IMUNODIAGNÓSTICO

Carlos Eduardo Tosta

In: CE Tosta, MI Muniz-Junqueira, H Lenzi. Imunologia (em preparação)

1. Casos clínicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2. O que é imunodiagnóstico?. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
3. Princípios e métodos de imunodiagnóstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2
4. Interpretação dos testes de imunodiagnóstico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
5. O que sabemos, o que pensamos que sabemos e o que não sabemos sobre
imunodiagnóstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
6. Perspectivas ..
6. Referências bibliográficas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . .

2. O que é imunodiagnóstico?
Testes de imunodiagnóstico são aqueles que se baseiam na especificidade da
resposta imunitária para detectar anticorpos, antígenos ou linfócitos objetivando o
diagnóstico de infecções, de autorreatividade imune, de processos alérgicos ou
neoplásicos, e também para a detecção/quantificação de hormônios ou drogas.
Embora o método mais seguro para se diagnosticar uma infecção seja o
isolamento e a caracterização do agente infeccioso, isto nem sempre é possível ou
prático. São várias as razões: ou porque o agente está localizado em sítios de difícil
acesso (ex.: encéfalo), ou por não se dispor de métodos simples, práticos ou seguros
para seu isolamento ou cultivo (ex.: infecções por vírus), ou porque o paciente está
recebendo drogas antiinfecciosas que impedem o crescimento do agente infeccioso in
vitro. Nessas circunstâncias, as técnicas de imunodiagnóstico são muito importantes já
que permitem confirmar a infecção através da presença de antígenos dos agentes
infecciosos ou, mais freqüentemente, das "pegadas" por eles deixadas ao entrar em
contato com o sistema imunitário: os anticorpos e os linfócitos. Como tanto os
anticorpos como os linfócitos sensibilizados apresentam especificidade para o agente
infeccioso que os induziu, a presença desses componentes do sistema imunitário indica
infecção.
Os testes de imunodiagnóstico são utilizados: (1) para o diagnóstico de doenças
infecciosas, (2) para a detecção de anticorpos contra componentes do organismo nos
casos suspeitos de doenças autoimunes (ex.: anti-ADN no lupus eritematoso e anti-
tireoglobulina nas tireoidites autoimunes), (3) para a detecção de anticorpos contra
alérgenos nas doenças alérgicas, (4) para o diagnóstico de gravidez e (5) para detectar
antígenos de células tumorais ou os anticorpos por eles induzidos.

3. Princípios e métodos de imunodiagnóstico

Os testes de imunodiagnóstico baseiam-se no principio da especificidade da
resposta imunitária: para se detectar anticorpos (ex. contra o vírus do sarampo) ou
linfócitos (ex.: teste intradérmico com tuberculina) utilizam-se como reagentes
antígenos ou seus componentes, enquanto que, para se detectar antígenos (ex.:
tireoglobulina), são usados anticorpos específicos.
 2

Os métodos de imunodiagnóstico podem ser divididos em (1) sorológicos,

testes in vitro que detectam a presença de anticorpos ou antígenos no soro (e em
outros líquidos orgânicos) e (2) cutâneos, são testes in vivo que detectam a presença
de linfócitos T (hipersensibilidade tardia ou ‘retardada’), ou de anticorpos da classe IgE
sensibilizando mastócitos (hipersensibilidade precoce ou ‘imediata’). São vários os
métodos para a realização dos testes sorológicos: precipitação, floculação, aglutinação,
imunofluorescência, testes imunoenzimáticos e radioimunoensaios. Cada método
apresenta características, aplicações e limitações próprias.

