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U1-Preparação e Esterilização de Meios de Cultura
U1-Preparação e Esterilização de Meios de Cultura
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Unidade I
Unidade I
Unidade I
Unidade I
- Hipoclorito de sdio
Trata-se de um composto muito apropriado para a desinfeco de superfcies e
de ambientes. A concentrao mais comum para essa finalidade a de 1% (p/v).
Revela-se corrosivo para alguns metais e o contacto no deve exceder 30 minutos.
Aps esse perodo deve proceder-se lavagem e secagem das superfcies ou
ambientes desinfectados.
- Compostos fenlicos
Os compostos fenlicos so muito eficazes na remoo completa de restos
orgnicos. O triclosan dotado de actividade bactericida de amplo espectro, com
excepo para a Pseudomonas aeruginosa.
- Iodo
O iodo um dos desinfectantes mais antigos para aplicao na pele e mucosas.
Actualmente, devido sua aco germicida e menor efeito custico, so aconselhados
os compostos libertadores de iodo (iodforos).
- Glutaraldedos
Os glutaraldedos so compostos que apresentam actividade mxima a
diferentes valores de pH. Conseguem ser efectivos contra todos os microrganismos
incluindo mesmo o bacilo da tuberculose. Embora sejam excelentes desinfectantes e
esterilizantes, no funcionam como anti-spticos. Na medida em que provocam
irritaes na pele, o contacto directo no deve ocorrer.
- lcoois
Os lcoois etlico e isoproplico so normalmente utilizados para desinfeco de
superfcies e anti-sepsia da pele. So compostos bactericidas de baixa potncia e,
embora possam destruir o bacilo da tuberculose e o vrus do herpes simples, no actuam
contra vrus do tipo hidrfilo, como o da hepatite B. No podem ser considerados como
Unidade I
- Calor hmido
A esterilizao por calor hmido pode ser conseguida atravs da fervura,
autoclavagem ou pasteurizao. O calor hmido conduz destruio rpida de
organismos por coagulao das protenas constituintes das suas clulas. O aparelho
mais utilizado na esterilizao de materiais e meios de cultura o autoclave. Geralmente
os autoclaves de laboratrio funcionam sob a presso de 1 atm e temperatura de
121C. A durao do tempo de esterilizao est relacionada no s com a temperatura,
como tambm com a relao superfcie/volume da massa do material a esterilizar, ou
seja, com o tempo de penetrao do calor. Para a mesma temperatura, os tempos de
tratamento trmico so tanto maiores quanto maior for o volume do material a esterilizar.
De uma forma geral, os materiais ficam esterilizados em 20-40 minutos. O material a
esterilizar deve ser devidamente preparado. Assim, os frascos a esterilizar devem ser
tapados com rolhas de algodo. Se apresentam tampas com rosca, estas devem ser
pouco apertadas para que haja sada de ar quente e entrada de vapor, de modo a evitar
o seu rebentamento no autoclave.
- Calor seco
A esterilizao pelo calor seco pode ser alcanada pelos seguintes mtodos:
flamejao, incinerao ou estufa de ar quente. As estufas de ar quente atingem
temperaturas da ordem de 160-180C, que provocam a oxidao e a desnaturao das
protenas destruindo quer as clulas vegetativas, quer os esporos. Contudo deve ter-se
Unidade I
- Filtrao
o mtodo mais usado quando se pretendem esterilizar solues contendo
compostos qumicos termo-sensveis como, por exemplo, vitaminas ou antibiticos.
Neste caso, procede-se em primeiro lugar preparao de solues stock que so
esterilizadas por filtrao. Em seguida deixa-se arrefecer o meio de cultura para valores
de temperatura inferiores a 50C e adicionam-se ento as solues de vitaminas ou
antibiticos previamente esterilizadas.
Actualmente, os filtros encontrados no mercado so de acetato de celulose ou
policarbonato e permitem filtraes com elevado grau de preciso. Existem filtros com
dimenso de dimetro de poro varivel, no entanto, os mais utilizados para efeitos de
esterilizao tm poros de 0,45 ou de 0,2 m, os quais retm, respectivamente, as
clulas e vrus presentes nas solues.
