana por
1 minuto;
Desprezar o excesso de violeta e cobrir a lmina com lugol por 1 minuto;
Lavar com gua corrente;
Descorar com lcool-acetona rapidamente;
Lavar novamente com gua corrente;
Cobrir com fucsina de Gram por 30 segundos;
Lavar, aguardar a secagem da lmina e examinar ao microscpio com objetiva de imerso.

COLORAO de ZIEHL-NEELSEN
utilizada para deteco das micobactrias de interesse clnico.
A tcnica se baseia na composio da parede celular bacteriana composta com alto teor de lipdeos
(cerca de 60%, principalmente de cido miclico), que quando tratadas pelo corante Fucsina
fenicada E AQUECIMENTO (chama do bico de bulsen) coram-se de vermelho e persistem ao
descoramento subsequente por uma soluo de lcool-cido forte (diferenciador). As outras

36
bactrias, que no possuem a mesma composio da parede bacteriana, tm a sua colorao pela
fucsina descorada pela soluo de lcool-cido e coram-se de Azul pela ao do corante Azul de
metileno (contra-corante).

** Tcnica - Ziehl-Neelsen (Colorao Quente)
Preparar um esfregao homogneo, delgado em uma lmina nova desengordurada, limpa e
seca;
Deixar secar a temperatura ambiente;
Fixar o material do esfregao passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen;
Cobrir a totalidade da superfcie do esfregao com soluo de Fucsina fenicada;
Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente com a chama do bico de
Bunsen, passando lentamente por baixo da lmina, at que se produza emisso de vapores e,
quando estes so visveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operao at completar trs
emisses sucessivas.
Lavar em gua corrente para eliminar a fucsina, deixando cair um jato dgua de baixa
presso sobre a pelcula corada, de maneira que no se desprenda;
Descorar com lcool-cido e lavar o esfregao com gua, at obter-se total retirada da
fucsina repetindo este procedimento quantas vezes necessrio;
Adicionar azul de metileno por 1 minuto, retirar o excesso do reagente e deixa secar a
temperatura ambiente.

COLORAO de KINYOUN
uma tcnica de colorao similar a colorao de Ziehl Neelsen, mas realizada a frio para
deteco micobactrias de interesse clnico.

** Tcnica - Colorao de Kinyoun (Colorao Frio)

Preparar um esfregao homogneo, delgado em uma lmina nova desengordurada, limpa e
seca;
Deixar secar a temperatura ambiente;
Fixar o material do esfregao passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de Bunsen;
Cobrir a totalidade da superfcie do esfregao com soluo de Fucsina fenicada, deixando
agir por 05 minutos;
Lavar em gua corrente para eliminar a fucsina, deixando cair um jato dgua de baixa
presso sobre a pelcula corada, de maneira que no se desprenda;
Descorar com lcool-cido e lavar o esfregao com gua, at obter-se total retirada da
fucsina repetindo este procedimento quantas vezes necessrio;
Adicionar azul de metileno por 1 minuto, retirar o excesso do reagente e deixa secar a temperatura
ambiente.


37
9-Identificao Bioqumica de Bactrias de Importncia Mdica

9.1-COCOS GRAM POSITIVOS (CGP)

Dentre os cocos Gram positivos sero enfatizados alguns gneros: estafilococos, estreptococos e
enterococos.
Aps avaliao preliminar da caracterstica macroscpica e crescimento da colnia microbiolgica,
bem como realizao do esfregao e colorao de Gram confirmando a presena de CGP em
microscpio ptico (objetiva 1000X imerso). A identificao e diferenciao dos gneros dos
cocos Gram positivos se inicia com a prova da catalase.

PROVA DA CATALASE

Finalidade
Verificar a presena da enzima catalase que decompe H
2
O
2
em H
2
O e O
2
, dessa forma, distinguir
os grupos estafilococos dos estreptococos e enterococos.

Procedimento
Com ala bacteriolgica, retirar duas ou trs colnias do meio de cultura.
Colocar a colnia sobre a lmina de vidro ou de fundo escuro e adicionar uma gota de H
2
O
2.

Leitura
Observar a formao de bolhas

Interpretao
Formao de bolhas indica ser o gnero Staphylococcus spp.
Sem formao de bolhas indica serem os gneros Streptococcus spp. e Enterococcus spp.

COCOS GRAM POSITIVOS / CATALASE POSITIVA

PROVA DA COAGULASE em Tubo

Finalidade
Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada que, reagindo
com um fator plasmtico, forma um complexo que atua no fibrinognio do plasma formando a
fibrina.

Procedimento
Colocar 0,5 mL de plasma comercial em tubo de ensaio.
Adicionar um alada de colnia diretamente no plasma comercial (plasma de coelho liofilizado).
Identificar e incubar por 4 h a 352C em estufa ou banho-maria; caso no haja formao de
cogulo, incubar por 24h.

Leitura
Formao de cogulo observada pela inclinao suave do tubo.

Interpretao
Formao de cogulo inteira ou parcial identifica o Staphylococcus aureus.
No formao de cogulo identifica os estafilococos coagulase negativa (ECN).

38
TESTE da DNase (Azul de toluidina O)

Finalidade
Verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o cido nuclico
(DNA).

Procedimento
Fazer um inculo denso de forma circular em uma pequena parte do meio DNase;
Identificar a placa e incubar a 352C por 18 24h. Na placa pode ser inoculada com vrias cepas.

Leitura
Formao de um halo cor-de-rosa ao redor do crescimento bacteriano.

Interpretao
Formao de halo cor-de-rosa identifica Staphylococcus aureus.
Crescimento bacteriano sem formao de halo cor-de-rosa identifica os estafilococos coagulase
negativa.
OBS: este teste pode tambm ser usado para identificao dos bacilos Gram negativos no
fermentadores de glicose.

TESTE fermentao do MANITOL

Finalidade
Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o manitol contendo 7,5% de cloreto de
sdio.

Procedimento
Semear com auxlio de ala bacteriolgica as colnias (3-4 colnias) na superfcie do gar manitol.
Identificar o tubo e incubar a 352C em estufa microbiolgica por 18-24h.

Leitura
Formao de superfcie amarela produzida pelas colnias no gar manitol.

Interpretao
Formao de superfcie amarela pelas colnias identifica Staphylococcus aureus.
Meio permanece inalterado na superfcie, identifica estafilococos coagulase negativa (ECN).
OBS: outras espcies de estafilococos, com pouca frequncia, tambm podem produzir cido a
partir do manitol, portanto tambm devem ser testados quanto produo de coagulase.

TESTE de resistncia NOVOBIOCINA

Finalidade
Verificar se o microrganismo resistente novobiocina.

Procedimento
Semear a colnia em gar Mueller-Hinton, atravs da tcnica de execuo do antibiograma.
Com auxlio de pina estril, colocar um disco de novobiocina 5g/mL.

39
Leitura
Formao de halo de inibio, que deve ser medido.

Interpretao
Formao de halo 16 mm identifica Staphylococcus saprophyticus.

TESTE de resistncia POLIMIXINA B

Finalidade
Verificar se o microrganismo sensvel ou resistente a polimixina B.

Procedimento
Semear a colnia em gar Mueller-Hinton, atravs da tcnica de execuo do antibiograma.
Com auxlio de pina estril, colocar um disco de polimixina B.
Identificar a placa e incubar a 352C em estufa microbiolgica por 18-24h.

Leitura
Formao ou ausncia de halo de inibio.

Interpretao
Formao de halo, Staphylococcus haemolyticus, S. saprophyticus, S. intermedius e S.
hominis.
Ausncia de halo, Staphylococcus aureus e S. epidermidis.
OBS: Para espcie Staphylococcus lugdunensis a sensibilidade ou resistncia a polimixina B
varivel.

TESTE de PYR (pyrrolidonil arilamidase)

Finalidade
O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida tambm por
alguns estafilococos coagulase negativa (ECN).

Procedimento
Com auxlio de uma pina, retirar um disco de PYR do frasco e coloc-lo sobre uma lmina ou
placa de Petri vazia.
Pingar uma gota de gua destilada estril (no utilizar salina, pois torna a reao mais lenta e menos
intensa).
Realizar um esfregao (de preferncia com palito de madeira) com bactria a ser testada, recm-
isolada, sobre o disco de PYR umedecido.
Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reao ocorre em at um minuto.

Interpretao
Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha.
Os Staphylococcus lugdunensis, S. haemoliticus e S. intermedius so PYR (+).
O aparecimento de colorao amarela ou laranjada indica resultado negativo.

PROVA CONPLEMENTAR para Staphylococcus lugdunensis e S. haemoliticus.
Finalidade

40
Avalia a habilidade enzimtica dos S. lugdunensis e S. haemoliticus em degradar o aminocido
ornitina, resultando em uma alcalinizao do meio.

Procedimento
Com auxlio da ala ou agulha de repique microbiolgica, introduzir com uma picada central no
gar ornitina 03 a 04 colnias do ECN a ser testado.

Leitura
Formao de cor amarela ou roxa no tubo contendo ornitina.

Interpretao
Teste (+): Meio com colorao roxa
Teste (-): Meio com colorao amarela

Quadro. Identificao resumida das principais espcies de importncia clnica de Estafilococos.
Coagulase DNAse Manitol Novobiocina Polimixina PYR Outras provas

S. aureus + + + S R ----

S. epidermidis S R ----

S. haemolyticus S S + Ornitina Neg.

S. hominis S S

S. intermedius + + S S + ----

S. lugdunensis S V + Ornitina Pos.

S. saprophyticus + R S ----

Legenda: + = positivo; = negativo; S= sensvel; R= resistente; V= variao.

OBS: A identificao completa at espcies, utilizando-se procedimento manual ou sistema
comercial, deve ser realizada para isolados clinicamente significativos como: hemocultura, cateter
endovenoso, amostras de stios estreis ou quando o mesmo ECG for isolado repetidas vezes.

Principais Sndromes Infecciosas causadas pelos Staphylococcus spp.
Pneumonias, Bacteremias, Infeces de pele e tecidos moles, Meningites.
Infeces relacionadas ao uso de prteses e cateteres venosos.
*Staphylococcus aureus: o CGP mais importante entre os estafilococos. Coloniza 20 a 40% dos
adultos, sendo encontrados principalmente em narinas anteriores.
*S. epidermidis: Relacionado com infeces associadas ao uso de cateteres endovenoso,
endocardites, entre outras.
*S. saprophyticus: Causa infeces urinrias agudas, sobretudo em mulheres jovens, saudveis e
sexualmente ativas.
*S. haemolyticus: Presente na microbiota humana normal da pele. Sendo relatada resistncia aos
glicopeptdeos.
*S. hominis: encontrado na pele humana e relacionado bacteremia em pacientes
imunodeprimidos.
*S. lugdunensis: Associado a casos de endocardite.


41
COCOS GRAM POSITIVO / CATALASE NEGATIVA

A classificao do tipo de hemlise fator primordial para indicar quais as provas de identificao
devem ser realizadas a fim de chegar a espcies de cocos Gram positivo, catalase negativa.

TESTE de sensibilidade BACITRACINA

Finalidade
Diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A) de outras espcies de CGP catalase negativa.

Procedimento
Com auxlio do swab umedecido com salina estril, pegar 04 ou 05 colnias puras beta-hemolticas
da placa primria ou reisolamento.
Semear as colnias presentes no swab, em gar sangue com movimentos retilneos e uniformes em
todos os sentidos da placa.
Colocar na superfcie do AS um disco de bacitracina 10mcg.
I identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 352C em estufa por 18-24h.

Leitura
Formao de halo de inibio.