4. Interpretação dos testes de imunodiagnóstico

Dois importantes critérios para a escolha de um método de imunodiagnóstico
são sua sensibilidade e sua especificidade. Um método será tanto mais sensível
quanto menor a concentração de anticorpos (ou antígeno) for capaz de detectar.
Quanto menos sensível o teste, maior a probabilidade de deixar de detectar anticorpos
(ou antígenos) em baixas concentrações e, conseqüentemente, maior será a
probabilidade de obtenção de resultados negativos falsos (ver Tabela 41-1). A
sensibilidade de um teste de imunodiagnóstico depende do método utilizado, da
afinidade do anticorpo e da densidade e distribuição dos epítopos do antígeno. Existem
métodos muito sensíveis, como os imunoenzimáticos, capazes de detectar
concentrações de anticorpos tão pequenas quanto 0,0001µ g/mL, e outros menos
sensíveis como os de precipitação, que só detectam anticorpos quando em
concentrações superiores a 10µ g/mL. Assim, os testes imunoenzimáticos são, em
geral, 100.000 vezes mais sensíveis que os testes de precipitação (Tabela 41-2). Em
algumas circunstâncias, a baixa sensibilidade constitui uma vantagem, como acontece
com o teste do látex para a detecção de fator reumatóide (IgM anti-IgG), usado para o
diagnóstico de artrite reumatóide. Embora esta não seja a única doença que cursa com
aumento de auto-anticorpos IgM anti-IgG, é onde se observam as maiores
concentrações. Assim, a utilização de um método pouco sensível como a aglutinação,
que só detecta concentrações relativamente elevadas de anticorpos, de certa maneira
facilita a distinção entre artrite reumatóide e as outras condições onde ocorre aumento
de fator reumatóide.
Além da baixa sensibilidade do teste, outras circunstâncias podem causar
resultados negativos falsos:
(1) Período de ‘janela imunológica’: tempo decorrido entre a infecção e o
aparecimento de reação sorológica ou de teste intradérmico positivos. Neste período,
os antígenos do agente infeccioso são processados por células apresentadoras de
antígenos, acoplados a proteínas do complexo principal de histocompatibilidade,
apresentados para linfócitos T, que são ativados, concorrendo, por sua vez, para ativar
os linfócitos B, que proliferam, se diferenciam em plasmócitos e produzem anticorpos.
A ‘janela imunológica’ pode variar de 10 a 14 dias, na maioria das infecções, até três
meses, como na infecção pelo vírus da imunodeficiência humana. Neste período, o
indivíduo está infectado, muitas vezes com alto potencial de transmissão, mas os
testes de imunodiagnóstico estão negativos.
(2) Fenômeno de pró-zona: altas concentrações de anticorpos podem impedir
o aparecimento de reações positivas em testes de precipitação e de aglutinação.
(3) Falhas técnicas: reagentes fora do prazo de validade; inativação dos
anticorpos ou de reagentes por calor, ácidos ou bases; não utilização de controle
positivo; erros de identificação e de procedimento; injeção profunda (subcutânea) nos
testes intradérmicos, o que aumenta a absorção do antígeno; aumento da drenagem
linfática dérmica, o que também aumenta a absorção dos antígenos empregados nos
testes intradérmicos, como ocorre na gestação e na exposição excessiva ao sol; tecido
 3

cutâneo frouxo, como acontece com os recém-nascidos e os idosos, o que dificulta a

localização do antígeno nos testes intradérmicos.
Os antígenos utilizados nas técnicas de imunodiagnóstico para a detecção de
anticorpos variam muito em sua complexidade e grau de pureza. Podem ser desde
pequenas seqüências peptídicas, até componentes bacterianos completos, formados
por múltiplos antígenos. Quanto mais simples e puro for o antígeno, maior será a
especificidade da técnica, pois haverá menor probabilidade de que ocorram reações
cruzadas com outros antígenos e, em conseqüência, menor ocorrência de resultados
positivos falsos (ver Tabela 41-1). Diferentemente da sensibilidade que depende do
método de imunodiagnóstico empregado, a especificidade depende das características
do antígeno.

