Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Capitulo 3 Vol2 PDF
Capitulo 3 Vol2 PDF
Captulo 3
Tcnicas histolgicas
Luzia Ftima Gonalves Caputo
Lycia de Brito Gitirana
Pedro Paulo de Abreu Manso
Tcnicas Histolgicas | 91
Tcnicas Histolgicas | 93
B. Fixao
Tcnicas Histolgicas | 95
mercial.
Agentes oxidantes: tetrxido de smio, dicromato de potssio,
de zinco.
Combinao de reagentes: tetrxido de smio e glutaraldedo, tetrxido
pura polimerizada. Esses fixadores formam ligaes cruzadas com as protenas tissulares, tornando-as insolveis em forma de um gel.
Dentre os fixadores aldedos, o formaldedo comercial o mais usado
na rotina histolgica devido ao seu baixo custo financeiro, alm de ser de
fcil preparo. Contudo, algumas consideraes se fazem necessrias. O
formaldedo comercial, um gs incolor, comercialmente fornecido em soluo na concentrao de 37% ou 40%. Ao se preparar uma soluo base
de formaldedo comercial a 10%, de fato a soluo estar a 3,7% ou 4%;
apesar disso, convencionou-se chamar essa soluo de formalina, ou
formaldedo a 10%. Outro ponto importante a se mencionar que o
formaldedo, na presena de gua, encontra-se na sua forma monomrica. J
o paraformaldedo, por ser livre de metanol, muito utilizado para a fixao
de tecidos a serem analisados pela microscopia eletrnica, pois o metanol
pode ocasionar grandes prejuzos, interferindo nas anlises ultraestruturais.
Porm, o paraformaldedo comercial tem sido recomendado para anlise
imuno-histoqumica. Na realidade, o formaldedo contm polmeros de
paraformaldedo comercial, mas que s sero hidrolisados quando diludos
em gua.
Quando o formaldedo exposto luz, isto , ao oxignio atmosfrico e tecidual, ocorre a oxidao do formaldedo, formando cido frmico.
O cido frmico pode se precipitar nos tecidos sob a forma de um pigmento de colorao marrom, sendo considerado um artefato. Para se evitar a
formao desse precipitado, deve-se preparar o fixador em solues
tamponadas, ou, ento, adicionar carbonato de clcio (giz) para neutralizar a
ao do pH da soluo. Contudo, o giz s recomendado em ltimo caso,
pois poder deixar reas de pseudocalcificao tecidual.
A seguir, encontram-se alguns dos fixadores aldedos e suas principais caractersticas:
Tcnicas Histolgicas | 97
Formalina 10%
cido pcrico.
Seguir com o protocolo da colorao desejada.
Notas de biossegurana
Ao manipular formaldedo, ou solues contendo essa substncia, deve-se
fazer uso de luvas, mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local
arejado e com exausto. O preparo de solues fixadoras deve ser feito em
capela de exausto. Por serem muito volteis e sensveis luz, as solues
contendo formaldedo devem ser guardadas ao abrigo da luz em vidro mbar
firmemente fechado. O formaldedo txico quando ingerido, inalado ou em
contato com a pele. A inalao deste composto pode causar irritao nos
olhos, nas mucosas e no trato respiratrio superior. Em altas concentraes,
pode causar bronquite, pneumonia ou laringite. Este composto classificado
como carcinognico e teratognico. Nunca descarte solues contendo
formaldedo ou outras solues fixadoras em esgoto sanitrio convencional;
procure saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
Formol-salino
Formaldedo comercial........................................100 mL
gua destilada................................................900 mL
Cloreto de sdio...................................................9 g
Caractersticas:
soluo isotnica;
pode levar deposio de pigmento formalnico;
indicado para algumas reaes histoqumicas.
