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I. INTRODUO
O significado da palavra fermentao sofreu, durante os dois ltimos sculos,
muitas alteraes. Originalmente aplicada ao processo pelo qual o vinho e outras
bebidas alcolicas eram obtidas, significava uma efervescncia ou ebulio lenta.
Mais tarde, devido s investigaes de Gay-Lussac e de outros, a palavra fermentao
associou-se ao processo pelo qual o "acar" (glucose) era convertida em lcool
(etlico) e dixido de carbono, ou seja o processo que hoje designamos por
fermentao alcolica.
Actualmente, fermentao um termo bastante geral e implica a degradao
anaerbia de um substrato. Pode assim ser definida como um processo metablico
(catablico) que ocorre na ausncia de oxignio e, no qual, atravs de uma srie de
reaces de oxi-reduo, hidrlise e outras, os enzimas existentes em determinado
organismo/tecido levam a cabo a modificao qumica de um substrato (metabolito),
formando-se outros compostos como produtos finais dessas reaces sequenciais (ou
vias), como por exemplo etanol, cidos carboxlicos, dixido de carbono, etc. Nos
vrios organismos, particularmente nos microbianos, existem numerosas vias
fermentativas, cada uma delas dando origem a um produto(s) final(is) especfico(s).
Entre as mais relevantes salientam-se duas vias, ambas tendo o piruvato como
metabolito inicial: a fermentao alcolica em clulas de levedura e a fermentao
lctica (ou homolctica) no tecido muscular de animais, originando respectivamente
etanol e lactato.
Embora o estudo da sequncia da via de fermentao alcolica tenha sido iniciado
h cerca de dois sculos com Lavoisier, s em 1951 Embden, Meyerhof e Parnas
integram todos os conhecimentos at ento adquiridos, propondo um esquema
conjunto (Fig. 1) para as transformaes sofridas anaerobiamente pela glucose
(gliclise) nas leveduras e no msculo.
Bioqumica II
Fosforilase
1-Fosfato de glucose
D-glucose
Frutose
Hexocinase
Fosfatase
Hexocinase
Fosfatase
6-Fosfato de glucose
6-Fosfato de frutose
1,6-Difosfato de frutose
Aldolase
Fosfato de dihidroxicetona
Isomerase
3-Fosfato de D-gliceraldedo
-+ H 2
+
- H 3P O 4
1,3-Difosfato de D-gliceraldedo
H 3P O 4
1-Fosfato de D-gliceraldedo
2-Fosfato de D-gliceraldedo
+
- H 2O
cido lctico
Piruvato
Enolase
Fosfato de enolpiruvato
Acetaldedo + CO2
-+ H 2
Etanol
Figura 1 - Esquema proposto por Embden, Meyerhof e Parnas para a gliclise incluindo a
fermentao alcolica e lctica.
Bioqumica II
Neste trabalho pretende-se demonstrar a formao de intermedirios metablicos piruvato e acetaldedo - durante a fermentao da glucose pela levedura. Uma vez que
tanto o piruvato como o acetaldedo s esto presentes em pequenas quantidades nesta
via, dado que se transformam rapidamente no intermedirio seguinte, uma maneira de
demonstrar a sua existncia impedir a reaco seguinte de prosseguir, levando assim
sua acumulao. Para isso vo ser usadas duas estratgias:
1. Para detectar o piruvato, leva-se a cabo a incubao das clulas de levedura na
presena de glucose sob condies ligeiramente alcalinas, as quais inactivam o
enzima piruvato descarboxilase (na nomenclatura dos enzimas: 2-oxocido
carboxilase, E.C. 4.1.1.1.), que catalisa o passo seguinte da via, conduzindo
assim acumulao daquele composto. A sua presena posteriormente
duplamente demonstrada pelas reaces com o nitroprussiato (colorao azul) e
com a 2,4-dinitrofenilhidrazina (colorao vermelha).
2. A presena do acetaldedo posta em evidncia mediante a sua reaco com um
agente (sulfito de sdio), adicionado mistura de incubao, dando origem a um
composto que j no metabolizado por no servir de substrato ao enzima
lcool desidrogenase. O acetaldedo presente ser ento identificado atravs da
sua reaco com o nitroprussiato de sdio na presena de piperidina, dando uma
caracterstica cor azul.
B) FORMAO DO PIRUVATO
1. Pipete 5 ml de soluo de glucose 100 g/l para cada um de dois tubos de
centrfuga (A e B)
2. Adicione 5 ml da suspenso de levedura ligeiramente cida ao tubo A e 5 ml da
suspenso de levedura ligeiramente alcalina ao tubo B.
3. Coloque ambos os tubos (A e B) num banho termostatizado a 37 C durante 1
hora.
4. Aps a incubao, adicione 2 ml de cido tricloroactico (100 g/l) a cada tubo.
Agite.