Interpretao
A presena de qualquer halo de inibio ao redor do disco interpretada como sensvel a
bacitracina e indicando a espcie S. pyogenes.

TESTE de CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen)

Finalidade
O teste visa identificao de cepas de Streptococcus agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o
fator CAMP que atua sinergicamente com a -hemolisina produzida pelo Staphylococcus aureus em
gar sangue.

Procedimento
Semear um inculo na horizontal de S. aureus ATCC 25923 (ou cepa de S. aureus com duplo halo
de hemlise) de um ponto a outro da placa de AS (gar sangue).
Semear perpendicularmente (90) a colnia de estreptococo beta-hemoltico a ser testada, sem que
haja contato com a estria de S. aureus.
Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 352C em estufa por 18-24h.

Leitura
Visualizar a imagem de uma seta ou meia-lua no AS.

Interpretao
A formao de uma seta ou meia-lua convergindo para o S. aureus na interseco do
crescimento das duas bactrias indica que o teste positivo e indica a espcie de
Streptococcus agalactiae.
Se no houver formao de seta ou meia-lua, o teste negativo e a cepa no pertence ao
grupo B de Lancefield.


42
TESTE de PYR (pyrrolidonil arilamidase)

Finalidade
O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida pelo
Streptococcus pyogenes, mas no pelos demais estreptococos -hemolticos. Colnias -hemolticas
de enterococos podem ser confundidas com S. pyogenes, pois ambas apresentam positividade neste
teste.

Procedimento
Com auxlio de uma pina, retirar um disco de PYR do frasco e coloc-lo sobre uma lmina ou
placa de Petri vazia.
Pingar uma gota de gua destilada estril (no utilizar salina, pois torna a reao mais lenta e menos
intensa).
Realizar um esfregao (de preferncia com palito de madeira) com bactria a ser testada, recm-
isolada, sobre o disco de PYR umedecido.
Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reao ocorre em at um minuto.

Interpretao
Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha.
Os Streptococcus pyogenes e os Enterococcus spp. so PYR positivo.
O aparecimento de colorao amarela ou laranjada indica resultado negativo.

TESTE gar BILE-ESCULINA

Finalidade
Diferencia os Enterococcus spp de outros Streptococcus spp., tendo como princpio a hidrlise da
esculetina presente no meio de cultura bile-esculina pela bactria; formando esculetina e dextrose.
A esculetina reage com sais de ferro presente no meio bile-esculina tornando-o enegrecido.

Procedimento
Semear com auxlio de ala bacteriolgica as colnias (3-4 colnias) do gar sangue na superfcie
do gar Bile-esculina. Identificar o tubo e incubar a 352C em estufa microbiolgica por 18-24h.

Interpretao
Presena de cor enegrecida na superfcie do meio bile-esculina, identifica Enterococcus spp.
Meio permanece inalterado na superfcie do meio bile-esculina, identifica outros Streptococcus spp.

TESTE de crescimento em NaCl 6,5%

Finalidade
Determinar a capacidade do microrganismo de crescer em altas concentraes de sal.

Procedimento
Com auxlio de ala inocular 03 a 04 colnias a serem testadas em um caldo BHI suplementado
com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador). Identificar o tubo e incubar a 352C em estufa
microbiolgica por 24h.

Interpretao


43
A turvao ou mudana de cor (no caso adio indicador) indica crescimento de Enterococcus spp.

PROVA da OPTOQUINA

Finalidade
Frmaco utilizado para indicar se o estreptococos alfa-hemoltico um pneumococo. A optoquina
uma droga solvel em gua que se difunde rapidamente em meio de cultura slido.

Procedimento
Com auxlio do swab umedecido com salina estril, pegar 04 ou 05 colnias puras alfa-hemolticas
da placa primria ou reisolamento.
Semear as colnias presentes no swab, em gar sangue com movimentos retilneos e uniformes em
todos os sentidos da placa. Colocar na superfcie do AS um disco de optoquina 5g.

Interpretao
Presena de halo de inibio 14 mm = Sensvel a optoquina Streptococcus pneumoniae.
O pneumococo pode apresentar halos < 14 mm, como os estreptococos grupo viridans.
Deve-se ento ser realizado o teste de bile solubilidade.

TESTE de BILE-SOLUBILIDADE (desoxicolato de sdio 2%)

Finalidade
Capacidade do desoxicolato de sdio (sal biliar) de lisar seletivamente o Streptococcus pneumoniae
em fase logartmica do crescimento. Este sal ativa as enzimas autolticas (autolisinas) produzidas
pelo pneumococo, acelerando a reao ltica natural da bactria.

Procedimento
Preparar uma suspenso bacteriana densa a partir da cultura recente.
Utilizar 02 tubos de ensaio transparentes, para o teste: Tubo controle C e Tubo teste T.
Adicionar soluo de desoxicolato de sdio 2% ao tubo T e soluo salina a 0,85% ao tubo C.
Os volumes em cada tubo devem ser iguais 0,5ml (500L). Adicionar a cada tubo o mesmo volume
da suspenso bacteriana.
Homogeneizar e incubar a 352C em estufa microbiolgica.
Fazer a leitura imediatamente, aps 1h e at 2h de incubao.

Interpretao
Reao Positiva = TuboT lmpido ou turvao visivelmente menor que o Tubo C,
confirma a espcie Streptococcus pneumoniae.
Reao Negativa = Tubo T com turvao igual ao tubo C.

TESTE SULFAMETOXAZOL+TRIMETOPRIM (STX)

Finalidade
Verificar se os estreptococos no pertencem ao grupo A, B ou D de Lancefield.

Procedimento

44
Com auxlio do swab umedecido com salina estril, pegar 04 ou 05 colnias puras beta-hemolticas
da placa primria ou reisolamento. Semear as colnias presentes no swab, em gar sangue com
movimentos retilneos e uniformes em todos os sentidos da placa.
Colocar na superfcie do AS um disco de STX. Identificar e incubar em jarra de vela, a 352C por
18-24h.

Interpretao
Ausncia de halo (Resistente), Streptococcus pyogenes; S. agalactiae e Enterococcus spp.
Presena de halo (Sensvel), estreptococos no A, B ou D.

Quadro. Identificao resumida dos Streptococcus spp. de importncia Clnica
Identificao
Hemlise Bacitracina CAMP PYR Bile
Esculina
NaCl
6,5%
Optoquina Bile
Solub.
STX
S. agalactiae R + V R R
S. pyogenes , S + R R
S. pneumoniae V S + S
S. grupo Viridans , V V R S
S. grupo C, F e G V R S
Enterococcus spp. ,, R + + + R R
Legenda: R= resistente; S= sensvel; V= varivel; + = positivo; = negativo.

Quadro. Identificao dos estreptococos alfa-hemoltico
Optoquina / zona de inibio Bile Solubil. Interpretao
14 mm S + S. pneumoniae
8 a 13 mm R + S. pneumoniae
8 a 13 mm R S. grupo viridans
< 8 mm R S. grupo viridans
Legenda: S= sensvel; R= resistente; + = positivo; = negativo.

Os testes padronizados pelo setor de microbiologia do LACHGU para identificao dos
enterococos em nvel de espcie (Kit-Enterococos-PROBAC) so baseados em caractersticas
bioqumicas destes cocos Gram positivos, catalase negativa. Tais testes sero descritos abaixo.

TESTE da ARGININA

Finalidade
Determinar se o Enterococcus spp em estudo capaz de hidrolisar o aminocido arginina.

Procedimento
Com auxlio de ala ou agulha de repique estril inocular 03 a 04 colnias, depositando o inculo na
parede do tubo, abaixo do leo mineral. Incubar o tubo a 352C em estufa por 24h.


45
Leitura
Hidrlise da arginina
Cor prpura do meio mais acentuado que tubo controle: utilizao do aminocido.
Cor do meio igual ou mais amarelada que tubo controle: no utilizao do aminocido.

TESTE de MANITOL, SORBITOL e ARABINOSE.

Finalidade
Determinar se o Enterococcus spp. em estudo capaz de consumir os aucares manitol, sorbitol e
arabinose, sendo detectado pela produo de cido.

Procedimento
Com auxlio de ala ou agulha de repique estril inocular 03 a 04 colnias por picada central nos
tubos de meio de cultura manitol, sorbitol e arabinose. Identificar e incubar o tubo a 352C em
estufa por 24h.

Leitura
Consumo do manitol/sorbitol/arabinose
Cor rosa intenso dos tubos: Reao Positiva.
Cor rosa claro dos tubos: Reao Negativa.

MOTILIDADE do microrganismo

Finalidade
Determinar a capacidade de movimentao do enterococos em estudo, distinguindo deste modo, a
espcie do microrganismo em questo.

Procedimento
Com auxlio de ala ou agulha de repique estril inocular 03 a 04 colnias por picada central nos
tubo de meio de cultura do teste de motilidade.
Identificar e incubar o tubo a 352C em estufa por 24 horas.

Leitura
Crescimento alm da picada, motilidade POSITIVA.
Crescimento somente na picada, motilidade NEGATIVA.

PIGMENTO da colnia bacteriana

Finalidade
A identificao da colorao da colnia tem como finalidade auxiliar na diferenciao das espcies
de enterococos.

Procedimento
Com auxlio de swab estril branco passar o mesmo nas colnias e verificar as cores.

Leitura
As colnias dos enterococos podem apresentar colorao branca ou amarela.

46
Interpretao dos Resultados (identificao espcies dos enterococos)
Os resultados so realizados por um sistema nmero, criado pelo kit comercial (Kit-Enterococos-
PROBAC); onde aps leitura das provas se coloca valores estabelecidos para as provas positivas e
para as provas negativas assume-se o valor zero. Em seguida os valores obtidos em cada srie de
provas so somados. E aplicado a uma tabela com os valores encontrados e suas respectivas
espcies de enterococos em ANEXOS.

Principais Sndromes Infecciosas causadas pelos Streptococcus e Enterococcus spp.

Os enterococos so causadores de endocardite, infeces no trato urinrio (ITU), infeces da
corrente sangunea, e de stio cirrgico e intra-abdominal. Mas tambm infrequentemente podem
causar pneumonias e meningites em pacientes debilitados; bem como empiema em portadores de
doena heptica.

* Streptococcus pyogenes: podem causar faringites, impetigo, erisipela, endocardites, meningites,
artrites, infeces respiratrias. Cepas produtoras de toxinas podem causar a febre escarlatina e
choque txico.
* Streptococcus agalactiae: podem causar infeces graves em neonatologia, como meningite e
sepse. Em adultos com neoplasias, imunodeficincias e diabetes mellitus podem predispor infeces
como endocardite, bacteremia, infeces de pele e tecidos moles, pneumonia e osteomielites.
* Streptococcus pneumoniae: pneumonia, meningite, otite mdia aguda, artrite sptica, peritonite e
derrame pleural.
* Streptococcus do grupo viridans: fazem parte da microbiota normal da cavidade oral, trato
gastrointestinal e trato genital. Entretanto sua presena pode estar associada endocardite subaguda,
especialmente em portadores de prteses valvulares.

9.2-BACILOS GRAM NEGATIVOS (BGN)

Dentre os bacilos Gram negativos sero enfatizados a famlia Enterobacteriaceae (Fermentadores de
Glicose) e os bacilos Gram negativos no fermentadores de glicose (BGNNF).
A identificao e diferenciao dos gneros e espcies de BGN so diferenciadas com base na
presena ou no de diferentes enzimas codificadas pelo material gentico dos cromossomos
bacterianos. Estas enzimas participam do metabolismo bacteriano em diversas vias, que podem ser
detectadas por meio de cultura contendo substratos com os quais estas enzimas podem reagir,
detectando a utilizao do substrato ou a presena de produtos metablicos em especfico,
visualizados por substncias indicadoras.

