Estudo que detecta a presença de anticorpos no sangue

A sorologia é um conceito utilizado especialmente no campo da medicina que se refere

a um exame de laboratório efetuado para comprovar a presença de anticorpos no
sangue, ou seja, determinar concretamente sua presença. É justamente através da
extração de sangue no paciente que, em seguida, sua mostra é analisada para determinar
de maneira eficiente a presença ou não de bactérias no organismo.

EXAME SOROLÓGICO: CONHEÇA OS

SEUS BENEFÍCIOS
Home » Clientes » Exame sorológico: conheça os seus benefícios

O exame sorológico é baseado na sorologia, um conceito utilizado especialmente

no campo da medicina que se refere a um exame de laboratório efetuado para
comprovar a presença de anticorpos no sangue, ou seja, determinar
concretamente sua presença.
O exame sorológico também pode ser usado para identificar a presença (ou
revela a ausência) de anticorpos relacionados a um patógeno no sangue do
paciente e a presença do próprio patógeno (vírus, bactéria, protozoário, etc).
O exame também pode ser usado para o:

 Diagnóstico de doenças autoimunes: a doença celíaca, por exemplo, que tem entre
suas características a intolerância ao glúten.
 Diagnóstico de deficiências imunológicas: a Amaglobulinemia ligada ao cromossomo X
(doença de Bruton).

O que é Sorologia?
Sorologia é o estudo do líquido separado do sangue após coagulação do mesmo.
O exame sorológico tem o objetivo de identificar dois tipos de moléculas: a IgM
e a IgG.
A IgM é a molécula que é formada rapidamente no corpo logo após o primeiro
contato com uma infecção.
É através dessa molécula, formada perfeitamente para aquela determinada
infecção, que o corpo organiza o ataque inicial para combatê-la.
 Essa molécula tem como característica ter uma vida curta, assim não dura muito
tempo no corpo.
A IgG é uma molécula que demora mais tempo para ser formada, e ela é
responsável pelo impedimento da re-infecção.
Funciona como soldados especializados no reconhecimento e combate, dessa
forma impedido que uma nova infecção, caso o agente causador entre em contato
com o corpo.

Quando devo realizar o exame

sorológico?
Os exames sorológicos estão se tornando cada vez mais refinados e com uma
execução simples.
Mas, para garantir a qualidade dos resultados são necessários rigorosos controles
e cuidadosa interpretação.
Além disso, os exames sorológicos são utilizados com sucesso na pesquisa de
anticorpos.
Se tornando auxiliares importantes em processos que visam um diagnóstico
individual e de pesquisa epidemiológica.

Indicações para a realização do exame

sorológico
O principal uso do exame sorológico é para indicar se o organismo já teve
contato com algum dos determinados agente infecciosos:

 vírus HIV (causador da AIDS);

 arbovírus do gênero Flavivirus (causador da Dengue);
 vírus RNA do gênero Lyssavirus (causador da Raiva);
 vírus HSV-2 do tipo 2 (causador da Herpes Simples);
 protozoários parasitas do gênero Leishmania (causadores da Leishmaniose);
 protozoário Toxoplasma gondii (causador da Toxoplasmose).

IgG negativo (não reagente) e IgM negativo (não reagente): indicam que o
paciente nunca entrou em contato com o agente patogênico (agente causador da
doença), ou seja, nunca foi nem vacinado nem contaminado.
IgG negativo (não reagente) e IgM positivo (reagente): indicam infecção aguda
(ou seja, iniciada há dias ou semanas).
IgG positivo (reagente) e IgM negativo (não reagente): indicam infecção antiga
(com meses ou anos) ou que a pessoa foi vacinada e o organismo teve sucesso
na produção de anticorpos.
 IgG positivo (reagente) e IgM positivo (reagente): infecção recente (semanas ou
meses)

Exemplo de exame sorológico: o

exame para diagnóstico de dengue
Como a dengue possui muitos sintomas em comum com outras doenças, o exame
sorológico é um bem-vindo auxílio ao diagnóstico.
Segundo o laboratório Instituto Goiano de Oncologia e Hematologia, o jejum antes
do exame não é obrigatório.
O exame sorológico detecta anticorpos IgM em 93% dos indivíduos com entre 6 e
10 dias de doença e em 99% dos indivíduos com entre 10 e 20 dias de doença.
Entre as causas mais comuns de falsos-negativos, pode ser mencionada a coleta
precoce de sangue, antes que os anticorpos tenham sido produzidos.
A Imunoglobulina G é menos específica, sendo a maior a possibilidade de que
apareçam (pessoas que tiveram contato com outros flavivus, como o da febre
amarela) falsos-positivos.

O exame sorológico identifica

infecções e doenças
O exame sorológico é fundamental para saber o modo como o organismo de um
paciente pode reagir diante de uma infecção ou se há algum agente patogênico.
Caso seja comprovada uma infecção, os agentes patogênicos estimulam a
geração de anticorpos e após o exame de sangue poderá ser identificado esses
agentes.
Sem dúvidas, hoje em dia, a sorologia se destaca como um excelente e fiel
método na hora de detectar doenças infecciosas como o vírus da:

 Aids;
 Hepatite;
 Rubéola;
 Toxoplasmose;
 Sarampo e entre outros.