Tcnicas Histolgicas | 99
Formaldedo comercial........................................100 mL
lcool 95%...................................................900 mL
Caractersticas:
utilizada para a observao de minerais (cobre, magnsio, ferro
Formaldedo comercial........................................100 mL
gua destilada.................................................900 mL
Fosfato de sdio monobsico.....................................4 g
Fosfato de sdio dibsico.......................................6,5 g
Caractersticas:
soluo hipotnica (clulas intumescidas);
aproximadamente 165 mOsm;
pH 6,8;
indicada para clulas pancreticas, bactrias, alguns tipos de
carboidratos, clulas do tecido conjuntivo, fungos, minerais, tecido nervoso, pigmentos e glndulas.
Tempo de fixao: 24-72 horas.
Lavagem: gua corrente por 1 ou 2 horas.
AFA ou FAA lcool - formalina - cido actico:
carboidratos;
os lipdeos no so preservados;
misturar no momento do uso;
muito utilizado para fixar helmintos.
Vrios so os fatores que influenciam no processo da fixao, interferindo diretamente na preservao tecidual e, em ltima instncia, no tecido que
se deseja observar. Assim, deve-se analisar criteriosamente o protocolo de
fixao para identificar os fatores que podem influenciar diretamente na fixao
do tecido a ser analisado e consequentemente interferir na preservao tecidual.
Esses fatores so:
temperatura;
espessura do tecido;
penetrao;
tempo de fixao;
escolha do fixador;
relao volume do fixador tamanho do espcime;
estocagem apropriada;
pH do fixador;
osmolaridade da soluo fixadora;
adio de sais na mistura;
concentrao dos fixadores.
C. Clivagem
A clivagem consiste em reduzir as dimenses dos fragmentos dos tecidos coletados. Dependendo do tipo de fixador empregado, a clivagem poder ocorrer em at algumas horas aps a fixao. Na clivagem ideal, os fragmentos devem atingir cerca de 3 mm de espessura; porm, dependendo do tipo
de rgo, esse fragmento pode chegar a mais do que 5 mm (Figuras 1 e 2).
ser removida;
os fragmentos devem possuir preferencialmente 3 mm de espessura,
conveniente que, aps essa etapa, sejam novamente clivados com gilete, de modo que cada fragmento apresente uma superfcie lisa de corte
que servir no somente de orientao ao tcnico durante o processo
de incluso, mas tambm auxiliar a etapa subsequente, ao se desbastar
o bloco;
usar, no mnimo, vinte vezes o volume de fixador em relao ao
(Figuras 3 e 4).
Notas de biossegurana
Durante o procedimento de clivagem do material, tome muito cuidado com
as navalhas e giletes utilizadas. O material perfurocortante, bem como os
restos de material biolgico, devem ser descartados em lixo prprio.
2. Descalcificao
Aps a coleta o tecido, este deve ser fixado, lavado para retirar o
excesso de fixador e, s ento, submetido descalcificao.
A descalcificao pode ser realizada por mtodos qumicos e fsicos.
Os mtodos qumicos utilizam solues descalcificadoras em pH cido, solues quelantes e meios de troca inica. Os mtodos fsicos esto sempre
associados a descalcificao qumica, englobando a dissociao eletroltica e
submisso do material contido em solues descalcificadoras, ao ultrassom e s
micro-ondas, que aceleram o processo de descalcificao.
Descalcificao qumica
C. Mtodos histoqumicos
clcio (metal, ver tabela peridica) formando um metal quelado, por exemplo,
sequestrante ou versene (cido etilenediaminetetractico ou EDTA). Esse mtodo bem lento, sem dano ao tecido. Assim, como as misturas de tampes,
ele inativa a fosfatase alcalina, que reativada aps um banho de 2 a 6 horas
em soluo de cloreto de magnsio 6%. A descalcificao por agentes quelantes
no produz artefatos durante a maioria das coloraes histolgicas, diferente
da descalcificao por cidos, que gera artefatos quase irreversveis.
Descalcificao fsica
cias cidas.
Notas de biossegurana
Ao manipular solues cidas e agentes quelantes, deve-se fazer uso de luvas
especficas para manipulao qumica, de mscara com filtro prprio para
vapores cidos e orgnicos, e deve-se faz-lo em local arejado e com exausto.