9.2.1-ENTEROBACTRIAS

As enterobactrias possuem caractersticas em comum que definem a famlia Enterobacteriaceae,
tais como: fermentam a glicose com ou sem produo de gs, so aerbios e anaerbios
facultativos, a maioria reduz nitrato a nitrito, so catalase positiva, a maioria oxidase negativa e
podem ser mveis por flagelos peritrqueos ou imveis.
Podem ser utilizadas tcnicas de identificao manual, semi-automatizada e automatizada.


47
**Provas de identificao manual

CITRATO
Finalidade
Verificar se as bactrias so capazes de utilizar o citrato como nica fonte de carbono.

Procedimento
Com auxlio de ala ou agulha de repique estril estriar 03 a 04 colnias na superfcie do tubo de
meio citrato. Identificar e incubar o tubo a 352C em estufa por 24h.

Interpretao
Crescimento bacteriano e/ou mudana de cor para azul intenso Reao Positiva
Ausncia de crescimento bacteriano, cor inalterada Reao Negativa.

FENILALANINA (FENIL)
Finalidade
Verificar se as bactrias so capazes de degradar o aminocido fenilalanina atravs da enzima
fenilalanina desaminase, tendo como produto final da reao o cido fenilpirvico.
O cido fenilpirvico detectado com adio do Cloreto frrico 10% (indicador da reao).
Somente os gneros: Proteus, Morganella e Providencia possuem a enzima fenilalanina desaminase.

Procedimento
Com auxlio de ala ou agulha de repique estril estriar 03 a 04 colnias na superfcie do tubo de
meio citrato. Identificar e incubar o tubo a 352C em estufa por 24h.
Aps 24h de incubao adicionar o cloreto frrico 10%.

Interpretao
Colorao verde musgo na superfcie do fenil, aps adio do cloreto frrico Reao Positiva.
Ausncia de colorao verde musgo, aps adio do cloreto frrico 10% Reao Negativa.

LISINA
Finalidade
Verificar a capacidade das bactrias de descarboxilar o aminocido lisina em amina, resultando em
alcalinidade do meio de cultura lisina; bem como verificar a motilidade bacteriana e a visualizao
do indol (produto final da descarboxilao do aminocido triptofano) detectado com a adio do
reativo de Ehrlich ou Kovacs.

Procedimento
Com auxlio de ala ou agulha de repique estril inocular 03 a 04 colnias por picada central no
tubo do meio lisina. Identificar e incubar o tubo a 352C em estufa por 24h.
Aps 24h de incubao interpretar as reaes metablicas.

Interpretao
# Descarboxilao da lisina
Teste (+): Lisina com colorao roxa
Teste (): Lisina com colorao amarela

# Motilidade bacteriana
Crescimento alm da picada (turvao do meio lisina). Motilidade POSITIVA.
Crescimento somente na picada (meio lisina lmpido). Motilidade NEGATIVA.

48
# Produo de indol
Adicionar o reativo de Ehrlich ou Kovacs e observar a reao.
Teste (+): formao de anel rseo na superfcie do meio, aps adio do reativo Ehrlich.
Teste (): formao de anel amarelado na superfcie do meio, aps adio do reativo Ehrlich.

RUGAI
Finalidade
Verificam se as bactrias so capazes de: fermentar glicose e lactose, produzir gs e H
2
S (gs
sulfdrico), degradar uria e o aminocido triptofano. Todas estas informaes so visualizadas nas
bases inferior e superior do tubo Rugai.

Procedimento
Com auxlio de ala ou agulha de repique estril inocular 03 a 04 colnias por picada central at o
final do tubo e ao chegar superfcie do meio Rugai realizar estrias. Identificar e incubar o tubo a
352C em estufa por 24h. Aps 24h de incubao interpretar as reaes metablicas.

Interpretao
Na Base Inferior do Tubo Rugai
Fermentao da Glicose
Teste (+): base inferior do rugai amarela = bactria fermentadora de glicose.
Teste (): base inferior do rugai inalterada (verde) = bactria no fermentadora de glicose.

Produo de Gs
Teste (+): bolhas na base inferior do tubo rugai.
Teste (-): ausncia de bolhas na base inferior do rugai.

Produo de H
2
S (gs sulfdrico)
Teste (+): Base inferior do rugai com colorao negra.
Teste (): Ausncia de colorao negra na base inferior do rugai.

Degradao da Uria
Teste (+): base inferior do rugai azul = bactria degrada uria pela ao enzima urease.
Teste (): base inferior do rugai sem a colorao azul = bactria no degrada uria.

Na Base Superior do Tubo Rugai
Fermentao da sacarose
Teste (+): base superior do rugai amarela = bactria fermentadora de sacarose.
Teste (): base superior do rugai inalterada (verde) = bactria no fermenta sacarose.

Degradao do aminocido Triptofano
Atravs da enzima L-triptofano desaminase na base superior do meio de cultura Rugai.
Teste (+): colorao verde musgo ou acastanhada no pice do Rugai.
Teste (): ausncia de colorao verde musgo ou acastanhada no pice do Rugai.

**Provas de identificao semi-automatizada (Kit comercial)
Existem atualmente vrios painis comerciais de identificao para as enterobactrias, deste modo
ser citada apenas o painel padronizado pela rotina do setor de microbiologia do LEAC-HGU. O
painel constitudo de 25 provas que estaro descritas em ANEXOS.


49
GUIA SIMPLIFICADO
Para Provas Manuais de Identificao Bioqumica de Algumas Enterobactrias.

Proteus spp H
2
S (+) / Cor negra na base inferior do Rugai.
Fenil (+)
Cor base superior tubo Morganella spp Uria (+) / Cor azul na base inferior do Rugai.
Verde musgo.
Providencia spp Glicose (+)/Cor amarela na base inferior do Rugai.

Salmonella spp Lisina (+) / Cor roxa no tubo do meio lisina.
Indol () / Ausncia halo rseo na lisina.
Fenil ()
Cor base superior inalterada.
H
2
S (+) Edwardsiella tarda Lisina (+)
Cor base inferior Negra. Indol (+) / Presena de halo rsea na lisina.

Citrobacter spp Lisina ()
Indol (+)

Citrato (+) Klebsiella spp Motilidade ()
Fenil () Cor Azul base superior
H
2
S () do tubo de meio. Enterobacter spp Motilidade (+)
Cor da base superior
Inalterada.

Escherichia coli Lisina (+)
Citrato () Indol (+)
Cor Verde base superior
do tubo de meio. Shigella spp Lisina ()
Indol ()

OBS: Nos casos em que as provas manuais de identificao no determinam as espcies das
enterobactrias deve-se utilizar o painel comercial, descrito em ANEXOS.


50
**Provas de identificao automatizada (Equipamentos)
Atualmente no so realizadas na rotina do setor de microbiologia clnica do LEAC-HGU.

Identificao complementar das enterobactrias causadoras de infeces, isoladas na
coprocultura.

realizada com sorotipos comerciais (SoroKit-PROBAC) para Salmonella spp, Shigella spp. e
Escherichia coli clssica e invasora.

Procedimento
Adicionar ao tubo de rugai da bactria a ser testada 0,5 ml (500L) de soluo de salina estril,
homogeneizando bem para obter uma suspenso bem concentrada.
Em placa de fundo escuro, realiza-se a reao:
Colocando 50 l da suspenso bacteriolgica a ser testada nas reas da placa;
Adiciona-se, em cada reao, o soro correspondente, homogeneizando com basto de plstico;
Agitar a placa de reao por 2 minutos (agitador de Kline ou manualmente com movimentos
giratrios);
Aps trmino de 2 minutos, observar se h presena de grumos de aglutinao, o que indica
positividade da reao.

No Esquecer
Dentro da famlia Enterobacteriaceae, encontram-se espcies bacterianas relacionadas
bioquimicamente, mas divididas em subgrupos por critrios sorolgicos, de acordo com a presena
de antgenos, tais como:
Ag somtico (O)
Ag flagelar (H)
Ag Capsular (K)
Em atividades de rotina de bacteriologia clnica a confirmao feita apenas para bactrias de
importncia patognica e epidemiolgica em gastroenterites como:

# Salmonella spp: utilizando sorotipos para pesquisa de antgeno somtico (O) e flagelar (H).

#Shigella spp; utilizando sorotipos especficos somente para o antgeno (O) de cada espcie desse
microrganismo (S. sonnei, S. flexneri, S. dysenteriae e S. boydii).

# Escherichia coli
Enteropatognicas (EPEC) e Enteroinvasoras (EIEC) utilizando sorotipos para antgenos (O) e (H).
As EPEC so mveis isoladas em coproculturas de crianas at 2 anos de idade e pesquisadas com
soro polivalente A, B e C. J as EIEC so imveis, isolada de pacientes adultos, com uso de soros
polivalentes A e B.

Principais Sndromes Infecciosas causadas pelas Enterobactrias
Abscessos, Pneumonia, Meningites, Septicemias, infeces de feridas, trato urinrio e
gastrointestinal.
Dentre as enterobactrias as que atualmente predominam nas Infeces Relacionadas Assistncia
Sade (IRAS) so: Escherichia coli, Klebsiella spp. e Enterobacter spp.
Importante

51
9.2.2-BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES DE GLICOSE BGNF

So bactrias incapazes de utilizar carboidratos (principalmente glicose) como fonte de energia
atravs da fermentao, degradando-os pela via oxidativa. A maioria dos BGNF so mveis e
oxidase positiva.
Possuem como habitat natural o meio ambiente, sendo encontrados na gua e solo.
As amostras oriundas do meio ambiente hospitalar so frequentemente isoladas de respiradores,
cateteres de suco, antisspticos, soros, etc.
Dentre os principais gneros causadores de infeces em seres humanos, destacam-se:

Pseudomonas spp.;
Acinetobacter spp.;
Complexo Burkholderia;
Stenotrophomonas sp.;
Chryseobacterium spp.

Principais Sndromes Infecciosas causadas pelos BGNF
Abscessos, Pneumonia por Ventilao Mecnica, Meningites, Septicemias, Infeces de feridas e
trato urinrio pela utilizao de sondas.

Devido baixa atividade metablica, em relao s Enterobactrias, a identificao
bioqumica torna-se mais complexa, portanto as caractersticas morfolgicas, macroscpicas e
microscpicas so ferramentas auxiliares fundamentais durante o processo de identificao.

As provas de identificao das espcies de BGNF foram padronizadas de forma manual e semi-
automatizada (Kit comercial) pelo setor de microbiologia do LEAC-HGU.
Dentre as provas manuais, o Rugai o teste que presume a no fermentao da glicose pela via
fermentativa, pois a base inferior do tubo de rugai apresenta-se inalterado (verde). Ento se deve
utilizar o kit comercial (Kit NFII-Probac) para identificar as espcies de BGNF, descritas em
ANEXOS.

9.3- BACILOS LCOOL CIDO RESISTENTE (BAAR)

Os bacilos lcool cido resistente (BAAR) so causadores da Tuberculose e Hansenase. O quadro
abaixo mostra outros possveis materiais biolgicos que podem ser isolados os BAAR.

Tuberculose Pulmonar Tuberculose Extra pulmonar
Escarro Urina
Lavado Brnquico Lquidos: pleural, sinovial, peritoneal, lquor, etc.
Lavado bronco-alveolar Secrees ganglionares e de ndulos mamrios
Fragmento de Tecido Pulmonar
Fragmentos tecidos
(bipsia cutnea, de rgos e de ossos)
------- LINFA
------- Aspirado gstrico

52
OBS: Para o diagnstico da tuberculose intestinal recomenda-se a bipsia de fragmento do
intestino, pois o material biolgico (FEZES) apresenta resultado falso-positivo devido grande
quantidade de outros bacilos Gram negativos.