E dessa forma, a sorologia ajuda a prevenir o contágio dessas doenças às

pessoas próximas ou do seu entorno.
 O exame sorológico identifica a AIDS.
Por que isto é importante?
A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS, em inglês e SIDA, em
português), foi descoberta há 31 anos no Centro de Controle de Doenças de
Atlanta, nos Estados Unidos.
Atualmente, aproximadamente 34 milhões de pessoas vivem com o vírus HIV em
todo o mundo.
São dois milhões de novas infecções por ano e mais de um milhão de mortes
anuais. Causador da Aids, o vírus HIV ataca o sistema imunológico, responsável
por defender o organismo.
Segundo o UNAIDS (Programa Conjunto das Nações Unidas sobre HIV/Aids:

 34,2 milhões de pessoas vivem com HIV no mundo. Desses, 30,7 milhões são adultos;
16,7 milhões são mulheres e 3,4 milhões têm idade menor a 15 anos.
 2,5 milhões de novas infecções foram notificadas em 2011. Sendo 2,2 milhões em adultos
e 330 mil em adolescentes menores de 15 anos.

Após esses anos, a medicina laboratorial e as pesquisas no combate e a

prevenção da AIDS avançaram em todo o mundo.
Os laboratórios de análises clínicas possuem um papel fundamental nesse
cenário, pois o avanço das técnicas dos testes sorológicos permitiu a identificação
mais rápida do vírus HIV.
A janela imunológica, período logo após a infecção cujos testes são falso-
negativos, reduziu de seis meses para poucas semanas.
Há ainda a possibilidade de se realizar a contagem de partículas virais para o
diagnóstico e avaliação de resposta ao tratamento, explica o médico infectologista
e responsável pela assessoria científica de infectologia no Hermes Pardini,
Guenael Freire.
Nas últimas décadas o exame sorológico para HIV evoluiu muito.
Assim os testes de sorologia são muito importantes, pois o diagnóstico precoce
aumenta as chances do paciente viver por muitos anos com vírus.

Um estudo que também previne

Primeiramente, ao detectar que uma pessoa padece de AIDS, a mesma pode
começar um tratamento para ajudá-la a reduzir os sintomas e curar a doença.
Mas também precisa tomar as devidas precauções para evitar o contágio da
doença às pessoas mais próximas.
O diagnóstico precoce da infecção pelo HIV muda drasticamente a evolução da
doença, pois permite o tratamento precoce.
 Assim, os pacientes tratados no momento adequado não são propensos às
doenças oportunistas e podem ter uma vida absolutamente normal.

Principais dúvidas sobre o exame

sorológico
Nós do Hermes Pardini, separamos a seguir as 03 principais dúvidas sobre o
exame sorológico que chegam até nós. Elas são:

01. Para que serve, Detecta DST? E se der

positivo?

A Sorologia se refere ao estudo do soro sanguíneo, na prática, dedicando-se

especialmente à identificação de anticorpos no sangue.
De modo geral, exames sorológicos são realizados para verificar a presença de
dois anticorpos:

 Imunoglobulina M (IgM), o maior anticorpo e o primeiro a ser produzido quando o

organismo é exposto pela primeira vez a um antígeno (elemento capaz de desencadear a
produção de anticorpo específico), e
 Imunoglobulina G (IgG), que é o tipo mais comum de anticorpo no sangue, é mais
específico e serve para proteger o organismo de futuras infecções causadas pelo
antígeno.

02. Como é feito o exame sorológico?

Como em qualquer outro exame de sangue, começa-se com a extração de

sangue do paciente através de uma agulha.
Esse sangue é, então, colocado em um frasco esterilizado. O exame pode ser feito
no sangue desse jeito ou no soro, que é obtido após a coagulação e centrifugação
do sangue.

03. Como é realizado o exame sorológico?

O exame sorológico é realizado por meio de exame de sangue. Por esse motivo
é necessário que o paciente esteja em jejum de 8 horas antes da punção venosa.
O procedimento pode ser feito totalmente pelo sangue ou então pelo soro
sanguíneo.
Enquanto isso, neste último caso, o sangue é obtido após sua coagulação e
centrifugação para eliminar as células de reação.
O exame sorológico é realizado como qualquer outro de sangue, a enfermeira
coloca uma faixa elástica no braço do paciente e com uma agulha se extrai o
sangue de alguma veia do corpo.
Em conclusão, este sangue é depositado em um frasco esterilizado.

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a navegaçãoSaltar para a pesquisa

Serologia ou sorologia é o estudo científico do soro sanguíneo. Na prática, o termo se
refere ao diagnóstico e identificação de anticorpos e antígenos no soro.
Conhecem-se atualmente numerosas características sanguíneas que são hereditárias. O
estudo da sua variação em relação à repartição geográfica, à sobrevivência num dado
ambiente e à patologia tem contribuído grandemente para a moderna antropologia física
 Pontos Principais:
 A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica para
fazer muitas cópias de uma região específica do DNA, in vitro (em um
tubo de ensaio, ao invés de um organismo).
 A PCR depende de uma DNA polimerase termoestável, a Taq
polimerase, e requer primers de DNA projetados especificamente
para a região de interesse do DNA .
 Na PCR, a reação é repetida ciclicamente através de uma série de
alterações de temperatura, o que possibilita a produção de muitas
cópias da região de interesse.
 A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é
rotineiramente usada em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e
análises forenses de DNA.

O que é PCR?
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de
laboratório usada para fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de
uma região específica do DNA. Essa região do DNA pode ser
qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver
um gene cuja função o pesquisador queira compreender ou um
marcador genético usado pelos cientistas forenses para correlacionar o
DNA da cena do crime com os suspeitos.

Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da

região de interesse do DNA, de modo que essa possa ser analisada e
utilizada de alguma outra maneira. Por exemplo, DNA amplificado
por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado
por eletroforese em gel, ou clonado em plasmídeo para futuros
experimentos.
A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo
pesquisa em biologia molecular, diagnósticos médicos e mesmo
alguns ramos da ecologia.

Taq polimerase
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer
uma enzima DNA polimerase que faça novas fitas de DNA usando as
existentes como moldes. A DNA polimerase tipicamente usada na
PCR é chamada de Taqpolimerase, em homenagem à bactéria
resistente ao calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).

T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA

polimerase é bastante estável ao calor e é mais ativa
à 70°C (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de E.
coli seriam disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq
polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a alta temperatura é
usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é,
separar suas fitas.

Primers de PCR
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar
DNA somente quando lhe é dado um primer, uma sequência curta de
nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a síntese de DNA.
Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA
que será copiada, ou amplificada, pelos primers que ela ou ele
escolher.

Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples,

geralmente por volta de 202020 aminoácidos de comprimento. Dois
primers são usados para cada reação de PCR, e eles são projetados de
modo que englobem a região de interesse (região que deve ser
copiada). Isto é, são dadas sequências que os farão se ligar a fitas
opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região a ser
copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases
complementares.

DNA molde:

5' TATCAGATCCATGGAGT...GAGTACTAGTCCTATGAGT 3' 3'

ATAGTCTAGGTACCTCA...CTCATGATCAGGATACTCA 5'

Primer 1: 5' CAGATCCATGG 3' Primer 2:

Quando os primers são ligados ao molde, eles podem ser estendidos

pela polimerase, e a região que está entre eles será copiada.
[Diagrama mais detalhado mostrando a direcionalidade do DNA e do primer]
 As etapas da PCR
Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase,
primers, DNA molde e nucleotídeos (blocos que compõem o DNA).
Os ingredientes são reunidos em um tubo, juntamente com cofatores
de que a enzima precisa, e passam por repetidos ciclos de aquecimento
e resfriamento que permitem que o DNA seja sintetizado.

As etapas básicas são:

1. Desnaturação (96°C): Aquece fortemente a reação para separar, ou

desnaturar, as fitas de DNA. Isso proporciona um molde de fita
simples para a próxima etapa.
2. Anelamento (555555 - 656565°C): Resfria a reação para que os
primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA
molde de fita simples.
3. Extensão (72°C): Eleva a temperatura da reação para que
a Taqpolimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA.
Este ciclo se repete 252525 - 353535 vezes em uma reação típica de
PCR, que geralmente ocorre em 222 - 444 horas, dependendo do
comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação for
eficiente (funcionar bem), a região de interesse pode gerar de uma ou
poucas cópias até bilhões.

Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde
a cada vez. Ao invés, o novo DNA feito em uma rodada pode servir de
molde na próxima rodada de síntese de DNA. Há muitas cópias dos
primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação,
então o número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar
a cada rodada do ciclo. Esse padrão de crescimento exponencial é
mostrado na imagem abaixo.
Uso da eletroforese em gel para visualizar
os resultados da PCR
Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados
(tornam-se visíveis) através do uso da eletroforese em
gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA
são puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e
que separa os fragmentos de DNA de acordo com o tamanho. Um
padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho
dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.

Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no

gel, que pode ser vista a olho nu se o gel for pigmentado com um
corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de PCR
produzindo um fragmento de 400400400pares de bases (pb)
apareceria desta maneira no gel:
Coluna esquerda: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400,
500 pb.
 Coluna direita: resultado da reação PCR, uma banda em 400pb.

Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de

interesse do DNA, não apenas uma ou algumas cópias. Como o DNA
é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes que
possamos vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a
PCR ser uma ferramenta importante: ela produz cópias suficientes de
uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou manipular
aquela região de DNA.

Aplicações da PCR
Através da PCR, uma sequência de DNA pode ser amplificada
milhões ou bilhões de vezes, produzindo cópias suficientes de DNA
para serem analisadas por outras técnicas. Por exemplo, o DNA pode
ser visualizado por eletroforese em gel, enviado para sequenciamento,
ou digerido por enzimas de restrição eclonado em um plasmídeo.

A PCR é usada em muitos laboratórios de pesquisa e também tem

aplicações práticas em ciências forenses, testes genéticos e
diagnósticos. Por exemplo, a PCR é utilizada para amplificar genes
associados a desordens genéticas a partir do DNA de pacientes (ou do
DNA fetal, nos casos de teste pré-natal). A PCR também pode ser
utilizada para testar se há DNA bacteriano ou viral no corpo de um
paciente: se o patógeno estiver presente, pode ser possível amplificar
regiões de seu DNA a partir de uma amostra de sangue ou tecido.
Amostra-problema: A PCR nas ciências
forenses
Suponha que você esteja trabalhando em um laboratório de ciências
forenses. Você acabou de receber uma amostra de DNA de um cabelo
deixado em uma cena de crime, juntamente com amostras de DNA de
três possíveis suspeitos. Seu trabalho é examinar um marcador
genético em particular e verificar se algum dos três suspeitos coincide
com o DNA do cabelo para esse marcador.