O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto. Deve-se,
previamente, consultar as fichas de emergncia qumica das solues cidas e
quelantes antes da sua manipulao. A inalao destes compostos pode
causar irritao e queimaduras.
Nunca descarte solues cidas em esgoto sanitrio convencional, procure
saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
3. P
rocessamento
Processamento
Diversas substncias podem ser utilizadas como meio de incluso; porm, no processamento convencional, comumente se utiliza a parafina.
O processamento para incluso de material em parafina passa por trs
etapas: desidratao, clarificao e impregnao.
A. Desidratao
A desidratao consiste na remoo da gua dos tecidos, pois as substncias previamente utilizadas para incluso em parafina no se combinam
homogeneamente com a gua.
Vrios so os agentes desidratantes. A substncia utilizada na rotina
histolgica o lcool etlico, por produzir bons resultados e possuir baixo
custo. Contudo, outros agentes desidratantes tambm so eficientes, variando
apenas o tempo de desidratao.
B. Clarificao ou diafanizao
ao lcool;
realizar vrias trocas de lcool, pois a gua ser eliminada com o
lcool desprezado;
Clarificao
Apesar de as substncias diafanizadoras serem insolveis em gua e
solveis no lcool, que removido da pea durante a clarificao, deve-se
tomar algumas precaues:
agitar o frasco para melhorar a difuso (sada do lcool e
entrada do xilol); antigamente, esse procedimento seria reprovado, pois como o lcool menos denso do que a gua, ele
ficaria na superfcie do frasco e no estaria em contato com a
pea (Figura 8);
proceder, no mnimo, a duas trocas com a substncia clarificadora;
no deixar o material por muito tempo em xilol, pois ele resseca
Impregnao
A impregnao deve ser realizada em estufa a 60oC. Os fragmentos
sero transportados de uma parafina a outra em intervalos de tempo predeterminados. No se deve realizar somente uma passagem pela parafina, pois ser
insuficiente para remover todo o xilol dos tecidos. Contudo, recomenda-se
nunca deixar o material permanecer na parafina por muito tempo, pois como a
parafina somente lquida em temperatura alta, o calor em um longo perodo
de tempo poder causar grande dano ao tecido.
Figura 9. Processamento manual de tecidos.
Processamento automtico
Existem dois tipos de equipamentos automticos (processadores) acessveis no mercado e que so tambm chamados histotcnicos ou autotcnicos.
Um tipo de processador o carrossel (Figura 10), mais tradicional
e de baixo custo, no qual os cassetes contendo os fragmentos so colocados em uma cesta que transportada mecanicamente de forma a imergir os
cassetes em cada reagente. Outro tipo possui uma cmara fechada, na qual
Protocolos de processamento
Os protocolos de processamento variam de acordo com:
as dimenses dos fragmentos do material a ser processado;
tipo de reagentes utilizados;
tipo do espcime biolgico (material humano, de rato, de
Estgio
Reagente
Durao
Desidratao
lcool 70 %
1h
Desidratao
lcool 80 %
1h
Desidratao
lcool 90 %
1h
Desidratao
lcool 95 %
1h
Desidratao
lcool 100 %
1h
Desidratao
lcool 100%
1h
Desidratao
lcool 100%
1h
Desidratao
lcool 100%
1h
Clarificao
Xilol I
1h
10
Clarificao
Xilol II
1h
11
Impregnao
Parafina I
1h
12
Impregnao
Parafina II
2h
Notas de biossegurana
Todo material utilizado no processamento de tecidos altamente inflamvel.
Use luvas, jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos.
Durante a manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor
de xilol. Este elemento txico para as vias areas. Quando inalado por
tempo prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir
com espuma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol
mais pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior. No
descarte os resduos do processamento em esgoto sanitrio comum, procure
saber em sua instituio qual a poltica de descarte de substncias qumicas.
4. Incluso
clarificador (xilol);
aps a completa remoo da parafina, proceder remoo do xilol,
cassete.
Selecionar o molde a ser utilizado de acordo com as dimenses dos
bloco do molde.