Diagnstico Laboratorial
o Baciloscopia
Aps realizao do esfregao do material biolgico e colorao pelo mtodo de Ziehl-Neelsen ou
Kinyoun. Deve-se observar o esfregao em objetiva de imerso.

A quantidade de BAAR existentes nos agrupamentos varivel. O aspecto agregado dos bacilos
devido produo do fator corda.
O aspecto fragmentado encontrado com frequncia nas baciloscopias de controle de tratamento.
A fragmentao decorrente, principalmente pela ao das drogas antituberculosas que agem na
parede celular do BAAR.
J os BAAR na linfa so visualizados de forma arranjados e organizados denominados globias.

BAAR em esfregao de escarro corado em Ziehl-Neelsen. Efeito corda do BAAR, meio de cultura lquido.

Leitura e Interpretao
Em amostras de escarro, quando:
no so encontrados BAAR em 100 campos visualizados, relata-se:
No foram visualizados BAAR na amostra analisada.

so encontrados de 1 a 9 BAAR em 100 campos visualizados, relata-se:
Apenas a quantidade de BAAR na amostra encontrada
.
So encontrados de 10 a 99 BAAR em 100 campos visualizados, relata-se:
Positivo (+).

Encontrada em mdia de 1 a 10 BAAR por campo visualizado, relata-se:
Positivo (++).

Encontrada em mdia mais de 10 BAAR por campo visualizado, relata-se:
Positivo (+++).
Em outras amostras, quando:
no so encontrados BAAR, em todo esfregao, relata-se:
No foram visualizados BAAR na amostra analisada.

Encontrado BAAR em qualquer quantidade, em 100 campos, relata-se:
Positivo.


53
o Cultura
Responsvel pelo isolamento e a multiplicao de BAAR.
Diferentes meios de cultura tem sido desenvolvidos para o isolamento das micobactrias porm, os
mais utilizados nos laboratrios de microbiologia so os meios slidos e os meios lquidos, como
por exemplo: Lowenstein-Jensen, Ogawa-Kudoh, Middlebrook 7H10 e 7H9.
O crescimento de colnias de BAAR de aproximadamente 30 dias.

OBS: Quando solicitado, a cultura para BAAR o material biolgico encaminhado ao laboratrio
de apoio.

A tuberculose humana causada por cinco espcies de bactrias pertencentes ao gnero
Mycobacterium: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti e M. canetti. Atualmente
essas espcies esto agrupadas e definidas como complexo M. tuberculosis.
J a segunda doena mais prevalente no mundo a hansenase, tem como agente etiolgico o
Mycobacterium leprae.

9.4- DIPLOCOCOS GRAM NEGATIVO

Dentre os diplococos Gram negativos os mais comumente isolados na rotina laboratorial so:
Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae e Moraxella catharralis, estas espcies so
analisadas juntas devido possibilidade de haver confuso na sua identificao.
Os diplococos Gram negativos so: achatados nas laterais, dando a forma de rins ou dois gros de
feijo unidos, imveis, oxidase e catalase positiva e utilizam carboidratos por via oxidativa e no
fermentativa.


Vrios podem ser as amostras clnicas coletadas para o isolamento dos diplococos Gram negativos,
tais como:
Secreo uretral, endocervical, orofaringe, conjuntiva, glndula de Bartholin, lquor, lquido
sinovial, sangue, entre outros.

Bacterioscopia
Aps realizao do esfregao do material biolgico e colorao pelo mtodo de Gram. Deve-se
observar o esfregao em objetiva de imerso.
Leitura
Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presena ou ausncia de
diplococos Gram negativos, se esto intracelulares ou extracelulares e quantidades de neutrfilos.

Cultura e Identificao
O isolamento dos diplococos Gram negativos devem ser realizados em gar especficos (Chocolate
e Thayer-Martin) e gar no seletivo (gar Sangue). Identificar e incubar em jarra de vela placa de
meio a 352C em estufa por at 72h caso no haja crescimento de colnias.
Algumas provas para identificao manual das principais espcies de diplococos Gram negativos
podem ser realizadas, conforme descritas no quadro abaixo.


54
Quadro de identificao resumida dos Diplococos Gram Negativos de Importncia Clnica.
Bactria Morf. OXI CAT OFGLI DNAse AS MAL LAC SAC FRU
N. meningitidis diplococos + + no
cresce
+ +
N. gonorrhoeae diplococos + + no
cresce

Neisseria spp. diplococos ou
cocobacilos
+ V V + V V V V
Moraxella
catharralis
diplococos + + no
cresce
+ +
Legenda: OXI= oxidase; CAT= catalase; AS= crescimento gar sangue; V= varivel; OFGLI= oxidao/fermentao da glicose,
+ = positivo; = negativo; MAL= maltose; LAC= lactose; SAC= sacarose; FRU= frutose.

Principais Sndromes Infecciosas causadas pelos Diplococos Gram Negativos.

# Neisseria gonorrhoeae
No homem causa: uretrite, prostatite e estenose uretral.
Na mulher causa: corrimento vaginal, endocervicite, uretrite, doena inflamatria plvica entre
outras patologias.
Em recm-nascidos pode causar uma conjuntivite denominada Oftalmia neonatorum.
# Neisseria meningitidis
Podem causar meningite e infeco sistmica grave com coagulao intravascular disseminada
(CIVD).
# Moraxella catarrhalis, pode causar otite, sinusite e pneumonia.

9.5- BACILOS GRAM NEGATIVOS PLEOMRFICOS ou
COCOBACILOS GRAM NEGATIVOS

O gnero Haemophilus chamado de cocobacilos Gram negativos ou bacilos Gram negativos
pleomrficos, so anaerbios facultativos, necessitam de hemina (fator-X) e/ou nicotinamida
adenina dinucleotdeo (NAD
+
, fator-V) para o seu crescimento.


Bacterioscopia
Aps realizao do esfregao do material biolgico e colorao pelo mtodo de Gram. Deve-se
observar o esfregao em objetiva de imerso.
Leitura
Relatar a bacterioscopia de modo a quantificar no material analisado a presena ou ausncia de
microrganismos visveis de vrias formas = pleomrfico, ou seja, cocobacilos Gram negativos.

Cultura e Identificao
O isolamento dos Haemophilus spp. devem ser realizada em gar chocolate suplementado e para
realizao do antibiograma o meio de cultura recomendado o gar HTM (Haemophilus Test
Medium). Identificar e incubar em jarra de vela placa de meio a 352C em estufa por at 72h caso
no haja crescimento de colnias.

55
Algumas provas para identificao manual das principais espcies de Haemophilus podem ser
realizadas, conforme descritas abaixo.

FATORES X E V
Finalidade
Determinar a afinidade dos Hamophilus spp. em crescer utilizando fatores proticos como hemina
e/ou NAD
+
.

Procedimento
Com auxlio do swab estril umedecido com salina estril, pegar 04 ou 05 colnias puras da placa
primria (gar chocolate suplementado) ou reisolamento.
Semear as colnias presentes no swab, em gar chocolate ou HTM com movimentos retilneos e
uniformes em todos os sentidos da placa. Colocar na superfcie do gar chocolate os discos
comerciais com os fatores X e V com pina estril a uma distncia de 1,5 cm um disco do outro.

Interpretao
Crescimento bacteriano entre os discos = Haemophilus influenzae.
Crescimento bacteriano ao redor apenas do disco com fator X = H. parainfluenzae.
Crescimento bacteriano ao redor apenas do disco com fator V = H. ducrey.

Fonte: Manual de Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica para Controle Infeco Hospitalar.

PROVA DO SATELITISMO
Finalidade
Determina a capacidade do gnero Haemophilus em crescer ao redor da lise total das hemcias em
gar sangue devido ao do Staphylococcus aureus.

Procedimento
Com auxlio ala calibrada, pegar colnias puras dos cocobacilos Gram negativos para realizao de
suspenso bacteriana em salina estril na escala de 1 a 2 de Mc Farland.
Em seguida semear a suspenso em gar sangue e inocular uma nica estria de S. aureus hemoltico
(ATCC 23922). Identificar a placa e incubar em jarra de vela, a 352C em estufa por 18-24h.

Interpretao

56
Aps 24 horas de incubao verificar o crescimento de colnias pequenas prximas zona de
hemlise do estafilococo.

Quadro com algumas Provas para Diferenciar as Principais espcies de Haemophilus.
Espcies Fator X Fator V GLI SAC LAC Catalase
H. influenzae + + +
H. parainfluenzae + + + V
H. ducrey +
Legenda: GLI= glicose; SAC= sacarose; LAC= lactose; V= varivel; += positivo; = negativo.

Principais Sndromes Infecciosas causadas pelos Haemophilus spp.
** Haemophilus influenzae, principalmente tipo b na infncia: meningite, pericardite, pneumonia,
osteomielite e celulite facial.
** Haemophilus parainfluenzae pode causar pneumonias ou endocardites.
** Haemophilus ducrey causa o cancride ou cancro mole.

9.6- CHLAMYDIA spp. e TREPONEMA spp.

As clamdias so bactrias cocides imveis, parasitas intracelulares obrigatrios de clulas
eucariontes, incapazes de produzir sua prpria energia sendo inteiramente dependentes da clula
hospedeira. Entretanto, as clamdias possuem uma parede celular e contm DNA, RNA e
ribossomos, sendo ento classificadas como bactrias.
O gnero Chlamydia tem apenas trs espcies: Chlamydia tracomatis, C. psittaci e C.pneumoniae;
todas causam doena no homem.

Diagnstico laboratorial para Chlamydia spp.

Cultura de Clulas
o mtodo de eleio para o diagnstico at o momento; porm pouco utilizada na rotina de
laboratrios clnicos, devido s dificuldades tcnicas.

Tcnica de ELISA
Empregam anticorpos mono ou policlonais que detectam o LPS da bactria. Na sua maioria estes
testes no so espcie-especfica podendo dar reao falso-positiva para outras bactrias presentes
no material biolgico como, por exemplo, na secreo vaginal.

Imunofluorescncia Direta
Emprega conjugados de fluorescena-isotiocianato e anticorpos monoclonais direcionados para
protenas de membrana ou LPS (endotoxina) de C. trachomatis. Comercialmente disponvel em
forma de Kits.

Tcnicas Moleculares
Hibridizao com Sondas de cidos nuclicos;
Amplificao de cidos nuclicos (PCR-Reao de Cadeia Polimerase).
Ambas as tcnicas so utilizadas na deteco de Chlamydia trachomatis.


57
J as espiroquetas so helicoidal, mveis atravs de flagelos, no so coradas pelo mtodo de Gram.
Pode ser observada em microscopia de campo escuro das amostras clnicas obtidas a partir de
leses. A espcie Treponema pallidum o principal agente patognico humano, causador da sfilis.
O Treponema pallidum no cresce fora do hospedeiro humano, deste modo todas as tentativas de
cultivar in vitro os treponemas no foram possveis.

Diagnstico laboratorial para Treponema pallidum.

Microscopia de Campo Escuro
O corante utilizado o Fontana-Tribondeau onde se observa o microrganismo pela impregnao do
mesmo pela prata. Atualmente pouco usado na rotina laboratorial.

Testes Sorolgicos (testes sorolgicos para Lues)
So dependentes de reaes antgeno-anticorpo. As tcnicas podem utilizar extratos desta bactria
(testes treponmicos) ou outras substncias como as reaginas (testes no-treponmicos).