O marcador vem em dois alelos, ou versões. Um deles contém uma

única repetição (região marrom abaixo), enquanto o outro contém
duas cópias da repetição. Em uma reação PCR com primers que atuam
na região de repetição, o primeiro alelo produz um fragmento de DNA
de 200200200 \text{bp}bpb, p, enquanto o segundo produz um
fragmento de DNA de 300300300 \text{bp}bpb, p:

Marcador do alelo 1: primers que atuam na região de repetição

amplificam um fragmento de DNA de 200 pb
 Marcador do alelo 2: primers que atuam na região de repetição
amplificam um fragmento de DNA de 300 pb

Você faz uma PCR nas quatro amostras de DNA e visualiza os

resultados por eletroforese em gel, como representado abaixo:
 O gel tem cinco faixas:

Primeira faixa: Escada de DNA com bandas de 100, 200, 300, 400, e
500 pb.

Segunda faixa: DNA da

A Reação em cadeia da polimerase - RCP [1] ou Polymerase Chain Reaction -

PCR[2] é uma técnica utilizada na biologia molecular para amplificar uma única cópia
ou algumas cópias de um segmento de DNA em várias ordens de grandeza, gerando
milhares a milhões de cópias de uma determinada sequência de DNA.
Desenvolvido em 1983 por Kary Mullis, que era um funcionário da Cetus Corporation,
e também o vencedor do Prêmio Nobel de Química em 1993 junto com Michael
Smith[3], é uma maneira fácil, barata e confiável de replicar repetidamente um segmento
específico de DNA, um conceito aplicável a vários campos da biologia moderna e das
ciências relacionadas. O PCR é provavelmente a técnica mais utilizada na biologia
molecular. Esta técnica é utilizada na pesquisa biomédica, na forense criminal e na
arqueologia molecular.
O PCR é agora uma técnica comum e frequentemente indispensável usada em
laboratórios clínicos e de pesquisa para uma ampla variedade de aplicações. [5] [6]
Estes incluem a clonagem de DNA para sequenciação, clonagem e manipulação de
genes, mutagênese de genes; construção de filogenias baseadas em DNA, ou análise
funcional de genes; diagnóstico e monitoramento de doenças hereditárias; amplificação
do DNA antigo; [4] análise de impressões digitais genéticas para o perfil de DNA (por
exemplo, na ciência forense e teste de parentesco); e detecção de patógenos em testes de
ácido nucleico para o diagnóstico de doenças infecciosas.
A grande maioria dos métodos de PCR dependem do ciclo térmico, o que envolve a
exposição dos reagentes a ciclos de aquecimento e resfriamento repetidos, permitindo
diferentes reações dependentes da temperatura - especificamente, a fusão do DNA e a
replicação de DNA orientada por enzimas - para prosseguir rapidamente várias vezes
em sequência. Os iniciadores (fragmentos de DNA curtos) que contêm sequências
complementares à região alvo, juntamente com uma polimerase de DNA (por exemplo,
Taq polimerase), após o qual o método é designado, permitem amplificação seletiva e
repetida. À medida que o PCR progride, o DNA gerado é usado como um modelo para
replicação, colocando em movimento uma reação em cadeia na qual o modelo de DNA
original é amplificado exponencialmente. A simplicidade do princípio básico subjacente
à PCR significa que pode ser amplamente modificada para realizar uma ampla gama de
manipulações genéticas. O PCR não é geralmente considerado um método de DNA
recombinante, pois não envolve cortar e colar DNA, apenas amplificação de seqüências
existentes.
Quase todas as aplicações de PCR empregam uma polimerase de DNA estável ao calor,
como a polimerase Taq, uma enzima originalmente isolada da bactéria termofílica
Thermus aquaticus. Se a DNA polimerase sensível ao calor for utilizada, ela irá
desnaturar todos os ciclos no passo de desnaturação. Antes do uso da Taq polimerase, a
DNA polimerase teve que ser adicionada manualmente a cada ciclo, que era um
processo tedioso e dispendioso. [5] Esta DNA polimerase monta enzimaticamente uma
nova cadeia de DNA a partir de nucleotídeos livres, os blocos de construção de DNA,
usando DNA de cadeia simples como molde e oligonucleótidos de DNA (os iniciadores
mencionados acima) para iniciar a síntese de DNA.
O PCR, como a tecnologia de DNA recombinante, teve um enorme impacto [6] nos
aspectos básicos e diagnósticos da biologia molecular porque pode produzir grandes
quantidades de um fragmento de DNA específico a partir de pequenas quantidades de
um modelo complexo. As técnicas de DNA recombinante criam clones moleculares ao
conferir a uma sequência específica a capacidade de replicar inserindo-a em um vetor e
introduzindo o vetor em uma célula hospedeira. O PCR representa uma forma de
"clonagem in vitro" que pode gerar, bem como modificar, fragmentos de DNA de
comprimento definido e seqüência em uma simples reação automatizada. Além de suas
muitas aplicações na pesquisa biológica molecular básica, o PCR promete desempenhar
um papel crítico na identificação de seqüências médicamente importantes, bem como
um diagnóstico importante na sua detecção.