5. Centrifugue durante 10 min. a 2 500 g.
6. Remova os sobrenadantes para tubos de ensaio (tambm identificados com A e B)
Bioqumica II
III. CONCLUSES
Interprete o aparecimento de cor nos tubos A1 e B1, A2 e B2, e C e D, explicando
esquematicamente as reaces ocorridas.
Bioqumica II
Bioqumica II
B) EXTRACO DO GLICOGNIO
1. Pese o fgado completo. Pese aproximadamente 15 g de fgado (tome nota do peso
rigoroso) e corte-o em pedaos pequenos com uma tesoura. Coloque-os num
homogenizador contendo gua (1 ml por grama de tecido). Use gua destilada
gelada de preferncia.
2. Homogenize o fgado tendo o cuidado de no deixar elevar muito a temperatura
3. Transfira o homogenizado para um gobelet e aguarde cerca de 5 min. agitando
frequentemente com uma vareta de vidro
4. Adicione um volume igual de TCA a 20 % (a soluo resultante ficar a 10 %)
5. Transfira o conjunto para um tubo de centrfuga e centrifugue durante cerca de 8
min.
6. Decante o sobrenadante para uma proveta, adicione dois volumes de etanol a
pouco e pouco, agitando sempre com a vareta de vidro.
7. Deixe repousar at que se forme um precipitado (se no observar precipitao
junte um pouco de cloreto de sdio slido e aquea o tubo suavemente colocandoo num gobelet com gua quente at se formar um precipitado).
8. Transfira a suspenso para tubos de centrfuga. Equilibre-os e centrifugue o
conjunto durante cerca de 5 min.
9. Despreze o lquido sobrenadante e dissolva o precipitado em cerca de 5 ml de
gua e reprecipite o glicognio pela adio de 10 ml de etanol
10. Separe de novo o precipitado por centrifugao e lave-o no tubo de centrfuga com
3 ml de ter, agitando o resduo com uma vareta de vidro. Centrifugue novamente
11. Pese o precipitado
Nota: a quantidade de glicognio existente no fgado depende grandemente do estado
nutricional do animal. possvel, portanto, que em certos casos, tais como jejum
prolongado, aquela quantidade seja to pequena que no se chegue a observar
precipitado.
Bioqumica II
C) HIDRLISE DO GLICOGNIO
1. Numere 8 tubos de ensaio de 1 a 8
2. Adicione ao tubo n 1, que servir de branco, 0,5 ml de gua destilada
3. Adicione aos restantes tubos 0,5 ml da soluo de glicognio
4. Junte a cada tubo 0,5 ml de HCl 2,5 N e tome nota da hora a que se verificou a
adio
5. Junte imediatamente aos tubos 1 e 2, 1 ml de NaOH 1,25 N e coloque os tubos de
3 a 8 num banho-maria em ebulio
6. Com intervalos de 5 min. retire os tubos 3 a 7 do banho-maria e neutralize o
contedo de cada um adicionando 1 ml de NaOH 1,25 N
7. Aps o tubo n 8 ter estado no banho-maria 60 min., retire-o e adicione 1 ml de
NaOH 1,25 N
8. Junte a todos os 8 tubos, 2 ml da soluo de 3,5-dinitrosalicilato e aquea todos os
tubos no banho-maria durante 5 min.
9. Arrefea os tubos com gua fria e junte a cada um 6 ml de gua destilada. Agite
10. Leia no espectrofotmetro as absorvncias a 540 nm usando como branco o tubo
n 1
Bioqumica II
DE
cerevisiae
I. INTRODUO
O ltimo passo do metabolismo aerbio, a fosforilao oxidativa, permite a sntese
de ATP a partir de um gradiente quimiosmtico de protes formados durante a
passagem de electres atravs da cadeia de transferncia de electres. O citocromo c
o componente mais conhecido desta cadeia e o mais estudado, por diversas razes:
CH
CH 3
Cys
S
H3C
CH
N
CH3
Fe3+
N
N
H 3C
CH 3
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2
COO -
COO -
a)
Bioqumica II
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B) PROCEDIMENTO
12. Suspender 1 kg de fermento de padeiro, previamente desfeito no maior nmero de
pedaos possvel em 250 ml de acetato de etilo e 500 ml de uma soluo de NaCl
1 M, adicionados por esta ordem. Deixar a agitar, no frio, at manh seguinte.
13. Retirar a suspenso do agitador e adicionar cerca de 3,5 litros de gua destilada.
Juntar em seguida 100 ml de resina CMC-32, previamente inchada em gua e
agitar a mistura durante cerca de 30-45 min. Deixar depositar a resina a qual em
seguida decantada e lavada sucessivamente com Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 at que
o sobrenadante fique lmpido. Colocar numa coluna de cromatografia (10 cm 5
cm), previamente montada, a resina preparada anteriormente. Proceder eluio
do citocromo com tampo Tris-HCl 1 M, pH 7,6.