9.7- MYCOPLASMA spp. e UREAPLASMA spp.

Os micoplasmas so os menores microrganismos capazes de subsistir na forma extracelular, so
fastidiosos, carecem de parede celular e especificamente, todos necessitam de colesterol para
crescer. O Mycoplasma hominis e o Ureaplasma urealyticum so importantes patgenos do trato
urogenital humano. J Mycoplasma pneumoniae causa uma importante enfermidade respiratria
denominada pneumonia atpica primria.

Diagnstico laboratorial para Mycoplasma hominis e o Ureaplasma urealyticum.

Bacterioscopia
Devido a sua dimenso e ausncia de parede celular, no so corados pelos corantes
bacteriolgicos, consequentemente no so visualizados com auxlio de microscpios pticos.

Cultura em Meio Lquidos e Slidos
Atualmente vrios so os kits comerciais disponveis para deteco das colnias destes
microrganismos em meios especficos que podem ser lquidos ou slidos.

OBS: A implantao do kit comercial para tais microrganismos esto em fase de adequao pelo
setor de microbiologia do LACHGU.

Principais Sndromes Infecciosas causadas pelos Mycoplasma e Ureaplasma.
* Mycoplasma hominis
Pode causar uretrite e cistite, est relacionado tambm com cervicites e abscessos tubo-ovarianos.
* Ureaplasma urealyticum
Agente responsvel por 20 a 30% dos casos de uretrite no gonoccica. Esta associada com, parto
prematuro, septicemia, meningite e pneumonia nos recm-nascidos. Em pacientes
imunocomprometidos o U. urealyticum est associado artrite, osteomielite, pericardite e doena
pulmonar progressiva.


58
10- DIAGNSTICO LABORATORIAL das INFECES GENITAIS.

Os microrganismos que colonizam o trato genital feminino incluem lactobacilos, bacilos
difterides, estafilococos coagulase negativa, estreptococos alfa e gama hemolticos, enterobactrias
e leveduras.
A uretra masculina normalmente contm relativamente poucos microrganismos encontrados na
pele, tais como: estafilococos, micrococos, estreptococos alfa hemolticos e bacilos Gram positivos
como as corynebactrias.
O setor de microbiologia deve estar capacitado para, detectar os principais agentes causadores das
sndromes infecciosas do trato genital masculino e feminino, tais como:

Vaginite Infecciosa
Os principais microrganismos envolvidos so leveduras do gnero Candida e Trichomonas
vaginalis (protozorio que afeta aproximadamente 180 milhes de mulheres em todo mundo).

Manifestaes Clnica

** Vaginite infecciosa por Candida spp.
Leucorria vaginal branca e espessa. Prurido vaginal, queimao ou irritao na vulva. So comuns
eritemas, edema e escoriaes. Os sintomas podem aumentar na semana antes do fluxo menstrual.
A Candida albicans responsvel por 80-90% dos episdios de candidase vulvo-vaginal. Mas
atualmente outras espcies tambm so consideradas patognicas, tais como C. glabrata e C.krusei.

** Vaginite infecciosa por Tricomonase.
Leucorria vaginal abundante, podendo ser verde-amarelada e apresentar odor de peixe. So comum
o eritema vaginal e disria.


Exame direto a fresco

Finalidade
Visualizar a presena dos protozorios flagelados e mveis, bem como leveduras em brotamento ou
pseudo-hifas. A presena de leuccitos, hemcias e clulas epiteliais descamativas tambm devem
ser descritas e quantificadas.
Procedimento
Deve-se colocar a suspenso formada (secreo + salina estril) em lmina com auxlio do swab e
em seguida colocar lamnula.
Observar toda lmina em microscpio ptico em objetiva de 10X e 40X.
Leitura
Descrever de forma quantitativa a presena de leuccitos, clulas descamativas, leveduras e
protozorio.

Bacterioscopia
Aps realizao do esfregao bacteriolgico, as lminas devem ser coradas pela colorao de Gram.
Observar em microscpio ptico em objetiva de imerso a presena de estruturas leveduriformes
(pseudo-hifas) que se coram de roxo, leuccitos e clulas epiteliais corados de rseo.


59
Cultura
Conforme padronizao do setor de microbiologia do LEAC-HGU as secrees vaginais e uretrais
masculinas so semeadas em AS, AC e MC. Microrganismos capazes de crescer nestes meios de
cultura so identificados e avaliados quanto a sua importncia clnica.
Vale ressaltar que o isolamento do Trichomonas vaginalis ocorre em meios de cultura especficos,
no sendo realizado no LEAC-HGU de forma rotineira.

Vaginose Bacteriana (polimicrobiana)
Os principais microrganismos envolvidos so: Gardnerella vaginalis, Mobilluncus spp. e
Mycoplasma homonis. Vrios estudos tm demonstrado um aumento de 2 a 7% na taxa de risco de
nascimentos prematuros em mulheres com vaginose bacteriana.

Manifestaes Clnica

Leucorria cinza e ftida, prurido e irritao. O eritema e edema so incomuns na regio vaginal.


Exame direto a fresco

Finalidade
Visualizar a presena de bactrias, leuccitos e clulas epiteliais descamativas.
O procedimento j foi descrito anteriormente.
Leitura
Descrever de forma quantitativa a presena de leuccitos, bactrias e clulas epiteliais.

Bacterioscopia
Observar em microscpio ptico em objetiva de imerso a presena de:

# Cocobacilos Gram variveis (Cocobacilos Gram positivo e/ou negativo);
# Clulas epiteliais cobertas com cocobacilos Gram variveis, denominadas de Clue Cells o
achado de melhor valor preditivo de vaginose bacteriana.
# Presena de bacilos Gram negativos curvos, sugestivos de anaerobiose (Mobilluncus spp.).

Mobilluncus spp.
Cocobacilos Leuccitos
Gram Variveis Clue Cells


60
Cultura
Conforme padronizao do setor de microbiologia do LEAC-HGU as secrees vaginais e uretrais
masculinas so semeadas em AS, AC e MC. Microrganismos capazes de crescer nestes meios de
cultura ricos so identificados e avaliados quanto a sua importncia clnica.
Vale ressaltar que o isolamento da Gardnerella vaginalis ocorre em meio de cultura seletivo
(gar Vaginalis), no sendo realizado no LEAC-HGU de forma rotineira.

Uretrite Gonoccica (UG)
O principal microrganismo envolvido o diplococo Gram negativo (Neisseria gonorrhoeae).

Manifestaes clnicas

Secreo purulenta verde amarelada, disria, polaciria e urgncia miccional.


Bacterioscopia
Observar em microscpio ptico em objetiva de imerso a presena de numerosos leuccitos
polimorfonucleados (>10 por campo) e diplococos Gram negativos intracelulares e extracelulares.

Cultura
A secreo uretral deve ser semeada em meio de cultura especfico como Thayer-Martin, caso no
seja possvel pode ser semeado em gar chocolate. Incubar em jarra de vela em estufa a 352C por
at 72horas. A identificao da espcie pelo crescimento da colnia ocorre por provas de
metabolismo bioqumico da bactria.

Uretrite No Gonoccica (UNG)
Os principais microrganismos envolvidos so: Chlamydia trachomatis e Ureaplasma urealyticum.

Manifestaes clnicas

Secreo de cor clara ou turva menos espessa que a desencadeada pela gonorria e disria.


Tcnicas moleculares em caso de suspeita de C. trachomatis.
Hibridizao com Sondas de cidos nuclicos;
Amplificao de cidos nuclicos (PCR-Reao de Cadeia Polimerase).

Cultura em caso de suspeita de Ureaplasma urealyticum.
Kits comerciais disponveis para deteco das colnias destes microrganismos em meios especficos
que podem ser lquidos ou slidos.


61
11- TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE aos ANTIBACTERIANOS (TSA) ou
ANTIBIOGRAMA (ATB)

O antibiograma uma das principais tarefas executadas pelo setor de bacteriologia clnica, pois tem
como funes avaliar o padro de resposta da bactria (padro de sensibilidade) diante de
concentraes preestabelecidas de antibiticos, orientar a escolha da terapia antimicrobiana mais
adequada, monitorar a evoluo da resistncia bacteriana e um mtodo auxiliar na implantao de
medidas de controle da disseminao de bactrias multiresistentes.
Todas as etapas envolvidas na realizao do TSA, desde a seleo dos antibiticos a serem testados
at a interpretao dos resultados, so padronizadas por organizaes especializadas como:

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, EUA);
British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC, Reino Unido);
Comit de LAntibiogramme de la Socit Franaise de Microbiologie (CA-SFM, Frana);
European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST, Europa).

Estas organizaes elaboram documentos de consenso, gerados por diversos especialistas que
apresentam recomendaes detalhadas sobre a realizao e interpretao dos testes de sensibilidade.
A maioria dos laboratrios brasileiros segue as padronizaes recomendadas pelo CLSI.

O TSA deve ser sempre realizado na avaliao das seguintes bactrias:
Enterobactrias, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Staphylococcus spp., Enterococcus spp.,
Streptococcus pneumoniae, Streptococccus do grupo viridans e beta-hemolticos, Haemophilus
influenzae, Complexo Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Neisseria
gonorrhoeae e Neisseria meningitidis.

11.1- MTODOS UTILIZADOS na EXECUO do TSA ou ATB

Mtodo Qualitativo
O teste de difuso de discos foi descrito por Kirby e Bauer em 1966 e fornece resultados em
categorias definidas como: sensvel, intermedirio e resistente. um dos mtodos de sensibilidade
mais simples e confiveis.

Mtodos Quantitativos
Os mtodos quantitativos podem ser realizados por vrias tcnicas, tais como:

# Macrodiluio em tubos
Envolve a preparao de diluies seriadas e logartmicas (log
2
) de antimicrobianos em um meio de
cultura lquido, o qual permitir o crescimento bacteriano.

# Microdiluio em caldo
Utilizam placas plsticas estreis com vrios poos, com fundo em formato de U, para permitir
melhor visualizao do crescimento bacteriano. Nesta placa, um nmero varivel de
antibacterianos, colocado em distintas concentraes.

# Etest
uma fita plstica fina e inerte (5mm de largura x 60mm de comprimento) disponvel
comercialmente, que se baseia na difuso do gradiente antimicrobiano no gar para determinao da
sensibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano testado.

62
Um lado desta tira calibrado com uma escala visual indicando a concentrao da droga naquele
local. Duas letras no alto da tira indicam o antimicrobiano que est sendo usado, do outro lado desta
fita encontra-se impregnada um gradiente exponencial pr-estabelecido do antimicrobiano.
Ao aplicar a tira no meio de cultura (com a face escrita voltada para cima), imediatamente a droga
comea a se difundir. Deste modo, as tiras no podem ser removidas uma vez aplicadas superfcie
do gar. Aps a incubao, uma elipse simtrica de inibio formada.

Portanto, o mtodo quantitativo descrito anteriormente tem como finalidade determinar a
Concentrao Inibitria Mnima do antimicrobiano, ideal para o tratamento do paciente. Essa
medida conhecida como MIC (Minimum Inibitory Concentration), refletindo a potncia do
antibitico e a unidade utilizada, mg/L.

Dentre vrios mtodos descritos, os realizados rotineiramente pelo setor de microbiologia do
LEAC-HGU so o de disco-difuso e o E-Test.

11.2- PROCEDIMENTO de EXECUO do TSA por DISCO-DIFUSO.

Preparo da Suspenso bacteriana
Mtodo direto
O mtodo direto recomendado para culturas com at 24 horas de incubao ou isolados
provenientes de meios no seletivos.
Procedimento
Com auxlio da ala calibrada pegar colnias puras e isoladas e suspender as mesmas em soluo
fisiolgica estril. Esta suspenso deve ser comparada com a escala 0,5 de Mc Farland de turvao
atravs de luminosidade intensa (luminria).