Para esterilizar uma soluo por filtrao, deve passar-se a soluo atravs de
um filtro, como por exemplo um filtro de seringa, e o filtrado tem que ser recolhido em
condies de asspsia para que no ocorra contaminao do lquido esterilizado.
A esterilizao de ar tambm pode ser conseguida por filtrao. Uma cmara de
fluxo laminar possui um sistema de filtrao de ar por membrana. Esse ar filtrado
pressionado para o interior da cmara em feixes paralelos, obrigando o ar do interior a
sair pelos poros da caixa inferior (cmara de fluxo vertical) ou pela abertura anterior
(cmara de fluxo horizontal). Fica assim criado no interior da cmara, um ambiente
estril.
Unidade I
Mtodo
Mecanismo de
aco
Uso preferencial
Comentrios
Calor hmido
Fervura
Desnaturao de
protenas
Autoclave
Desnaturao de
protenas
Pasteurizao
Desnaturao de
protenas
Calor seco
Flamejao
Incinerao
Reduo a cinzas de
todo o material, por
oxidao
Estufa
Oxidao de todo o
material
Filtrao
Remoo mecnica de
microrganismos
Meios de cultura,
solues, materiais e
instrumentos
resistentes a
temperatura e presso
elevadas
Mtodo
eficaz
esterilizao
de
Indstria alimentar, na
produo de produtos
lcteos, bebidas e
conservas
Destri
bactrias;
dependendo
da
temperatura e do tempo
de exposio pode
esterilizar
Ansa, espalhador,
agulha de platina
Mtodo
eficaz
esterilizao
de
Mtodo
eficaz
esterilizao
de
Mtodo
eficaz
esterilizao
de
Papis, carcaas de
animais, restos de
curativos (algodo,
gaze)
Materiais de vidro e
outros materiais
resistentes a altas
temperaturas
Usada na eliminao
de microrganismos de
lquidos termossensveis e do ar
Remoo de bactrias e
fungos (pode no
remover alguns vrus)
Material sensvel ao
calor (plsticos)
Mtodo
eficaz
esterilizao
Centros cirrgicos,
laboratrios
Radiaes
Ionizantes (raios
gama)
No-ionizantes
(UV)
Destruio de DNA,
formao de radicais
livres
Mutao do DNA,
formao de dmeros
de
Unidade I
- Radiaes
As radiaes so muito teis para a esterilizao de espaos, de salas, de
instrumentos e de materiais que no suportam as temperaturas exigidas pelas tcnicas
do calor.
A esterilizao por radiao ionizante uma tcnica altamente eficiente,
econmica e segura. As radiaes de alta energia so utilizadas na esterilizao de
materiais cuja sensibilidade ao calor exige condies particulares de tratamento.
A radiao ionizante promove a quebra das cadeias moleculares e induz
reaces dos fragmentos com o oxignio atmosfrico ou com compostos oxigenados,
originando a morte das clulas. As radiaes utilizadas incluem os raios gama,
produzidos a partir de cobalto-60 ou csio-139, e de raios catdicos produzidos em
geradores e aceleradores de electres. Os raios gama so radiaes com poder
ionizante que promovem a alterao de compostos celulares. Estes raios tm elevado
poder de penetrao sendo ideais para aplicao em objectos volumosos. Problemas
tcnicos dificultam ainda a sua aplicao corrente em microbiologia.
A irradiao com luz ultravioleta (UV) uma forma pouco satisfatria de
esterilizao devido fraca capacidade de penetrao nos materiais e produtos a
esterilizar. A energia das radiaes absorvida por molculas como o DNA, conduzindo
a alteraes da estrutura molecular que podero ser letais para os microrganismos. Os
raios UV so frequentemente utilizados na diminuio do nvel de contaminao de
espaos pequenos. Deve ter-se sempre presente que a lmpada UV s deve estar
ligada na ausncia de pessoas no laboratrio.