Figura 16. Procedimento de incluso. Figura 17. Molde com material
que foi includo.
Para permitir a anlise dos tecidos ao microscpio de luz, eles devem ser
seccionados em fatias bem finas e uniformes. A espessura ideal varia de acordo
com o objetivo de estudo; recomenda-se a espessura de 4 a 6 mm na rotina
dos laboratrios.
O instrumento capaz de confeccionar cortes com tal preciso o
micrtomo (Figura 18), sendo constitudo por trs partes: corpo, porta-bloco
e porta-objeto. Considera-se, ainda, que em alguns modelos possua duas
manivelas, uma manivela de ajuste e outra de corte.
Existem dois tipos de micrtomos: do tipo rotatrio, tambm conhecido como do tipo Minot, em que o material, no porta-objeto, vai de
encontro navalha que est imvel no porta-navalha; e o do tipo corredia,
que avana o porta-navalha e vai de encontro ao porta-objeto onde se
encontra a amostra.
Encontram-se venda no mercado diversos modelos dos dois tipos de
micrtomo, podendo ser automticos ou manuais. Muitos micrtomos foram
desenvolvidos para confeccionar cortes a partir de blocos de parafina, outros,
para realizar cortes congelados, e h ainda aqueles micrtomos especficos para
a microscopia eletrnica, chamados ultramicrtomos, capazes de confeccionar
cortes ultrafinos. A ttulo de conhecimento geral, iremos descrever alguns
destes modelos.
Micrtomos
congelados. Esse equipamento consiste de um micrtomo rotatrio acondicionado dentro de uma cmara frigorfica com temperatura abaixo de 20 oC (Figura 19).
Figura 19. Criostato.
mentos grandes, podendo ser utilizado para bloco de gelatina ou parafina. um micrtomo muito pesado, o que evita qualquer tipo de
vibrao mecnica. Muito utilizado para a confeco de cortes de tecido nervoso.
Micrtomo de congelao: esse tipo de micrtomo usado para
Notas de biossegurana
Utilize luvas ao cortar em criostatos, e lembre-se de que no caso de material
congelado, os espcimes no esto fixados.
Navalhas (ou facas)
zirem cortes de alta qualidade por no comprimirem os tecidos e permitirem cortes sequenciais, denominados cortes em fita. Essas navalhas so
confeccionadas em platina ou material cromado para prolongar o uso
do gume ou fio da navalha muito afiado. Para confeco de cortes
includos em parafina, so comercializadas navalhas descartveis de alto
e baixo perfis; as navalhas de alto perfil servem para microtomia de
tecidos mais slidos, enquanto as de baixo perfil servem para cortar
tecidos mais delicados.
As navalhas descartveis so recomendadas por possurem custo menor
em relao s de ao, alm de dispensarem a utilizao de equipamentos,
como afiadores automticos, que so muito caros. Assim, representam economia de tempo para o tcnico, que no mais precisar amolar suas navalhas.
PCR).
Problemas que podem ocorrer durante a microtomia
A maioria dos artefatos observados nos cortes causada por problemas
com a navalha durante a microtomia ou durante o processamento. Vamos listar
alguns dos problemas:
Problemas
Principais causas
1. A navalha e o bloco no esto
paralelos
2. O bloco de forma irregular de
paredes no paralelas
1. Fitas de cortes curvas ou
3. Borda de corte da navalha
irregulares
irregular
4. Parafina misturada no
homogeneamente ou impura
1. Faca mal afiada
2. Faca ou bloco quente
2. Cortes comprimidos, irregulares
3. ngulo irregular da navalha
ou pregueados
4. Parafuso do micrtomo solto
3. Fragmentao dos cortes ou
rasgados
1. Incluso imperfeita
2. Parafina quente demais durante
a infiltrao ou incluso
8. Fragmentao do tecido
durante a microtomia ou
separao do tecido do bloco
de parafina
9. Cortes aparecem
alternadamente finos e grossos
Notas de biossegurana
Uma causa frequente de acidente em laboratrios de histotcnica a falta
de ateno na manipulao de navalhas durante a confeco do corte. A
microtomia deve ser realizada em local calmo, onde o tcnico possa se
concentrar exclusivamente no seu trabalho. Muito cuidado ao descartar as
navalhas. Utilize sempre caixas de descarte especial para perfurocortantes.