Além da baixa especificidade do teste, outras situações podem causar

resultados positivos falsos:
(1) Vacinação prévia: tanto os testes sorológicos como os intradérmicos podem
ser positivados por vacinação prévia. Algumas vacinas (ex,: contra o sarampo), podem
manter uma reação sorológica positiva por décadas.
(2) Administração de soros hiperimunes ou imunoglobulinas: os anticorpos
transferidos por soros hiperimunes ou imunoglobulinas podem falsear testes
sorológicos. Cerca de três meses após a administração, os níveis de anticorpos voltam
ao normal.
(3) Transferência placentária de anticorpos: anticorpos da classe IgG são
passivamente transferidos da mãe para o feto, fazendo que o recém-nascido apresente
reações sorológicas positivas falsas por 6 a 12 meses.
(4) Falhas técnicas: erros de identificação e de procedimento; não utilização de
controle negativo.

Como os agentes infecciosos compartilham seqüências antigênicas entre si,

determinado antígeno utilizado em um teste de imunodiagnóstico pode apresentar
reatividade cruzada com anticorpos induzidos por outros agentes infecciosos. A
ocorrência dessas reações cruzadas pode dificultar a interpretação dos testes de
imunodiagnóstico. Entretanto, o teste apresentará sempre títulos mais elevados na
presença de anticorpos específicos para o antígeno, que para anticorpos decorrentes
de reatividade cruzada. Há, portanto, necessidade de se estabelecer pontos-de-corte
(“cut-off”) para cada técnica, ou seja, os títulos (ou outra medida de quantificação) a
partir dos quais os resultados positivos indicam a presença de anticorpos específicos.
Por exemplo, títulos de 20 ou de 40 em um teste cujo ponto-de-corte é 80, indicam
reatividade cruzada e não apresentam significado diagnóstico. Cada nova técnica, ou
técnica já estabelecida usando um novo antígeno, tem que ter seu ponto-de-corte
determinado, para permitir a correta interpretação dos resultados. Isto é feito a partir do
teste de um número suficientemente grande de amostras de soro de um grupo de
indivíduos que sabidamente não tiveram contato com o agente infeccioso que se quer
diagnosticar. O ponto-de-corte será calculado com base na média dos resultados
obtidos desses indivíduos negativos, mais dois desvios-padrão. Por exemplo, para
determinar o ponto-de-corte de um novo teste imunoenzimático para a detecção de
anticorpos anti-plasmódio foram testados 100 amostras de soro de indivíduos que
nunca estiveram em área de transmissão de malária. A densidade óptica média foi de
0,100 e o desvio-padrão foi 0,050. Assim, o ponto-de-corte será 0,200 (0,100 + 2x
0,050). Ou seja, os indivíduos que apresentarem testes com valores de 0,200, ou mais,
serão considerados positivos.
 4

O valor preditivo de um teste de imunodiagnóstico indica seu grau de precisão

e depende da sensibilidade e especificidade do método utilizado. A sensibilidade mede
a percentagem de indivíduos com teste positivo em uma população sabidamente
positiva, enquanto a especificidade indica a percentagem de indivíduos com teste
negativo em uma população sabidamente negativa. O valor preditivo do método será
tanto melhor quanto mais se aproximar de 100% sua sensibilidade e especificidade. A
Tabela 41-1 apresenta as diferentes possibilidades de resultados: positivos verdadeiros
(resultados positivos em indivíduos positivos), negativos verdadeiros (resultados
negativos em indivíduos negativos), positivos falsos (resultados positivos em indivíduos
em que a condição, patológica ou fisiológica, está ausente) e negativos falsos
(resultados negativos em indivíduos em que a condição está presente).

Sensibilidade, especificidade e valor preditivo dos testes de imunodiagnóstico.

__________________________________________________________
teste condição presente condição ausente
__________________________________________________________

positivo positivo verdadeiro (PV) positivo falso (PF)

negativo negativo falso (NF) negativo verdadeiro (NV)

___________________________________________________________

VP NV
sensibilidade = especificidade=
VP + NF NV + PF

Sensibilidade de diferentes testes de imunodiagnóstico

Teste Sensibilidade* (µ g anticorpo /mL)
______________________________________________________________________
Métodos de precipitação
Imunodifusão radial 10-50
Imunodifusão dupla 20-200
Imunoeletroforese em fuso 2
Imunofluorescência 1
Citometria de fluxo 0,06-0,006
Métodos de aglutinação
Aglutinação direta 0,3
Aglutinação passiva 0,006-0,06
Inibição da aglutinação 0,006-0,06
Radioimunoensaio 0,0006-0,006
Testes imunoenzimáticos <0,0001-0,01
* Quanto menor a concentração de anticorpo detectado, maior a sensibilidade.
A sensibilidade depende da técnica, da afinidade do anticorpo e da densidade e distribuição
de epítopos no antígeno.