Princípios[editar | editar código-fonte]

O PCR amplifica uma região específica de uma cadeia de DNA (o alvo de DNA). A
maioria dos métodos de PCR amplifica os fragmentos de DNA entre 0,1 e 10 quilos de
base (kbp), embora algumas técnicas permitam a amplificação de fragmentos de até
40 kbp de tamanho. A quantidade de produto amplificado é determinada pelos
substratos disponíveis na reação, que se tornam limitantes à medida que a reação
progride. [7]
Uma configuração básica de PCR requer vários componentes e
reagentes, [8] incluindo:

 um modelo de DNA que contém a região alvo de DNA para amplificar

 uma polimerase de DNA, uma enzima que polimeriza novas cadeias de DNA; A
polimerase Taq resistente ao calor é especialmente comum,[9] , pois é mais
provável que permaneça intacto durante o processo de desnaturação de DNA de
alta temperatura

 dois iniciadores de DNA que são complementares das extremidades 3 '(três

primeiras) de cada uma das cadeias sentido e anti-sentido do alvo de DNA (a
polimerase de DNA só pode se ligar e alongar-se a partir de uma região de DNA
de cadeia dupla, sem primers lá não é um local de iniciação de cadeia dupla no
qual a polimerase pode se ligar); iniciadores específicos que são complementares
da região alvo do DNA são selecionados de antemão e são geralmente feitos sob
encomenda em um laboratório ou comprados de fornecedores bioquímicos
comerciais

 desoxinucleósido trifosfatos ou dNTPs (às vezes denominados "desoxinucleótidos

trifosfatos", nucleotídeos contendo grupos trifosfato), os blocos de construção a
partir dos quais a DNA polimerase sintetiza uma nova cadeia de DNA
 uma solução tampão que fornece um ambiente químico adequado para uma
atividade ótima e estabilidade da DNA polimerase

 catiões bivalentes, tipicamente íons de magnésio (Mg) ou manganês (Mn); Mg2 +

é o mais comum, mas Mn2 + pode ser usado para mutagênese de DNA mediada
por PCR, uma vez que uma maior concentração de Mn2 + aumenta a taxa de erro
durante a síntese de DNA

 catiões monovalentes, tipicamente iões de potássio (K)

A reação é comumente realizada em um volume de 10-200 μl em pequenos tubos de
reação (volumes de 0,2-0,5 ml) em um termociclador. O termociclador aquece e esfria
os tubos de reação para atingir as temperaturas exigidas em cada passo da reação.
Muitos cicladores térmicos modernos utilizam o efeito Peltier, que permite o
aquecimento e o resfriamento do bloco que contém os tubos de PCR simplesmente
invando a corrente elétrica. Os tubos de reação de paredes finas permitem uma
condutividade térmica favorável para permitir o equilíbrio térmico rápido. A maioria dos
termostatos têm tampas aquecidas para evitar a condensação no topo do tubo de
reação. Os termocicladores mais antigos que não possuem uma tampa aquecida
requerem uma camada de óleo em cima da mistura de reação ou uma bola de cera
dentro do tubo.

Fases do PCR[editar | editar código-fonte]

Normalmente, a PCR consiste em uma série de 20–40 mudanças de temperatura
repetidas, chamadas ciclos, com cada ciclo geralmente consistindo em duas ou três
etapas de temperatura discretas (veja a figura abaixo). O ciclismo é muitas vezes
precedido por um único passo de temperatura a uma temperatura muito alta (> 90 °C)
e seguido por uma retenção no final para a extensão final do produto ou
armazenamento breve. As temperaturas utilizadas e o período de tempo aplicado em
cada ciclo dependem de uma variedade de parâmetros, incluindo a enzima utilizada
para a síntese de DNA, a concentração de íons bivalentes e dNTPs na reação e a
temperatura de fusão (Tm) dos primers . [10]
As etapas individuais comuns à maioria dos métodos de PCR são as seguintes:

1. Inicialização: este passo é necessário apenas para polimerases de DNA que

requerem ativação de calor por PCR de inicialização a quente. [11] Consiste em
aquecer a câmara de reação a uma temperatura de 94–96 °C, ou 98 °C, se
forem utilizadas polimerases extremamente termostáticas, que é então
mantida durante 1-10 minutos.
2. Desnaturação: Este passo é o primeiro evento regular dos ciclos e consiste em
aquecer a câmara de reação a 94–98 °C por 20 a 30 segundos. Isso faz com
que a fusão do DNA, ou a desnaturação, do modelo de DNA de cadeia dupla
rompa as ligações de hidrogênio entre bases complementares, produzindo
duas moléculas de DNA de cadeia simples.
3. Anelamento: no próximo passo, a temperatura de reação é reduzida para 50-65
°C durante 20-40 segundos, permitindo o anelamento dos iniciadores para
cada um dos modelos de DNA de cadeia simples. Dois iniciadores diferentes
são tipicamente incluídos na mistura de reação: um para cada um dos dois
complementos de cadeia simples contendo a região alvo. Os primers são
sequências de cadeia simples, mas são muito menores do que o comprimento
da região alvo, complementando apenas sequências muito pequenas na
extremidade 3 'de cada vertente. É fundamental determinar uma temperatura
adequada para o passo de recozimento porque a eficiência e a especificidade
são fortemente afetadas pela temperatura de recozimento. Esta temperatura
 deve ser suficientemente baixa para permitir a hibridação do iniciador à cadeia,
mas suficientemente alta para que a hibridação seja específica, isto é, o
iniciador deve unir-se apenas a uma parte perfeitamente complementar da
corda e em nenhum outro lugar. Se a temperatura for muito baixa, o iniciador
pode se ligar de forma imperfeita. Se for muito alto, o iniciador pode não se
ligar. Uma temperatura de recozimento típica é de cerca de 3–5 °C abaixo da
Tm dos iniciadores utilizados. As ligações estáveis de hidrogênio entre bases
complementares são formadas apenas quando a sequência iniciadora se
aproxima muito da sequência do modelo. Durante este passo, a polimerase se
liga ao híbrido molde-iniciador e começa a formação de DNA.
4. Extensão / alongamento: a temperatura neste passo depende da DNA
polimerase utilizada; a temperatura de atividade ideal para a polimerase de
DNA termoestável da polimerase Taq (Thermus aquaticus) é de
aproximadamente 75–80 °C, [12] [13], embora uma temperatura de 72 °C seja
comumente usado com esta enzima. Neste passo, a DNA polimerase sintetiza
uma nova cadeia de DNA complementar à cadeia de matriz de DNA por
adição de dNTPs livres a partir da mistura de reação que são complementares
ao modelo na direção 5' a 3', condensando o grupo 5'-fosfato dos dNTPs com
o grupo 3'-hidroxi no final da cadeia de DNA nascente (alongada). O tempo
preciso necessário para o alongamento depende tanto da polimerase de DNA
utilizada quanto do comprimento da região alvo de DNA para amplificar. Como
regra geral, na sua temperatura ideal, a maioria das polimerases de DNA
polimerizam mil bases por minuto. Em condições ideais (isto é, se não houver
limitações devido a substratos ou reagentes limitantes), em cada etapa de
extensão / alongamento, o número de sequências alvo de DNA é duplicado.
Com cada ciclo sucessivo, os fios originais do modelo mais todas as vertentes
recém-geradas tornam-se fios de modelo para a próxima rodada de
alongamento, levando a amplificação exponencial (geométrica) da região
específica do alvo de DNA.
Os processos de desnaturação, anelamento e alongamento constituem um único ciclo.
São necessários vários ciclos para amplificar o alvo de DNA para milhões de cópias. A
fórmula usada para calcular o número de cópias de DNA formadas após um
determinado número de ciclos é 2n, onde n é o número de ciclos. Assim, um conjunto
de reação para 30 ciclos resulta em 230, ou 1.073.741.824 cópias da região original do
alvo de cadeia dupla.
Alongamento final: Este único passo é opcional, mas é realizado a uma temperatura
de 70–74 °C (a faixa de temperatura necessária para a atividade ideal da maioria das
polimerases utilizadas na PCR) durante 5–15 minutos após o último ciclo de PCR para
garantir que qualquer DNA de cadeia simples restante seja completamente alongado.
Suporte final: o passo final arrefece a câmara de reação a 4–15 °C por tempo
indeterminado e pode ser empregado para o armazenamento a curto prazo dos
produtos de PCR.
Aplicações[editar | editar código-fonte]
A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA
disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das
principais aplicações da PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de
DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo que contenham bulbo, gotas
de sangue ou saliva, pedaços de pelo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA
deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo
método de impressão digital genética. A PCR também é rotineiramente utilizada em
procedimentos científicos de biologia molecular como amplificação para gerar
mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para
clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizada
para identificação de patógenos que estão presentes em amostras, como por exemplo
a identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do
papiloma humano e seus genótipos, HIV Vírus da Hepatite B. etc A PCR também é
utilizada na paleontologia para o sequenciamento gênico de animais pré-históricos.
Também é muito utilizada na identificação de micro-organismos, tendo em vista que
apenas 1% dos micro-organismos são cultiváveis e podendo ser isolados. A PCR é o
primeiro passo para o posterior sequenciamento. Após obter as sequências geradas
pelos equipamentos, pode-se consultar bases de dados na internet para tentar
localizar suas possíveis origens, sendo bactérias, archeas ou etc.Elizabeth van Pelt-Verkuil, Alex van
Belkum, John P. Hays
Procedimentos[editar | editar código-fonte]

Oito tubos de PCR, cada tubo contendo 100μl.

A reação em cadeia da polimerase é um método muito sensível de análise e por isso é

realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou
tornar errôneo o resultado. O processo consiste basicamente em utilizar os
mecanismos da replicação in vitro. Os cientistas então simplificaram ao máximo o
processo de polimerização das moléculas. A maquinaria para separar as fitas sense e
anti-sense são muito complexas na célula, no lugar utiliza-se a mudança de
temperatura. Os ciclos são pensados para disponibilizar o sitio alvo para a ligação dos
primers, funcionamento da polimerase e início de um novo ciclo.Bruce A. White Em primeiro
lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado
(exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é
o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é um
desdobramento da PCR e possui outras aplicações.

Resultado da PCR após ser realizada uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.

Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como
pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases
nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers (também chamados de
oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima Taq-polimerase em uma solução tampão.
Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-
estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser
amplificado).Ralph Rapley
Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo
para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das
pontes de hidrogênio). Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C
dependendo da quantidade de citosina (C) e guanina (G) encontrada no primer, para
que os primers se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento). Na
última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa
funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é
iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a

taxa de replicação é exponencial

O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou
de poliacrilamida e depois é interpretado com a ajuda de um profissional competente.
Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel,
assim poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado

Bibliografia[editar | editar código-fonte]

1. ↑ Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K.