Lembre-se de que os funcionrios do setor de limpeza podem se acidentar
com navalhas descartadas indevidamente.
6. Colorao dos tecidos
por componentes cidos dos tecidos (aninico (-)). As estruturas coradas pelos corantes bsicos so chamadas basfilas, como o ncleo. A
hematoxilina um exemplo clssico de corante bsico.
Clulas
Ncleo e citoplasma
Melancitos
Fontana-Masson
Secrees celulares
Mastcitos e eosinfilos
Para evidenciar
Glicoprotenas neutras
PAS
Proteoglicanos
Glicoprotenas no colagenosas
PAMS, reticulina
Para evidenciar
Tecidos especficos
Tecido conjuntivo
Tecido adiposo
Sudan black
Tecido muscular
Tecido cartilagionoso
Para evidenciar
Micro-organismos
Grocott e PAS
Warthin-Starry, Giemsa
Mycobacterium leprae
Giardia lamblia,
Entamoebahistolytica,
Trichomonas vaginalis
Helmintos
HE
Incluses virais
HE
Criptococcus
Consideraes importantes
Esse procedimento realizado com o auxlio do xilol, a mesma substncia utilizada para a clarificao dos tecidos durante o processamento para
a confeco do bloco contendo o fragmento do material a ser analisado.
Hidratao: realizada por meio de sequncias alcolicas em concen-
favorecendo a combinao de suas estruturas com o corante para posterior visualizao em microscpio de luz.
Desidratao: retira a gua do tecido, pois os meios de selagem no
so miscveis em gua, e so necessrios para a confeco dos preparados histolgicos permanentes. Assim, utiliza-se com concentraes alcolicas crescentes: lcool 70%, 80%, 95% e 100%.
Clarificao: utiliza-se o xilol como lquido intermedirio entre o lcool
e o meio de selagem.
Selagem ou montagem da lmina propriamente dita: a etapa final da
Solues:
A) Hematoxilina de Mayer (Mayer, 1903):
Hematoxilina.........................................................1 g
gua destilada..............................................1000 mL
Iodato de sdio................................................. 0,2 g
Almen de amnia ou potssio................................. 50 g
cido ctrico.........................................................1 g
Hidrato de cloral..................................................50 g
Dissolver a hematoxilina na gua destilada agitando (aquecer um pouco
at 60 C). Acrescentar o iodato de sdio e o almen. Agitar at dissolver
totalmente. Adicionar, ento, o cido ctrico e o hidrato de cloral. Deixar
agitando para que todos os componentes se dissolvam totalmente. A cor final
do corante vermelho-violeta. O corante estar pronto para o uso imediato e
poder ser usado por cerca seis meses (no mximo), sem que ocorra o amadurecimento exagerado.
Nota tcnica: existem vrios tipos distintos de solues para o preparo da
hematoxilina, como a de Mayer, Harris, Delafield e Erlich. Esses tipos de
solues variam de acordo com o tempo de colorao, aplicao e composio qumica do corante. A hematoxilina de Harris muito utilizada nos laboratrios de anatomia patolgica por produzir bons resultados com um tempo
curto de colorao. A hematoxilina de Mayer apresenta bons resultados,
porm com um tempo maior de colorao. As hematoxilinas de Erlich e
Notas de biossegurana
Ateno, pois o xilol e o lcool so altamente inflamveis. Use luvas nitrlicas,
jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos. Durante a
manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor de xilol.
Esse elemento txico para as vias areas e, quando inalado por tempo
prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir com espuma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol mais
pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior.