Os testes de imunodiagnóstico são geralmente quantitativos ou

semiquantitativos, isto é, dão uma idéia da quantidade de anticorpos ou de antígenos
no material testado (soro, plasma, líquor, leite, etc). Uma das maneiras de tornar
quantificável um teste de imunodiagnóstico é realizá-lo com diferentes diluições do
soro. Os resultados são expressos pelo título, que representa a recíproca da máxima
diluição em que a reação é detectada. Por exemplo, uma reação de imunofluorescência
para detectar IgG contra toxoplasma foi realizada com soro diluído a 1/100, 1/400,
 5

1/1600 e 1/6400 (razão 4) e a reação positiva foi detectada até a terceira diluição.
Neste caso, o título da reação será de 1600. Pode-se também utilizar técnicas
quantitativas sem a necessidade de diluição do soro, como acontece nos testes
imunoenzimáticos, em que existe uma relação entre a quantidade de anticorpo (ou de
antígeno) e a densidade óptica, definida através de espectrofotometria.

A detecção de anticorpos por um teste de imunodiagnóstico, mesmo em altos

títulos, não significa que o indivíduo esteja imune. Indica somente contato, presente ou
passado, com o antígeno. Para se poder afirmar que determinado teste positivo
corresponde a uma infecção atual ou recente é necessário detectar-se elevação do
título de anticorpos da classe IgM, já que esta imunoglobulina é a que aparece mais
precocemente após o contato com o antígeno (ex.: agente infeccioso) e a que mais
cedo desaparece da circulação após cessado o estímulo antigênico, devido à sua curta
meia vida. Títulos elevados de IgG ocorrem mais tardiamente depois do contato com o
agente infeccioso e podem permanecer positivos por anos após a cura. Pelo fato de
atravessar a placenta, anticorpos da classe IgG podem passar para o feto e causar
reações positivas falsas. Assim, a presença em um recém-nascido de anticorpos IgG
anti-VIH não indica que ele esteja infectado pelo vírus da imunodeficiência humana.
Entretanto, tal limitação não se aplica a anticorpos da classe IgM que, em condições
normais, não atravessam a placenta. A presença desses anticorpos no recém-nascido
indica infecção congênita.

Outro método para se verificar se a presença de anticorpos indica infecção atual

ou passada consiste em coletar-se amostras pareadas de soro com, pelo menos, três
semanas de intervalo. A elevação do título de anticorpos de quatro vezes ou mais na
segunda amostra de soro (ex.: de 8 para 64) indica infecção atual, desde que testada
nas mesmas condições da primeira amostra.

5. O que sabemos, o que pensamos que sabemos e o que não sabemos

sobre imunodiagnóstico:

O que sabemos atualmente sobre imunodiagnóstico: (1) Existe uma grande

variedade de métodos e técnicas que permitem o diagnóstico de um grande número de
infecções, condições alérgicas, doenças autoimunes e tumores; (2) Os métodos de
imunodiagnóstico podem detectar, e muitas vezes quantificar, antígenos, anticorpos ou
linfócitos específicos; (3) Especificidade e sensibilidade são duas características
importantes dos testes de imunodiagnóstico. Em princípio, quanto maior a
especificidade e a sensibilidade, mais confiável serão seus resultados. Entretanto, isto
nem sempre é verdadeiro: o alto grau de sensibilidade pode comprometer a
especificidade, como acontece com os testes imunoenzimáticos; (4) Os testes de
imunodiagnóstico são muitas vezes o principal, às vezes o único, meio de diagnóstico
de algumas doenças. Para se evitar erros diagnósticos, que podem ser fatais, um
cuidado extremo deve ser exercido na realização e interpretação dos testes.
O que pensamos que sabemos sobre imunodiagnóstico: (1) O entendimento
da natureza da resposta imunitária medida pelo método de imunodiagnóstico: o que se
detecta (ou quantifica) representa um dos componentes da resposta (ex.: anticorpo de
determinada classe e afinidade dirigido contra um ou alguns dos antígenos utilizados
no teste, que geralmente representa parte dos componentes antigênicos do agente
infeccioso) e que apresenta determinada dinâmica, ou seja, varia na unidade de tempo;
(2) A correta interpretação dos resultados dos testes. O que se espera de um teste de
imunodiagnóstico é que ele indique, com segurança, a presença de determinada
 6