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Unidade I
9 Certificar-se de que ao dar incio s operaes, todo o material necessrio est ao alcance
imediato, de forma a realizar o trabalho o mais rapidamente possvel
9 Desinfectar e arrumar convenientemente a bancada de trabalho
9 Os recipientes devem estar abertos o mnimo tempo possvel e, enquanto abertos, todo o
trabalho deve ser realizado junto chama do bico de Bunsen
9 Uma vez abertos os recipientes, como tubos, bales e frascos, o seu bocal deve ser flamejado
de imediato
9 A fim de evitar as contaminaes durante as manipulaes que envolvam caixas de Petri, a
exposio das superfcies internas estreis deve durar o mnimo de tempo possvel
9 A extremidade das pipetas estreis que vai ser colocada em contacto com as culturas celulares,
ou com os recipientes estreis, no deve ser tocada nem entrar em contacto com superfcies
no estreis, como o caso da roupa, superfcie da rea de trabalho, o exterior de tubos, de
bales ou quaisquer outros materiais
- Ansas
As ansas so esterilizadas pela passagem na chama do bico de Bunsen, antes e depois de serem
utilizadas (Figura 1.1). Devem ser aquecidas at ficarem ao rubro para assegurar que todos os esporos
sejam destrudos. Devem ser agarradas quase pelo topo num ngulo praticamente vertical. O dedo mindinho
deve ficar livre para segurar a tampa do recipiente.
Unidade I
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- Pipetas
Para transferir culturas, meios e solues estreis devem utilizar-se pipetas
graduadas ou pipetas de Pasteur estreis de acordo com as normas a seguir descritas.
1. Remover a pipeta de vidro do pacote pela extremidade que contm o tampo de algodo, tendo
o cuidado para no tocar mais do que o necessrio de modo a segurar firmemente.
2. Colocar a pompete.
3. Segurar a pipeta como uma caneta mas no apertar a pompete. O dedo mindinho deve ficar livre
para segurar na rolha de algodo/ tampa do tubo/ frasco.
4. Apertar a pompete com cuidado e retirar a quantidade de fluido necessria mas que no atinja
nem molhe o tampo de algodo.
5. Colocar a pipeta usada num contentor de plstico com desinfectante, devidamente identificado
para esse fim.
6. A pompete no deve ser retirada at a pipeta estar dentro do contentor de plstico, de modo a
evitar que gotas de cultura contaminem a superfcie de trabalho.
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Unidade I
- Espalhadores
Os espalhadores so usados para distribuir inculos sobre a superfcie de placas
j preparadas com meios de cultura (Figura 1.3). Podem ser esterilizados em estufa uma
vez empacotados, ou por flamejao com lcool.
Unidade I
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1. Mergulhar a extremidade do espalhador num pequeno volume de lcool a 70% (v/v) contido num
recipiente com tampa ou coberto com papel de alumnio.
2. Passar rapidamente atravs da chama do bico de Bunsen; o lcool vai arder esterilizando o
vidro.
3. Afastar o espalhador ligeiramente da chama at o lcool parar de arder.
4. Pousar o espalhador numa superfcie estril como uma caixa de Petri ou um copo graduado.
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Unidade I
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- Meio YEPD
O meio YEPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose) o meio rico mais utilizado para
o crescimento de fungos e em particular de leveduras, sempre que no so necessrias
condies especiais para o seu cultivo. Fornece um excesso de carbono e azoto, assim
como de aminocidos, precursores de nucletidos, vitaminas e metabolitos essenciais
para um ptimo crescimento celular.
Composio do meio YEPD*
Extracto de levedura
5 g/l
Peptona
10 g/l
Glucose
20 g/l
Agar
*Pode usar-se a mesma receita reduzindo as concentraes para metade, excepto o agar. O agar apenas adicionado na
preparao de meios de cultura slidos.
A soluo de glucose tambm pode ser esterilizada por filtrao (filtros estreis
de poro 0,45 m) em condies asspticas. Posteriormente, tambm em condies
asspticas, a soluo de glucose pode ser adicionada outra soluo j esterilizada. Por
fim, o meio vertido em placas esterilizadas e deixado solidificar.
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Unidade I
- Meio LB
O meio LB (Luria-Bertani broth) utilizado para crescimento e manuteno de
bactrias.