Colorao pela hematoxilina de Harris e eosina-floxina
Solues:
A) cido-lcool a 1%:
cido clordrico (HCl)..........................................1 mL
Etanol a 70%...................................................99 mL
B) gua amoniacal:
Hidrxido de amnio (NHOH)..........................2 a 4 mL
gua destilada......................................800 a 1000 mL
C) Carbonato de ltio saturado:
Carbonato de ltio (LiCO)...................................1,54 g
gua destilada................................................100 mL
D) Eosina-floxina (ver o mtodo de hematoxilina de Mayer e esosinafloxina)
Solues:
A) cido actico 0,5%.
B) lcool isoproplico.
Recomendamos fazer um teste prvio, pois, conforme o material, esse tempo poder ser reduzido e
ainda se obterem bons resultados.
3
Grnulos de mastcitos.......................................prpura
Bctrias..............................................................azul
Parasitas da malria..................................................azul
(McManus, 1946)
Solues:
A) cido Peridico 0,5%.
B) Reagente de Schiff:
Fucsina bsica........................................................1 g
Metabissulfito de sdio ou bissulfito de sdio..................2 g
gua destilada.................................................200 mL
cido clordrico 1 N..........................................20 mL
Procedimento:
1- Dissolver em 200 mL de gua destilada quente, 1 g de
fucsina bsica.
2- Deixar entrar em ebulio.
3- Esfriar at 50 C.
4- Adicionar 2 g de metabissulfito ou dissulfito ou bissulfito de
sdio anidro.
5- Filtrar.
6- Colocar uma pitada de metabissulfito de sdio anidro e em
seguida adicionar 20 mL de cido clordrico 1 N.
7- Agitar, esfriar e guardar na geladeira em frasco mbar ou
envolvido em papel alumnio.
Solues:
A) Soluo de permanganato de potssio 1%.
B) Soluo de cido oxlico 3%.
C) Soluo de almen de ferro 2%.
D) Soluo de nitrato de prata amoniacal de uso:
Nitrato de prata 10% (aquoso).............................20 mL
Hidrxido de potssio 10% (aquoso)........................5 mL
Hidrxido de amnia 28% (aquoso): adicionar aos poucos,
gotejando at que o precipitado marrom desaparea, sempre agitando.
A soluo se tornar transparente. Acrescentar ento 3 gotas de nitrato
de prata 10%, agitando. Acrescentar gua destilada na proporo de 1:1.
Acrescentar finalmente 25 mL de gua.
Soluo estoque 2:
Cloreto frrico (FeCl ), 29%..................................4 mL
gua destilada..................................................95 mL
cido clordrico concentrado (HCl)............................1 mL
D) Soluo de fucsina cida - Biebrich Scarlet:
Biebrich Scarlet (C.I. 26905), soluo aquosa a 1%....90 mL
Fucsina cida (C.I. 42685), soluo aquosa a 1%.......10 mL
cido actico glacial.............................................1 mL
E) Soluo de cido fosfotngstico - fosfomolbdico:
cido fosfotngstico................................................5 g
cido fosfomolbdico..............................................5 g
gua destilada..................................................200 mL
F) Soluo de azul de anilina:
Azul de anilina....................................................2,5 g
cido actico glacial..............................................2 mL
gua destilada.................................................100 mL
G) Soluo de cido actico glacial a 1%:
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada.
2- Colocar no lquido de Bouin por 1 hora a 56 oC ou
Solues:
A) Resorcina fucsina de Weigert:
Fucsina bsica........................................................2 g
Resorcina.............................................................4 g
gua destilada................................................200 mL
Cloreto frrico 30 %.........................................25 mL
Dissolver 2 g de Fucsina bsica e 4 g de Resorcina em 200 mL de gua
destilada em ebulio. Adicionar 25 mL de cloreto frrico a 30%, deixando
ferver por mais 5 minutos. Filtrar e desprezar o filtrado. O precipitado que
ficou no papel de filtro deve ser dissolvido em 200 mL de etanol 90%
aquecido. Aps esfriar, completar para 200 mL com etanol 90% e juntar
4 mL de cido clordrico concentrado. O corante deve ser guardado na
geladeira, pois o lcool pode evaporar com o calor.