Mtodo de crescimento
O mtodo de crescimento recomendado para culturas com mais de 24 horas ou de meios seletivos.
Procedimento
Com auxlio da ala calibrada pegar colnias puras e isoladas e suspender as mesmas em caldo TSB
ou BHI e incubar em estufa a 352C por 2 a 6 horas. Esta suspenso deve ser comparada com a
escala 0,5 de Mc Farland de turvao atravs de luminosidade intensa (luminria).

O que Escala de Mc Farland?
um padro de turvao utilizado em microbiologia clnica.
Para determinar a intensidade da multiplicao bacteriana em meios lquidos.
Facilitando a obteno do equilbrio ideal de microrganismos com as concentraes
presentes nos discos de antibiticos e o gar Mueller-Hinton.

Esta multiplicao pode ser observada por um aumento de bactrias se comparadas com
concentraes de partculas qumicas (BaCl
2
e H
2
SO
4
), atravs da passagem de luz. A escala de Mc
Farland est disponvel comercialmente ou pode ser realizada manualmente no laboratrio de
anlises clnicas, conforme descrio abaixo.

Preparo Escala 0,5 de McFarland
Colocar 0,5ml da soluo de 0,048M BaCl2 em 99,5 ml da soluo de 0,35N H2SO4.

63
Agitar constantemente.
Medir a densidade da soluo preparada em espectrofotometria no comprimento de onda de
652nm.
O resultado da absorbncia deve estar entre 0,08 e 0,10.
Distribuir a soluo sob agitao, em tubos com tampa de rosa da mesma espessura dos
tubos utilizados para fazer o antibiograma. Vedar ao redor da tampa do tubo para evitar a
evaporao e manter protegido da luz temperatura ambiente.

Inoculao da Suspenso nas Placas
Para a semeadura da suspenso, utiliza-se um swab estril que, mergulhado na suspenso
pressionado na parede do tubo para retirar o excesso. A semeadura feita passando o swab sobre a
superfcie da placa de Mueller-Hinton, com gar de espessura de 0,4cm em trs direes.

Colocao dos discos de antibiticos
Ao colocar os discos, pression-los suavemente com pina previamente flambada para que
permanea no local em que foi aplicado;
Uma vez colocado o disco na placa, no remov-lo mais, pois a difuso da droga imediata
aplicao do disco;
Deve-se colocar, no mximo, 12 discos na placa, para que no haja sobreposio de halos, o que
dificulta a leitura e a interpretao do teste.
Retirar os discos do freezer ou geladeira por 1 a 2 horas antes do uso.
Os discos devem ser conservados em geladeira (4 a 8C ) ou freezer para manter alguns antibiticos
com substncias inibidoras de Beta-lactamase.

Incubao das placas
Incubar as placas em posio invertida por 18 a 24horas, em estufa de 352C.

Importante
Para verificar a sensibilidade de bactrias exigentes contra diferentes antibiticos deve-se verificar
qual atmosfera de incubao e meios de culturas ideais para o seu crescimento, facilitando a
visualizao dos halos formados.

Leitura e Interpretao dos resultados
Efetuar a leitura pela observao, a olho nu, do halo de inibio com uma boa fonte de iluminao e
com auxlio de uma rgua milimetrada, medir o maior dimetro do halo (passar pelo centro do
disco). Classificar o resultado da leitura obtida, para cada antibitico, como: Sensvel, Resistente
ou Intermedirio, atravs de consulta em tabelas baseadas na CLSI.

11.3- MECANISMO de AO dos ANTIBITICOS.

Os antibiticos so substncias qumicas produzidas por microrganismos ou de forma sinttica, com
a capacidade de inibir ou matar bactrias. So agrupados em classe, de acordo com sua estrutura
qumica e mecanismo de ao, conforme descrito abaixo.

64
Antibiticos que atuam na Inibio da Sntese Protica.
Penetram pela membrana bacteriana atravs das porinas, interagem com alvos especficos
localizados no ribossomo, interferindo diretamente na sntese Protica, provocando efeito
bacteriosttico.
As principais classes de antibiticos que atuam na sntese de protenas so:
# Macroldeos (Eritromicina, Claritromicina, Azitromicina);
#Aminoglicosdeos (Gentamicina, Tobramicina, Amicacina, etc..);
#lincosaminas (Clindamicina);
#Tetraciclinas (Tetraciclinas, Doxicilina, Minociclina);
#Estreptogramina (Quinopristina/Dalfopristina);
#Oxazolidinona (Linezolida).

Antibiticos que atuam na Sntese dos cidos Nuclicos
Inibem a sntese do cido nuclico por ligao ao RNA polimerase ou inibio do DNA-girase,
provocando efeito bactericida.
As principais classes de antibiticos que atuam na sntese dos cidos nuclicos so:
#Quinolonas e Fluorquinolonas (cido nalidxico, cido pipemdico, Ciprofloxacina, Norfloxacina,
Levofloxacina, Gatifloxacina, Ofloxacina, etc.)

Antibiticos que atuam sobre a Parede Bacteriana
Impedem a formao da parede celular durante o estgio de replicao bacteriana pela ao em
nvel enzimtico.
As principais classes de antibiticos que atuam sobre a parede bacteriana so:
#Penicilinas ( Amoxicilina, Ampicilina, Oxacilina, Meticilina, etc.);
# Cefalosporinas;
Cefens 1 gerao (Cefalotina, Cefalexina e Cefazolina)
Cefens 2 gerao (Cefaclor, Cefoxitina, Cefuroxima, etc.)
Cefens 3 gerao (Ceftriaxona, Ceftazidima, Cefotaxima, etc.)
Cefens 4 gerao (Cefepime e Cefpiroma)
#Betalactmicos associados a inibidores de beta-lactamase (Amoxicilina/cido clavulnico,
Ampicilina/Sulbactam, Piperacilina/Tazobactam);
#Monobactmico (Aztreonam);
#Carbapenmicos (Imipenem, Meropenem e Ertapenem);
#Glicopeptdeos (Vancomicina e Teicoplanina);

Antibiticos que atuam sobre a Membrana Citoplasmtica
Possuem atividade detergente, penetrando da membrana externa para membrana interna da bactria.
Como consequncia se tem a diminuio da integridade da membrana, por lise de lipoprotenas.
A principal classe de antibitico que atua na membrana celular das bactrias :
# Polimixinas (Colistina e Polimixina B).

O uso indiscriminado, errneo ou desnecessrio de antibiticos ao longo dos anos, apontado como
um dos maiores agentes potenciais da apario de bactrias resistentes aos antibiticos mais
comumente usados, devido presso seletiva, ou seja, as bactrias se adaptam e sobrevivem a
mudanas das condies ambientais gerando descendentes mais resistentes aos antimicrobianos.


65
12- RESISTNCIA BACTERIANA AOS ANTIBITICOS

No incio da era dos antibiticos, o fenmeno da resistncia bacteriana no parecia ser um problema
to grave. Essa resistncia era resolvida com introduo de novos agentes bacterianos. Atualmente
bactrias multiresistentes vem aumentando no mbito hospitalar, diminuindo a sobrevivncia dos
pacientes. Deste modo, de fundamental importncia compreender tais mecanismos de resistncia
bacteriana para que se possa adotar medidas de controle e preveno no ambiente hospitalar.

Como as bactrias adquirem resistncia?
Resistncia Intrnseca
uma caracterstica natural de determinados grupos de bactrias, sendo espcie ou gneros-
especficos, e delimita o espectro de atividade dos antimicrobianos.
Muitas vezes, confirmam a correta identificao de uma bactria, ou so considerados como
marcador no monitoramento de procedimentos padronizados.

Resistncia Adquirida
Mutao Cromossmica
Ocorre durante o processo de replicao das bactrias. Pode ocorrer erros que modificam a
sequncia da codificao do DNA e, consequentemente alterao da informao contida no DNA
original, produzindo clulas com mutao especifica, que ser transferida as futuras geraes.
As mutaes so consideradas a forma menos frequente da resistncia adquirida.

Transferncia de Genes de resistncia por:
Conjugao
Ocorre transferncia dos genes de resistncia atravs do plasmdeo havendo necessariamente,
contato entre as clulas bacterianas.

Transduo
A transferncia dos genes de resistncia realizada por intermdio de um vrus (bacterifago).

Transformao
Transferncia de genes de resistncia da clula doadora para a receptora sem contato entre as
clulas.

Transposio
Genes determinantes de resistncia podem transferir-se de um plasmdeo a outro, para o
cromossomo ou para um bacterifago. O elemento responsvel pela transferncia o transposon.

12.1-PRINCIPAIS MECANISMOS DE RESISTNCIA DAS BACTRIAS

Inativao Enzimtica
Certas bactrias produzem enzimas que neutralizam a droga ou seus efeitos antimicrobianos.
As enzimas podem ser:

66
Constitutivas
Produzidas independentemente da presena do antibitico, que quando presente passa e exercer um
efeito seletivo.

Induzveis
Determinados antibiticos, quando em contato com a bactria, desencadeiam ou estimulam a
produo enzimtica que proteger a bactria dos efeitos dos antibiticos.

Alterao da permeabilidade da membrana
A alterao na expresso dos canais de porina modifica a penetrao e consequentemente ao de
diferentes antibiticos.

Efluxo ativo de antibiticos
Propriedades de expulsar ativamente os antibiticos para fora da clula, contribuindo para uma
concentrao inadequada da droga e, consequentemente, ao no efetiva (bomba de efluxo).

Alterao do stio ligao do antibitico (alvo)
Os antibiticos se ligam a stios especficos na parede celular da bactria. Se esse stio for alterado,
o antibitico no pode efetivar a ligao e torna-se ineficiente contra a bactria.

Produo pelas bactrias de enzimas que inativam o antibitico.
Exemplos de enzimas: Penicilinase (presente nos estafilococos).
ESBL-Beta Lactamase Espectro Estendido ( presente enterobactrias).
AMP-C (Beta Lactamase cromossmica, presente em algumas
enterobactrias e BGNF).
Enzima / Antibitico.

Impermeabilidade da membrana bacteriana externa pela alterao
ou pela diminuio quantitativa das porinas.
Exemplo: Pseudomonas aeruginosa imipenem-resistentes.
Estafilococos macroldeos-resistentes.
Enterococos vancomicina-resistente.
Antibitico.
Porina.

Efluxo de antibiticos.
Ocorre expulso da molcula pelo transporte ativo.
Exemplo: Estafilococos tetraciclina-resistentes.
Porinas.

Modificao do alvo dos antibiticos.
Exemplo: Estafilococos oxacilina-resistentes (modificao da protena
de ligao da Penicilina PBP).
Streptococcus pneumoniae penicilina-resistentes.
Alvo Modificado.

67
12.2- RESISTNCIA dos CGP e BGN ALGUNS ANTIBITICOS.

Resistncia dos Staphylococcus spp. contra:

OXACILINA
Algumas cepas de Staphylococcus aureus e os ECN possuem a capacidade de modificar o stio de
ao deste antibitico, por meio da produo alterada da protena ligadora penicilina (PBP). Esta
PBP codificada pelo gene cromossomal mecA, fazendo com que a oxacilina e os outros
compostos -lactmicos no reconheam o seu alvo na clula bacteriana. Por esta razo, os
Staphylococcus spp., resistentes oxacilina so resistentes a todos os -lactmicos
independentemente dos resultados in vitro.
Os Staphylococcus aureus resistentes a oxacilina so chamados ORSA.