B. Mullis, e H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA
with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239 (1988): 487-
491. PubMed
2. ↑ United States Patent 5,656,493 Mullis, et al. August 12, 1997: System for
automated performance of the polymerase chain reaction, Patente Número
- US 5656493
3. ↑ Elizabeth van Pelt-Verkuil, Alex van Belkum, John P. Hays, Principles and
Technical Aspects of PCR Amplification , Springer Science & Business
Media, 2008 ISBN 1-402-06241-9 (em inglês)
4. ↑ School of Public Health University of California Eva Harris Faculty,
Berkeley, A Low-Cost Approach to PCR : Appropriate Transfer of
Biomolecular Techniques: Appropriate Transfer of Biomolecular Techniques ,
Oxford University Press, 1998 , ISBN 0-198-02801-6 (em inglês)
5. ↑ Bruce A. White, PCR Protocols: Current Methods and Applications, Springer
Science & Business Media, 1993, ISBN 1-592-59502-2 (em inglês)
6. ↑ Ralph Rapley, PCR Sequencing Protocols, Humana Press, 1996 ISBN 0-
896-03344-9 (em inglês)

Ligações externas

Coloração diferencial é um termo geral que pode se refrir a um número variado de

processos específicos. Geralmente, é usado para descrever processos de coloração os
quais usam mais que um corante. Usando-se múltiplos corantes pode-se diferenciar entre
diferentes microorganismos ou estruturas e componentes delulares de um mesmo
organismo ou de suas diferentes células.
Coloração diferencial também descreve processos médicos usados para detectar
anormalidades na proporção de diferentes células no sangue. O processo ou resultados
são chamados um diferencial "WBC" (do inglês white blood cells). Este teste é útil porque
muitas doenças alteram a proporção de certas células brancas do sangue (leucócitos). Por
análise destas diferenças em combinação com exame clínico e outros testes de
laboratório, profissionais de medicina podem diagnosticar doenças.
Um comumente reconhecível uso de coloração diferencial é a coloração de Gram.[1] A
coloração de Gram usa dois corantes: violeta cristal e fucsina básica (o corante de
contraste) para diferenciar entre bactérias Gram positivas (grande camada
de peptidoglicanosobre outras superfícies da célula) e bactérias Gram negativas. Técnicas
mais complexas e adequadas de colorações diferenciais, em conjunto com outras
técnicas, são usadas para identificar microorganismos patogênicos como por exemplo o
da lepra ou o da tuberculose

Colorações diferenciais‐ exigem a aplicação de mais do que um corante e, por

vezes de outros reagentes. Permitem evidenciar estruturas celulares (cápsula,
esporos, flagelos, núcleo, etc.) ou classificar as bactérias em grupos (coloração
de Gram e coloração de álcool).

A Coloração de Gram permite classificar as bactérias em Gram positivas (

possuem grossa camada de peptidoglicanose a parede celular não possui lípidos
ou o seu teor é baixo) e Gram negativas(parede celular destas bactérias possuem
um elevado teor em lípidos na membrana externa e uma camada muito fina de
peptidoglicanos que circunda a membrana plasmática) tendo como base a
diferente estrutura da parede celular.

Procedimento da actividade laboratorial

10. Preparar e fixar esfregaço a partir da suspensão de E. coli e

B.subtilis seguindo as indicações dadas de 1 a 6.
11. Colocar a lâmina sobre um suporte e inundar com solução
de Cristal Violeta e deixar actuar durante um minuto.

12. Lavar com água como indicado em 8 e escorrer em papel absorvente.

13. Inundar o esfregaço com solução de Lugol e deixar actuar durante 1 minuto.

14. Lavar com água como indicado em 8 e escorrer em papel absorvente

15. Descorar com álcool etílico a 96% durante 30 segundos, agitando suavemente.

16. Lavar com água como indicado em 8 e escorrer em papel absorvente

17. Corar com solução de Safranina durante 30 segundos.

18. Lavar com água como indicado em 8 e escorrer em papel absorvente

19. Observar ao microscópio com a objectiva de imersão.

o ao Player Audima. Clique TAB para navegar entre os botões, ou aperte CONTROL PONTO
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de leitura. ALT VÍRGULA para desacelerar a velocidade de leitura.Play!Ouça este
conteúdo0:00AudimaAbrir menu de opções do player Audima.

É chamado de coloração de Gram o método de coloração utilizado

para diferenciar espécies bacterianas em dois grupos, bactérias
gram-positivas e gram-negativas. Entre os fatores que irão
diferenciar gram-positivos de gram-negativos, está a coloração
das bactérias, a composição e propriedades químicas e físicas das
paredes celulares.

Outro método de diferenciação é a detecção de quantidade de

peptídeoglicano nas bactérias gram-positivas e nas bactérias gram-
negativas. As bactérias gram-positivas serão azul violeta, enquanto
as gram-negativas serão vermelhas.

A estrutura que as bactérias irão apresentar é outro aspecto que

pode ser levado em consideração para diferenciar as bactérias gram-
positivas das gram-negativas.

O método de coloração de Gram é considerado um dos mais

importantes dentro dos laboratórios de análises clínicas e
microbiologia. Em laboratórios de análises clínicas, por exemplo, a
técnica é essencial para obtenção de resultados. As bactérias são
caracterizadas como gram-positivas ou gram-negativas em
esfregaços de pus ou fluídos orgânicos, permitindo que o profissional
do laboratório possa monitorar as infecções.

A técnica de coloração Gram em análises clínicas é usada

principalmente para identificar preliminarmente a morfologia das
bactérias ou para estabelecer se há um número significativo de
bactérias nas amostras clínicas.

Apesar da resposta positiva obtida com os resultados das técnicas de

coloração de Gram, outros métodos de identificação bacteriana
devem ser utilizados para que o resultado seja o menos controverso
possível.

Vale ressaltar que algumas bactérias não se coram ou coram-se

fracamente.

Materiais
Lâminas para microscopia; óleo de imersão; lamínulas; microscópio; alça de platina;
bico de Bunsen; tubo contendo solução com água esterilizada e corante: cristal de
violeta.