B) Soluo de persulfato de potssio 10% ou monopersulfato de
potssio 10% ou oxona 10%
C) Soluo de Van Gieson:
Fucsina cida, soluo aquosa a 1%...........................5 mL
cido pcrico, soluo saturada aquosa
(21 g para 1 L de gua) ..................................100 mL
cido clordrico concentrado................................0,25 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar os cortes at o lcool 70%.
2- Oxidar pela oxona 10% (desprezar aps o uso).
3- Corar pela resorcina-fucsina durante 1 hora.
4- Passar por 3 banhos de lcool 95% (em borris), para retirar
o excesso de corante por alguns segundos em cada banho.
5- Lavar em gua destilada.
6- Contracorar ou no com a soluo de Van Gieson
7- Desidratar rapidamente em 3 banhos de lcool absoluto (em
borris).
8- Clarificar em 3 banhos de 3 minutos de xilol.
Resultados:
Fibras elsticas ......................................... marrom-avermelhado.
Solues:
A) Soluo de cido crmico (trixido de cromo) a 4%.
B) Soluo de nitrato de prata a 5%.
C) Soluo de metenamina (hexametilenotetramina) a 3%.
D) Soluo de brax a 5%.
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada.
2- Oxidar pela soluo de trixido de cromo a 4%, preparada
no momento de usar, e deixar por 1 hora.
3- Lavar em gua de torneira por poucos segundos.
4- Colocar na soluo de bissulfito de sdio a 1% por 1 minuto.
5- Lavar em gua corrente por 5 a 10 minutos.
6- Enxaguar em gua destilada; 3 trocas.
7- Colocar os preparados na soluo de trabalho de nitrato de
prata-metenamina, preparada no momento de usar, e deixar na
estufa a 58C - 60C, por 50 a 60 minutos.
8- Enxaguar em gua destilada vrias vezes.
9- Colocar na soluo de cloreto de ouro a 0,1% e deixar por
2 a 5 minutos.
10- Enxaguar em gua destilada.
11- Colocar na soluo de tiossulfato de sdio a 5%, e deixar
por 2 a 5 minutos.
12- Lavar em gua de torneira.
13- Contracorar na soluo de trabalho de light green por 30
a 45 segundos (esse tempo pode variar).
14- Desidratar, clarificar e selar.
Resultados:
Fungos ............................nitidamente delineados em preto
Mucina.....................................................cinza-escuro
Parte interna de miclios e hifas.....................rosa-acinzentado
Fundo..............................................................verde
Solues:
A) cido ctrico 1%.
B) Soluo de gua acidulada:
gua tridestilada deionizada...............................1000 mL
Acrescentar a soluo de cido ctrico a 1%, o suficiente para
alcanar o pH 4,0.
C) Soluo impregnante de nitrato de prata a 1%:
Nitrato de prata.....................................................1 g
gua acidulada................................................100 mL
D) Soluo de nitrato de prata 2% para revelao:
Nitrato de prata.....................................................2 g
gua acidulada................................................100 mL
E) Soluo de hidroquinona a 0,15%:
Hidroquinona cristalina qualidade fotogrfica...............0,15 g
gua acidulada...............................................100 mL
F) Soluo de gelatina a 5%:
Gelatina pura......................................................10 g
gua acidulada................................................200 mL
Resultados:
Espiroquetas, corpos de Donovani...negro
Colorao de fundo....................de amarelo a marrom-claro
Referncias:
C. H. Bridges e L. G. Luna estudaram vrias modificaes da
tcnica, que se encontra publicada em Lab. Invest.,1957.
Sirius red em pH 10,2 (Bogomoletz,1980; Luque,1989)
Soluo:
A) Soluo de sirius red em pH 10,2:
seguinte.
Esta soluo dura um ms temperatura ambiente; mas pode durar mais,
caso fique na geladeira. Aps um ms, aumentar o tempo de colorao.
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada.
2- Corar por 5 minutos pela hematoxilina de Mayer.
3- Lavar em gua corrente por 5 minutos.