GLICOPEPTDEOS - Vancomicina
Algumas cepas de S. aureus com sensibilidade reduzida vancomicina (classe dos glicopeptdeos)
apresentam um espessamento da parede celular bacteriana, pois agem inibindo a sntese da parede
(peptideoglicano) atravs do seu precursor a D-alanil-D-alanina alteradas.
Os S. aureus com sensibilidade intermediria aos glicopeptdeos so chamados GISA.

MACROLDEOS, LINCOSAMIDAS e ESTREPTOGRAMINA (GRUPO MLS).
Algumas cepas de Staphylococcus spp., produzem a enzima 23S RNAadenil-metilase que modifica
o stio de ao dos macroldeos e lincosaminas (subunidades 23S e 50S dos ribossomos)
impedindo-os de agir. A resistncia ao MLS pode ser constitutiva ou induzvel.

Resistncia do Streptococcus pneumoniae contra:

PENICILINA
Algumas cepas de S. pneumoniae modificam o stio (alvo) de ligao do antibitico. Outros
antibiticos como os macroldeos e sulfametoxazol tambm apresentam resistncia o que faz dessas
drogas uma escolha emprica arriscada.

Resistncia dos Enterococcus spp. contra:

CEFALOSPORINAS
Os enterococos apresentam uma resistncia intrnseca (natural) contra todas as geraes de
Cefalosporinas, bem como a Oxacilina, Clindamicina e Sulfametoxazol+Trimetoprim.

GLICOPEPTDEOS Vancomicina
Algumas cepas de Enterococcus spp. modifica o stio (alvo) de ligao do antibitico na parede
bacteriana, impedindo o frmaco de agir contra estas cepas. Os Enterococcus spp., resistentes a
Vancomicina so chamados VRE.

Resistncia dos Bacilos Gram Negativos (BGN) e alguns BGNF

ETA-LACTMICOS
Os -lactmicos representam a classe mais amplamente utilizada de antibacterianos. Esta classe
inclui os grupos das penicilinas, das Cefalosporinas, dos monobactmicos e dos carbapenens.

68
Trs mecanismos bsicos de resistncia aos -lactmicos tm sido descritos:
Alterao do stio de ligao dos antibiticos;
Alterao da permeabilidade da membrana externa bacteriana;
Degradao ou inativao da droga atravs da produo de enzimas chamadas -lactamases. o
principal mecanismo de resistncia dos BGN em especial das enterobactrias.

O que so -lactamases (beta-lactamases)?
So enzimas que catalisam a hidrlise do anel -lactmico, impossibilitando a atividade dos
antibiticos beta-lactmicos (cefalosporinas, penicilinas, Monobactmico e carbapenens). As -
lactamases podem ser produzidas pelas bactrias por forma plasmidial ou cromossmicas. Os
quatro tipos ou grupos de -lactamases consideradas de maior importncia clnica so:

-lactamases cromossmais induzveis (AmpC);

-lactamases plasmidiais e espectro estendido (ESBL);

-lactamases capazes de degradar os carbapenens (Carbapenemases).

Metalo--lactamases (ML)

As enterobactrias podem produzir uma ou mais -lactamases, dentre as principais espcies
produtoras de -lactamases esto:
* Klebsiella pneumoniae (KP), K. oxitoca, Escherichia coli, Enterobacter spp., produtoras ESBL.
* Citrobacter spp., Enterobacter spp., Serratia marcescens e Providencia spp. produzem Amp-C.
* Enterobacter spp e KP so produtoras de Carbapenemases.

Dentre os BGNF (bacilos Gram negativos no fermentadores) as principais espcies produtoras de
-lactamases so:
** Acinetobacter baumannii produzem ML, Carbapenemases.
** Pseudomonas aeruginosa produzem Amp-C e Carbapenemases.
** Stenotrophomonas maltophilia produzem ESBL.

12.3- TRIAGEM FENOTPICA de RESISTNCIA BACTERIANA ROTINA LABORATORIAL.

CGP Cocos Gram Positivos

Triagem com Cefoxitina e Oxacilina por disco-difuso para deteco ORSA.
So realizadas para os Staphylococcus aureus e os estafilococos coagulase negativa (ECN).

Procedimento
Realizar a suspenso bacteriana, em seguida semear em gar Mueller-Hinton e colocar os discos de
Cefoxitina (CFO) e Oxacilina (OXA) com auxlio de pina estril.
Incubar em estufa a 352C por 24horas.

Leitura
Para os S. aureus e S. lugdunensis com halo de inibio da CFO 21 mm predizem resistncia
Oxacilina.

69
Deve-se, ento reportar resistncia as cefalosporinas, monobactmicos e carbapenens
independentemente do resultado de sensibilidade destas drogas.
J halo de inibio da CFO 22 mm prediz sensibilidade Oxacilina e todos -lactmico.
Para ECN Estafilococos coagulase negativa com halo de inibio da CFO 24 mm prediz
resistncia Oxacilina. Deve-se, ento reportar resistncia as cefalosporinas, monobactmicos e
carbapenens independentemente do resultado de sensibilidade destas drogas.
J halo de inibio da CFO 25 mm prediz sensibilidade Oxacilina e todos -lactmico.
OBS: Todos os valores de halo de inibio so seguidos pela padronizao da CLSI.

Triagem com vancomicina por E-Test para deteco GISA e VRE.
So realizados para os Staphylococcus aureus e ECN, bem como para os Enterococcus spp.

Procedimento
Realizar a suspenso bacteriana, em seguida semear em gar Mueller-Hinton e colocar a fita E-Test
de vancomicina com a escala numrica do gradiente de concentrao para cima em contato com o
gar. Pressionar com auxlio de uma pina, levemente ao longo da mesma, para retirar bolhas que
eventualmente se formem. Incubar em estufa a 352C por 24horas.

Leitura
Para S. aureus, ECN e Enterococcus spp., com Concentrao Inibitria Mnima (CIM) de 4.0
g/mL prediz sensibilidade vancomicina.
Para S. aureus e ECN com CIM de 4.0g/mL predizem cepas intermedirias ao glicopeptdeos
vancomicina (GISA) e devem ser rapidamente encaminhadas para laboratrios de referncia para
confirmao genotpica.
Enterococcus spp., com CIM de 4.0g/mL predizem cepas resistentes vancomicina (VRE).
OBS: Todos os valores de CIM so seguidos pela padronizao da CLSI.

Observar o ponto de interseco do halo de inibio do crescimento do microrganismo com a fita,
conforme figura abaixo.


Triagem para o fentipo MLS (macroldeos, lincosaminas e Estreptogramina) ou Teste D.
So realizadas para os Staphylococcus aureus e os estafilococos coagulase negativa (ECN).
Como interpretar a leitura da CIM pelo E-Test?

70
Procedimento
Eritromicina (ERI) e Clindamicina (CL) prximos (03 cm, centro a centro) com auxlio de pina
estril e incubar em estufa a 352C por 24horas.

Leitura
Se houver achatamento do halo de clindamicina e resistncia a eritromicina, indica a presena do
fentipo MLS ou Teste D positivo.
Se no houver achatamento do halo de Clindamicina, indica ausncia do gen causador do fentipo
MLS ou Teste D negativo.


BGN Bacilos Gram Negativos

Triagem deteco das ESBL pelo mtodo disco-aproximao
So realizadas para as enterobactrias.

Procedimento
Realizar a suspenso bacteriana, em seguida semear em gar Mueller-Hinton, colocar um disco de
Amoxicilina+cido clavulnico situado no centro da placa e distante a 25 ou 30 mm (de centro a
centro) dos outros discos de -lactmicos (Ceftazidima, Ceftriaxone, Cefotaxima e Aztreonam)
outras Cefalosporinas de amplo espectro tambm podem ser usada.
Incubar em estufa a 352C por 24horas.

Leitura
Aparecimento de um halo fantasma ao redor dos discos dos -lactmico indica a presena de uma
cepa bacteriana produtora de ESBL, conforme figura abaixo.

Halos Fantasmas.

Fonte: LEAC-HGU/UNIC 2009
Escherichia coli ESBL.


71
Triagem deteco das Amp-C pelo mtodo disco-aproximao
So realizadas para as algumas enterobactrias do grupo CESP (Citrobacter spp., Enterobacter
spp., Serratia marcescens e Providencia spp., bem como para Pseudomonas aeruginosa.

Procedimento
Cefoxitina (CFO) e/ou Ceftazidima ou Cefotaxima prximos (30 mm, centro a centro) com auxlio
de pina estril e incubar em estufa a 352C por 24horas.

Leitura
Se houver achatamento do halo de inibio de Ceftazidima e/ou Cefotaxima e resistncia da
Cefoxitina, indica presena de uma cepa bacteriana produtora Amp-C, conforme figura abaixo.
Se houver resistncia a Cefoxitina, Ceftazidima e Cefotaxima tambm indica a presena de Amp-C.

Achatamento halo inibio
Cefotaxima (CTX)

Fonte: LEAC-HGU/UNIC - 2009
Pseudomonas aeruginosa Amp-C.

Triagem deteco das Carbapenemases pelo mtodo de Hodge
So realizadas para as Klebsiella pneumoniae e Enterobacter spp.

Procedimento
Realizar a suspenso da cepa E. coli (ATCC 25922) a 0,5 da escala de McFarland, semear a mesma
no gar Mueller-Hinton com auxlio de swab estril. Em seguida colocar um disco de imipenem ou
Ertapenem no centro da placa. Com auxlio de uma ala, estriar do centro do disco do -lactmico
at a periferia da placa de petri cepas de Klebsiella pneumoniae produtora e no produtoras de
carbapenemase. Incubar em estufa a 352C por 24horas

Leitura
Formao de halo de sensibilidade pela ATCC 25922 de E. coli e formao de distoro de halo
pela cepa teste que esta produzindo a enzima carbapenemase, capaz de inativar o imipenem.
Escherichia coli ATCC 25922 K. pneumoniae no produtora carbapenemase.

K. pneumoniae no produtora de
carbapenemase.

K. pneumoniae produtora de cabapenemase KpC.

72
13- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

BARROS, E. et al. Antimicrobianos. 4
a
ed. Porto Alegre: Artmed, 2008.
BEERS, M.H. et al. Manual Merck: diagnstico e tratamento. 17
a
ed. So Paulo: Roca. 2000.
OPLUSTIL,C.P.; et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. 2 ed. So Paulo:
Sarvier, 2004.
TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 4 ed. So Paulo: Atheneu, 2005.
ROSSI, F.; ANDREAZZI, D. B. Resistncia Bacteriana. So Paulo: Atheneu, 2005.
MENEZES E SILVA, C.H.P de; NEUFELD, P.M. Bacteriologia e Micologia para Laboratrio
Clnico. Rio de Janeiro: Revinter, 2006.
MURRAY, P. R.; et al. Microbiologia Mdica. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
PELCZAR, M. J. et al. Microbiologia: Conceitos e Aplicaes. 2
a
ed. So Paulo: Pearson Makron
Books. 1997.
VARIOS AUTORES. Boas Prticas em Microbiologia Clnica (Apostila).
OPAS/ANVISA/Laboratrio Central do Hospital So Paulo-UNIFESP. So Paulo. 2008.
Home Page cosultadas:
www.mcboaspraticas.org.br
www.anvisa.org.br


ANEXOS


Fluxograma de processamento de cultura do Cateter para exames microbiolgicos.