Bactérias gram-positiva: lugol

 Estafilococcus aureus - Safranina

 Staphylococcus saprophyticus - Álcool 95%

Bactéria gram-negativa: gaze

 Escherichia coli - Pisseta água destilada

Procedimentos
1. Em uma lâmina, contendo esfregaço seco, cubra-o pingando gotas de violeta-de-metila
e deixe agir por 15 segundos;
2. Adicione água ao esfregaço, em cima do violeta-de-metila, cobrindo toda a lâmina.
Deixe agir por mais 45 segundos;
3. Após o tempo corrido, escorra o corante e lave o esfregaço em um filete de água
corrente. Cubra a lâmina com lugol ou Iodo de Gram e deixe por 60 segundos;
4. Escorra todo o lugol e lave em um filete de água corrente;
5. Aplique álcool etílico a 95%, ou acetona, para descorar a lâmina por 10 a 20 segundos;
6. Lave em um filete de água corrente;
7. Cubra toda a lâmina com safarina e deixe corar por aproximadamente 30 segundos;
8. Lave a lâmina em um filete de água;
9. Seque a lâmina com auxílio de um papel de filtro limpo ou deixe-a secar ao ar livre;
10. Aplique uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observe no microscópico
com objetiva de imersão (100 X).

A técnica que consiste na coloração das bactérias apresenta diagnóstico clínico correto
em 80% dos testes realizados, levando em consideração a simplicidade e velocidade da
técnica, o número é extremamente positivo. Essa técnica ainda possui baixo custo e
instalações simples.

Curiosidades
O método de coloração de Gram existe há mais de um século. Foi desenvolvida em
1884 por Hans Gram.

Referências Bibliográficas:
http://www.provida.ind.br/site/index.php/bacterias/bacterias/122-tecnica-de-
gram.htmlm
https://en.wikipedia.org/wiki/Gram_staining
http://www.biomedicinabrasil.com/2011/06/coloracao-de-gram.html
http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/microscopy/gramstain.html

Arquivado em: Bioquímica, Microbiologia

Materiais
Lâminas para microscopia; óleo de imersão; lamínulas; microscópio; alça de platina;
bico de Bunsen; tubo contendo solução com água esterilizada e corante: cristal de
violeta.

Bactérias gram-positiva: lugol

  Estafilococcus aureus - Safranina
 Staphylococcus saprophyticus - Álcool 95%

Bactéria gram-negativa: gaze

 Escherichia coli - Pisseta água destilada

Procedimentos
1. Em uma lâmina, contendo esfregaço seco, cubra-o pingando gotas de violeta-de-metila
e deixe agir por 15 segundos;
2. Adicione água ao esfregaço, em cima do violeta-de-metila, cobrindo toda a lâmina.
Deixe agir por mais 45 segundos;
3. Após o tempo corrido, escorra o corante e lave o esfregaço em um filete de água
corrente. Cubra a lâmina com lugol ou Iodo de Gram e deixe por 60 segundos;
4. Escorra todo o lugol e lave em um filete de água corrente;
5. Aplique álcool etílico a 95%, ou acetona, para descorar a lâmina por 10 a 20 segundos;
6. Lave em um filete de água corrente;
7. Cubra toda a lâmina com safarina e deixe corar por aproximadamente 30 segundos;
8. Lave a lâmina em um filete de água;
9. Seque a lâmina com auxílio de um papel de filtro limpo ou deixe-a secar ao ar livre;
10. Aplique uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço e observe no microscópico
com objetiva de imersão (100 X).

A técnica que consiste na coloração das bactérias apresenta diagnóstico clínico correto
em 80% dos testes realizados, levando em consideração a simplicidade e velocidade da
técnica, o número é extremamente positivo. Essa técnica ainda possui baixo custo e
instalações simples.

Curiosidades
O método de coloração de Gram existe há mais de um século. Foi desenvolvida em
1884 por Hans Gram.

Referências Bibliográficas:
http://www.provida.ind.br/site/index.php/bacterias/bacterias/122-tecnica-de-
gram.htmlm
https://en.wikipedia.org/wiki/Gram_staining
http://www.biomedicinabrasil.com/2011/06/coloracao-de-gram.html
http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/microscopy/gramstain.html

Arquivado em: Bioquímica, Microbiologia

Membrana Celular Retículo endoplasmático

Citoplasma Lisossoma

Mitocôndria

Complexo de Golgi

Ribossomo

Núcleo

Centríolos

Vesícula Dobra temporária de membrana celular

Microbiologia Básicae-Tec Brasil 24

Todas as células se compõem de duas regiões internas principais

conhecidas como núcleo e citoplasma. O núcleo, que é circundado
pelo citoplasma, contém todas as informações genéticas do
organismo, sendo responsável pela hereditariedade. O citoplasma é a
sede primária dos processos de síntese e o centro das atividades
funcionais em geral.

Em algumas células, o núcleo é circundado por uma membrana

denominada de membrana nuclear ou carioteca. Compreendem o
grupo das eucarióticas, os protozoários, os fungos, a maior parte das
algas. Estas células se assemelham as dos animais e plantas. Em
contraste, as bactérias e o pequeno grupo de algas azul-verdes se
caracterizam por células menores procarióticas por não apresentarem
membrana nuclear.

Nas plantas e microrganismos, a parede celular é a única estrutura

limitante. Seu único papel parece ser o de proteção contra injúrias
mecânicas e impedem, principalmente, a ruptura osmótica quando a
célula é colocada em ambiente com alto teor de água. Veja a Figura
2.1 a seguir.

Figura 2.1: Estrutura esquemática de uma célula