condição patológica (ex.: uma infecção). Entretanto, um teste positivo pode indicar uma
resposta residual a um agente infeccioso, que não mais está presente no organismo
(‘cicatriz imunológica’), ou pode decorrer de reação cruzada com outro agente
infeccioso. Por outro lado, um teste negativo indica ausência de contato com o agente
infeccioso, mas pode também ocorrer na presença de infecção recente, que ainda não
desencadeou uma resposta mensurável do sistema imunitário, e pode ainda decorrer
da negativação da resposta imunitária pela presença de uma condição concomitante
(ex.: imunodepressão pelo vírus da imunodeficiência humana).
O que não sabemos sobre imunodiagnóstico: (1) Sua aplicação para o
diagnóstico de todas as doenças. Existem muitas condições patológicas em que os
testes de imunodiagnóstico não são empregados, seja porque existem métodos mais
adequados de diagnóstico, seja porque ainda não se conseguiu padronizar um teste de
imunodiagnóstico confiável; (2) O verdadeiro significado de um teste positivo. Embora
algumas vezes possa indicar proteção (ex.: anticorpos contra os vírus da rubéola e do
sarampo), outras vezes possa indicar prognóstico (ex.: testes intradérmicos com
tuberculina – reação de Mantoux – ou com lepromina – teste de Mitsuda), um teste de
imunodiagnóstico positivo geralmente só pode ser tomado como um indicativo do
contato prévio ou atual com determinado material antigênico (ex.: agente infeccioso,
vacina, alérgeno).

6. Perspectivas
Existe uma tendência para se adotar métodos de imunodiagnóstico cada vez
mais sensíveis, como a imunofluorescência quantitativa e os testes imunoenzimáticos.
Mesmo métodos sensíveis como os radioimunoensaios estão também sendo
substituídos por esses métodos, que não apresentam o inconveniente de se utilizar
substâncias radioativas. Alguns testes deverão continuar em uso, por sua praticidade,
apesar da baixa sensibilidade como os testes de aglutinação direta para tipagem de
grupos sangüíneos (ABO e Rh), teste de Coombs para detecção de anticorpos anti-
eritrócitos e para detecção de anticorpos contra alguns microrganismos.
O rápido desenvolvimento de técnicas de biologia molecular baseadas
principalmente na reação em cadeia da polimerase (PCR) e a popularização de seu
uso em laboratórios de medicina laboratorial tem ampliado os recursos de diagnóstico
de infecções através da detecção do próprio agente infeccioso, com a vantagem sobre
as técnicas de imunodiagnóstico de apresentar altíssima especificidade, capaz de
distinguir sub-espécies ou variantes de microrganismos.

7. Referências bibliográficas
1. Herzenberg LA. Weir’s Handbook of Experimental Immunology, 5th ed, Blackwell Scientific
Publications, 1996
2. Rose NR, de Macário EC, Folds JD, Lane CH, Nakamura RM. Manual of Clinical Laboratory
Immunology. American Society of Microbiology, Washington, DC, 1997
3. Stites DP, Rodgers C, Folds JD, Schmitz J. Clinical laboratory detection of antigens and
antibodies. In Medical Immunology, 9th ed, DP Stites, AI Terr, TG Parslow (eds) Appelton &
Lange, Stanford, CT
4. Virella G. Introduction to Medical Immunology, 4th ed, Marcel Dekker, New York, 1998