Descontaminao do local de trabalho (hipoclorito de
sdio, cido fnico-2% ou lcool 70%).
Trabalhar na rea de segurana (Bico Bunsen ou Capela
fluxo laminar) com EPIs obrigatrios.
Sempre conferir nome do paciente e
material biolgico a ser processado.
Cateter (05 cm)
Semear o cateter em Meio de
Cultura gar Sangue (AS)

Tipo de Semeadura-Tcnica de Maki
(Processo Rolagem com pina estril).
Incubar em atmosfera de CO
2
o AS em estufa a 352C por
at 72h. Caso no haja crescimento microbiolgico.
Identificar a placa de meio cultura AS, com nome completo
do paciente, data, hora e material biolgico semeado.

Fluxograma de processamento de cultura do ESCARRO para exames microbiolgicos.

Descontaminao do local de trabalho (hipoclorito de sdio,
cido fnico-2% ou lcool 70%).
Trabalhar na rea de segurana (Bico Bunsen ou
Capela fluxo laminar) com EPIs obrigatrios.


ESCARRO PURULENTO ou
ESCARRO por INDUO.
Meios de Cultura gar Sangue
(AS), Chocolate (AC) e
MacConkey (MC).
Tipo de Semeadura por Esgotamento
Tcnica Qualitativa com ala 10L.
2
AS e AC e aerobiose o MC em estufa a 352C por at 72horas,
caso no haja crescimento microbiolgico.
Identificao das placas meio de cultura (nome completo
paciente, data, hora e material biolgico semeado).


Fluxograma do processamento de cultura de FEZES para exames microbiolgicos.
LEGENDA:* CT= Caldo Tetrationato; MC= gar MacConkey e SS= gar Salmonella-Shigella.

Descontaminao do local de trabalho (hipoclorito
de sdio, cido fnico-2% ou lcool 70%).

Sempre conferir nome do paciente e material biolgico a ser processado.
Identificar a(s) placa(s) meio cultura(s) com nome completo paciente, data,
hora e material biolgico semeado.

Fezes obtida
de Swab Anal.
Introduzir Swab no
CT*.
Incubar o CT* em
estufa 352C por 18-
24horas.
Aps 18h, semear o
CT*
em gar MC*e SS*
Tipo de Semeadura por
Esgotamento Tcnica Qualitativa
com ala 10L.
Incubar as placas de meios de cultura em estufa a 352C por 24h.
Fezes in natura.
1 Etapa
Pegar pequena poro de fezes e
inocular na salina estril 0,95%.
Incubar em estufa por 15minutos.
Aps 15 min. Semear a salina
em gar MC* e SS*.
Tipo de semeadura por
Esgotamento. Tcnica Qualitativa
com ala 10L.
2 Etapa
Pegar pequena poro de
fezes e inocular no CT* com
02 gotas de soluo de iodo.
Incubar o CT* em estufa
35 2C por 18-24 horas.
Aps 24horas. Semear
o CT* em gar SS*.
Tipo de semeadura por
Esgotamento. Tcnica
Qualitativa com ala 10L.

Fluxograma de processamento de cultura do LBA para exames microbiolgicos.



Identificao das placas meio de cultura
(nome completo paciente, data, hora e
material biolgico semeado).
Lavado Bronco Alveolar
ou Aspirado Traqueal
Meios de Cultura gar Sangue
(AS), Chocolate (AC) e
MacConkey (MC).

Tipo de Semeadura pela Tcnica
Quantitativa com ala 01L.

2
AS e AC e aerobiose o MC em estufa a 352C por at 72h.


Fluxograma de processamento de cultura de Lquidos Biolgicos Estreis (Amnitico,
Asctico, LCR, Pleural, Peritoneal, Pericrdico, e Sinovial) para exames microbiolgicos.



Lquidos Biolgicos
Estreis.
Amostras pouco purulenta ou lmpida.
Separar parte do material biolgico e
CENTRIFUGAR.
Amostras purulentas. No h
necessidade de centrifugar.
Uma poro do lquido estril a ser processado
deve ser colocada no Caldo BHI.
Outra poro do lquido estril a ser processado deve ser semeada por
esgotamento nos Meios de Cultura gar Sangue (AS), Chocolate (AC) e
MacConkey (MC). Tcnica de semeadura qualitativa com ala de 10L.

2
(AS e AC) e aerobiose MC e BHI em estufa a 352C por at 72h.

Descontaminao do local de trabalho (hipoclorito
de sdio, cido fnico-2% ou lcool 70%).

Fluxograma de processamento de cultura do Sangue (Hemocultura Manual) para exames
microbiolgicos.

Frasco(s) de Hemocultura(s) Identificado(s).
Incubar 35 2C
Semear em
AS, AC e MC
Aps 24h
Estufa 35 2C em CO
2
Positivo
Negativo
Aps 48h
Semear em
AS, AC e MC
Positivo
Negativo
4 Dia 2
Estufa 35 2C em CO
2
Semear em
AS, AC e MC
Positivo
Emitir resultado parcial
Identificao e TSA do
microorganismo

microrganismo

Liberar Hemocultura
Negativa
Negativo
microrganismo




Fluxograma de processamento de cultura do Sangue (Hemocultura Automatizada) para
exames microbiolgicos.


Deteco do frasco hemocultura positiva
pelo equipamento automatizado.
Sempre conferir nome do paciente no frasco com a
indicao visual fornecida pelo equipamento.

Realizar descontaminao da tampa do frasco
positivo. Transferir 01 mL do sangue contido
no frasco com auxlio de seringa e agulha.
Emitir resultado parcial.
Caracterstica morfotinturial
microrganismo (Gram).
Colocar 01 ou 02 gotas do sangue em uma das
extremidades do AS, AC e MC. Realizar tcnica
qualitativa por esgotamento com ala 10L.
2
(AS e AC) e aerobiose MC em estufa a 352C por at 72h.


Fluxograma de processamento de cultura de Secrees em Geral (Feridas cirrgicas, lceras,
abscessos, exsudatos, secreo genital e ocular) para exames microbiolgicos.




Rolar o swab estril contendo secreo em uma das
extremidades do AS, AC e MC. Em seguida semear pela tcnica
qualitativa por esgotamento com ala 10 L.
2
(AS e AC) e aerobiose MC em estufa a 352C por at 72h.

Fluxograma de processamento de Urina para exames microbiolgicos.


Identificao das placas meio de cultura com
nome completo paciente, data e hora.

Homogeneizar
URINA.

Semear em gar CLED ou Cromognico. Pela tcnica
de semeadura quantitativa com ala de 1L.
Incubar em estufa a 352C por 24 a 48horas.


Fluxograma de Identificao das principais espcies de Staphylococcus spp.

()
(+)

Cocos Gram-positivos
Prova da
Catalase
Identificao Macroscpica das
colnias nos meios de cultura.
Colorao de Gram.

Staphylococcus spp.
S. aureus
Coag. (+)

DNAse (+)

Manitol (+)

Novob. (S)

Pol. B (R)

PYR ()
S. epidermidis
Coag. ()

DNAse (+)

Manitol ()

Novob. (S)

Pol. B (R)

PYR ()
S. haemolyticus
aemolyticus
Coag. ()

DNAse ()

Manitol ()

Novob. (S)

Pol B. (S)

PYR (+)

Ornit. ()
Streptococcus spp e
Enterococcus spp.

S. hominis
Coag. ()

DNAse ()

Manitol ()

Novob. (S)

Pol. B (S)

PYR ()
S. intermedius
Coag. ()

DNAse (+)

Manitol (+)

Novob. (S)

Pol. B (S)

PYR (+)
S. lugdunensis
Coag. ()

DNAse ()

Manitol ()

Novob. (S)

PYR (+)

Ornit. (+)
S. saprophyticus
Coag. ()

DNAse ()

Manitol (+)

Novob. (R)

Pol B (S)

PYR ()


Fluxograma para identificao de Streptococcus e Enterococcus spp.

e

Legenda: Resistente (R) / Sensvel (S) / Positivo (+) / Negativo ().

Isolamento de Cocos
Gram positivos.
Teste de Catalase
Negativo
Alfa-hemlise Beta-hemlise Gama-hemlise
Optoquina Bile solubilidade
R: S. grupo viridans
S: S. pneumoniae
+: S. pneumoniae
: S. grupo viridans

Teste de CAMP
+: Streptococcus agalactiae
: Outros estreptococos
PYR +: S. pyogenes
PYR : S. -hemolticos
Bile esculina + NaCl 6,5% +
PYR +
Enterococcus spp
Bile esculina NaCl 6,5%
PYR
Outros estreptococos

Fluxograma de Identificao das principais espcies do gnero enterococos.

(+)

()

()

(+)

(+)

()

() (+)

Legenda: **NCG: No caracterstico ao gnero enterococos. ARA= arabinose, SOR= sorbitol.

Catalase
PYR
Motilidade
Pigmento
E. casseliflavus E. gallinarum
Arabinose e
Sorbitol
ARA
SOR +

ARA +
SOR +

E. faecalis E. faecium
NCG**
NCG**

ANEXOS: BULAS DE KIT COMERCIAL




Leitura das Provas


Guia de interpretao positivas e negativas do painel para enterobactrias.


Citrato Negativo

Citrato Positivo

Fonte: LEAC-HGU 2009.
Prova do Citrato

Fenil Negativo

Fenil Positivo
Cloreto Frrico 10%

Prova Fenilalanina

Lisina Positiva

Lisina Negativa

PROVA DA LISINA

Indol Positivo
Formao de halo rseo aps adio
do Reativo de Ehrlich ou Kovacs.

Prova lisina deteco do Indol.

Rugai Inalterado

Rugai com consumo glicose (+) e
Produo de gs (+).
BASE do RUGAI= Gli(+) Gs(+) PICE do RUGAI
Sacarose (+)
BASE do RUGAI
Glicose (+)
Produo Bolhas = Gs (+)

Prova Rugai

Provas adicionais para identificao enterobactrias (Kit Comercial).


Catalase Positiva Catalase Negativa

Prova da Catalase

Formao de Cogulo.

Prova da Coagulase

DNAse (+)
Formao de halo rseo
ao redor colnia bacteriana.

DNAse (). Ausncia de halo rseo.
Prova da DNAse.

Fonte LEAC-HGU 2010.

Prova do Manitol

Manitol Negativo

Manitol Positivo

Fonte LEAC-HGU2010.


Prova de CAMP (Positiva).

Fonte: MENEZES e SILVA, C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia para o Laboratrio Clnico. 2006. p 236.
Prova da Bacitracina (Positiva).

Fonte: MENEZES e SILVA, C.H.P, et al. Bacteriologia e Micologia para o Laboratrio Clnico. 2006. p 237.
Prova de Optoquina (Positiva).

PYR Negativo PYR Positivo

PROVA PYR (Pyrrolidonil arilamidase).

Bile Esculina Positiva
Presena de cor negra no tubo.
Crescimento bacteriano
NaCl 6,5% Positivo
Mudana cor para amarelo.

Provas de Bile Esculina e NaCl 6,5%.

Provas comerciais complementares para identificao espcies de enterococos.

Provas comerciais complementares para identificao espcies de BGNF.


Esquema para a colocao dos discos para a deteco fenotpica de ESBL.
Mtodo de Disco-Aproximao

Legenda: ATM= Aztreonam; CPM= Cefepime; AMO+AC= Amoxicilina+cido clavulnico;
CRO= Ceftriaxone; CAZ= Ceftazidima.

Fonte: LEAC-HGU/UNIC 2008. Halos Fantasmas entre AMO+AC e Cefalosporinas.

ATM
CPM AMO+AC CRO
CAZ
03 cm
03 cm

Esquema para a colocao dos discos para a deteco do fentipo MLS.
TESTE D


Teste D NEGATIVO.

Teste D POSITIVO.


APBac 11

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

APBac 11

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

UNIVERSIDADE DE CUIAB-UNIC

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Você também pode gostar