Composio do meio LB
Triptona
10 g/l
Extracto de levedura
5 g/l
Cloreto de sdio
10 g/l
Agar
Preparao de meio LB
1. Medir o volume necessrio de gua desionizada para um balo Erlenmeyer.
2. Pesar o extracto de levedura, a triptona e o cloreto de sdio.
3. Adicionar ao balo e agitar at dissolver.
4. Adicionar o agar e agitar at homogeneizar.
5. Perfazer o volume final desejado, adicionando gua e agitar.
6. Esterilizar o meio de cultura no autoclave a 120 C durante 20 minutos.
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6. Agitar suavemente a caixa para assegurar que o meio fica uniformemente distribudo.
7. Deixar o meio solidificar na placa.
8. Guardar a placa em posio invertida.
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Unidade I
Figura 1.5
Isolamento de
microrganismos
pela tcnica de
cultura em estria.
A) Diagrama de
uma placa de
isolamento.
B) Aspecto de
uma placa de Petri
com colnias
isoladas.
8. Com uma nova pipeta estril retirar 1 ml da diluio 10 e transferir para outro tubo para obter a
-2
diluio 10 .
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1. Antes de proceder sementeira das placas de Petri, estas devem ser marcadas na parte
marginal da sua base com as seguintes indicaes: meio de cultura, organismo, diluio,
data do ensaio, identificao do grupo de trabalho.
2. Seleccionar as trs ltimas diluies da suspenso de S. cerevisiae 10-4,10-5 e 10-6.
3. Agitar vigorosamente cada um dos tubos de ensaio contendo a diluio antes de proceder sua
inoculao em meio slido.
4. Entreabrir trs caixas de Petri com meio YEPD e colocar 0,1 ml de cada uma das trs diluies
(Figura 1.6).
5. Mergulhar o espalhador no copo contendo lcool puro e pass-lo na chama do bico de Bunsen
ou da lamparina. Deixar a chama apagar no espalhador e esperar cerca de 30 segundos at
ele arrefecer.
6. Passar o espalhador sobre a superfcie do meio rodando as caixas de Petri com cuidado. Aps
algum tempo nota-se uma certa resistncia na movimentao do espalhador, o que indica
que o inculo foi absorvido pelo meio.
7. Todas as placas de Petri inoculadas devem ser incubadas temperatura ambiente, durante 24 a
48 horas. Verificar se todas as placas esto devidamente identificadas antes de se
colocarem na estufa (25 a 30 C).
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Cultura
me
1ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
9 ml
Diliuio: 10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
Plaquear: 0,1 ml
Figura 1.6 - Diluies decimais de uma cultura microbiana e inoculao por espalhamento em meio
de cultura slido.
1. Utilizando uma proveta estril, verter para um balo Erlenmeyer de 250 ml estril, 100 ml de
meio YEPD.
2. Com a ajuda de uma ansa estril, adicionar em condies de asspsia, o microrganismo
proveniente de uma placa de isolamento previamente preparada (Figura 1.7).
3. Tapar o balo e coloca-lo no agitador orbital durante 24 horas, temperatura de 25 a 30 C.
4. Observar e registar as alteraes de turbidez da cultura ao longo do tempo.
Unidade I
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- Manuteno de culturas
conveniente manter uma cultura pura em stock. A maioria das culturas que so
consideradas apropriadas para uso, so tambm facilmente mantidas por sub-cultivo em
meio de cultura para crescimento. Para evitar os sub-cultivos, as culturas devem ser
mantidas em criotubos contendo meio lquido ao qual se adiciona glicerol (30%, p/v,
concentrao final), e congeladas a -70C (Figura 1.8). Na ausncia deste equipamento,
podem manter-se a -20C. O laboratrio deve organizar a sua coleco de
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Unidade I
microrganismos, elaborando para isso um registo de cada uma das espcies, o meio de
cultura apropriado, bem como da sua origem.
Para retirar um novo inculo basta remover um pouco da cultura (por exemplo
com um palito estril), e inocular pelo mtodo do riscado numa placa de Petri com o
meio de cultura adequado.
Bibliografia
WWW
http://www.asmusa.org/edusrc/labcore.htm