Bioqumica II
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Preparao do gel
1. Remover os Ready Gel da embalagem de acondicionamento.
2. Retirar o pente e lavar os poos com gua destilada ou tampo de electroforese.
3. Cortar com o auxlio de uma lmina a cassete do Ready Gel (em baixo ao longo da
linha a ponteado).
4. Puxar a fita existente na parte debaixo da cassete de modo a expor o fim do gel.
5. Colocar a cassete no Electrode Assembly. Encaixar primeiro a parte debaixo do
gel nas reentrncias existentes de cada lado e em baixo do Electrode Assembly.
Colocar a cassete de modo que o vidro pequeno fique virado para o interior do
Electrode Assembly.
Bioqumica II
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6. Como se vai correr dois gis no necessrio colocar um vidro do outro lado do
Electrode Assembly.
7. Colocar o Electrode Assembly com a cassete do Ready Gel no Clamping Frame.
Este dispositivo permite manter o Electrode Assembly com o Ready Gel num
sistema fechado.
8. Pressionar o Electrode Assembly para baixo, enquanto fecha os dois clips, situados
na parte debaixo do Clamping Frame. Ao conjunto constitudo pelo Electrode
Assembly (com os gis colocados) e Clamping Frame designa-se de Inner
Chamber.
9. Colocar o Inner Chamber na tina de electroforese para mini-gis.
10. Encher o Inner Chamber com tampo de electroforese (diludo 10 ). Verificar se
existem fugas.
11. Se no houver fugas colocar entre 200 a 300 ml de tampo de electroforese na tina
de electroforese. Caso existam fugas encher a tina de electroforese com o tampo
at cima (mais ou menos at ao nvel do tampo existente no Inner Chamber).
12. Verificar se no existem bolhas de ar no fundo do Inner Chamber. A existncia de
bolhas de ar perturba a migrao das protenas.
13. Aplicar 20 l de amostra em cada um dos poos com uma pipeta automtica. Cada
amostra deve ser aplicada devagar, de modo a permitir que a amostra assente no
fundo do poo. Ter o cuidado de no tocar com a ponta da pipeta no fundo do
poo de modo a evitar que este se rompa.
14. Colocar a tampa da tina de electroforese, tendo o cuidado de colocar as bananas
(uma preta e outra vermelha) a condizer com os elctrodos.
15. Ligar os fios elctricos da tina fonte de alimentao, tendo o cuidado de
assegurar a polaridade correcta das ligaes (banana vermelha no +; banana preta
no -).
16. Programar a fonte para 150 mV durante 10 min., ou at as amostras j se
encontrarem no topo do gel de resoluo (o gel de baixo). Aumentar a voltagem
para 160 mV e deixar correr at a frente de migrao das bandas estar a 5 - 10 mm
do fim do gel.
17. Aps a corrida do gel, desligar a fonte de alimentao e desligar os fios.
18. Retirar o Inner Chamber e verter o tampo. Desmontar o sistema de modo a
remover a cassete do Ready Gel.
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19. Remover o gel da cassete, separando os dois vidros. necessrio retirar a fita que
rodeia a cassete do Ready Gel.
20. Transferir o gel para a soluo corante. Deixar a corar num agitador para gis at
aparecerem as bandas (entre 30 a 45 min).
CuSO4.5H2O a 1 %
Tartarato
de
sdio
potssio
tetrahidratado a 1 %.
Reagente de Lowry C (preparar 100 ml)
Bioqumica II
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Construir uma recta padro para uma soluo de citocromo c de corao de cavalo
de concentrao 0,225 mg/ml, de acordo com os volumes indicados na tabela
seguinte:
Tubos
----
100
200
300
400
500
Vol (gua) l
500
400
300
200
100
----
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
2,5
500
500
500
500
500
500
Aps a adio do reagente C, agitar e esperar 10 min. Adicionar s depois os 0,5 ml de reagente de
Folin e ler aps 30 min. a absorvncia a 500 nm.
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NH3+
-OOCCH 2CH 2CHCOO-
NH3+
glutamato
CH3CCOOpir uvat o
glut amato
-OOCCH CH CHCOO2
2
O
+
-OOCCH CCOO2
Oxaloacetat o
NH3+
O
+
CH3CHCOO -
-cetoglut ar at o
alanina
O
Tr ansaminase oxaloactica
Fosfat o de pir idoxal
-OOCCH CH CCOO 2
2
NH3+
-OOCCH CHCOO 2
aspar t at o
17
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Abs 540 nm
Actividade enzimtica
(miliunidades)
0,025
0,050
0,075
0,100
0,125
0,150
0,175
0,200
2
5
9
12
16
20
24
29
19
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