4- Lavar em gua destilada por 2 minutos.
5- Passar pelo lcool 70% por 3 minutos.
6- Corar pela soluo de sirius red pH 10,2 por 1 hora ou mais.
7- Lavar em gua corrente por 10 minutos.
8- Desidratar, clarificar e selar.
Resultados:
Grnulos do eosinfilos......................................vermelho
Ncleos..............................................................azul
Solues:
A) Vaselina terebentina:
Terebentina......................................................70 mL
Vaselina...........................................................30 mL
ou Soluo de leo de Anilina - Xilol:
leo de anilina..................................................30 mL
Xilol..............................................................70 mL
Solues:
A) Soluo estoque mucicarmim de Southgate:
Carmim...............................................................1 g
Hidrxido de alumnio.............................................1 g
Etanol a 50%........................................................100 mL
Cloreto de alumnio, anidro..............................................5 g
Faa essa soluo em banho-maria. Quando frio, filtre.
B) Soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate:
Soluo-estoque de mucicarmim de Southgate...............10 mL
gua destilada..................................................90 mL
C) Soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert:
Partes iguais das solues estoque A e B (100 mL de A + 100 mL
de B). Ver o mtodo de colorao pela tricromtica de Masson.
D) Soluo de amarelo metanil a 0,25%:
Amarelo metanil.......................................................0,25 g
gua destilada........................................................100 mL
cido actico glacial................................................0,25 mL
Procedimento:
1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada.
2- Deixar na soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert
por 7 minutos.
3- Lavar em gua corrente de torneira por 10 minutos.
4- Corar na soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate por
30 minutos e descart-la aps o uso.
5- Enxaguar rapidamente em gua destilada.
Notas de biossegurana
Ao manipular vrios produtos qumicos para os mtodos de colorao, use
mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local arejado e com
exausto. O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto,
evitando sempre o contato com a pele ou a vias respiratrias. Observe a
ficha de segurana de cada produto qumico utilizado para os mtodos de
colorao, muitos so danosos sade se inalados, engolidos, ou se entrarem em contato com a pele. Nunca descarte as solues corantes ou
qualquer soluo preparada para o desenvolvimento das coloraes em
esgoto sanitrio convencional, procure saber a poltica de descarte de
produtos txicos de sua instituio.
7. Tcnicas imuno-histoqumicas
O que so anticorpos?
H2O2+DAB
Soluo de uso:
Filtrado de leite 2,5%...............................................100 mL
Albumina bovina.........................................................2,0 g
Soro fetal bovino........................................................8 mL
Guardar soluo em geladeira.
Outro elemento capaz de causar reaes inespecficas a peroxidase
endgena tecidual. Esse problema s ocorre quando o mtodo escolhido o
enzimtico, pois o substrato cromgeno reagir tanto com a peroxidase ligada
ao anticorpo da reao quanto com a peroxidase tecidual. Nesse caso, devemos inibir a ao da enzima, utilizando uma soluo de perxido de hidrognio (H2O2) 3%.
Para garantir a sua qualidade, sempre importante incluir um controle
positivo e controle negativo da reao. O controle positivo obtido com um
material que sabidamente possui o antgeno analisado. Esse material permitir
confirmar, por sua marcao positiva, a qualidade da reao, caso as lminas
testadas forem negativas. O controle negativo feito omitindo-se o anticorpo
primrio nas lminas testadas, ou utilizando o mesmo isotipo do mesmo animal
no qual foi produzido o anticorpo primrio. Assim, com esses cuidados, o
resultado da reao permite garantir que as demais etapas da reao no esto
reconhecendo inespecificamente nenhum componente tecidual.
A seguir, segue uma sugesto de protocolo de reao indireta para
material includo em parafina. Nesse procedimento, utiliza-se a panela de
presso como equipamento para auxiliar na etapa de recuperao antignica e
um anticorpo secundrio biotinilado, isto , associado biotina.
Protocolo:
1- Aps confeccionar os cortes e aderi-los em lminas previamente tratadas com adesivo, deixar o corte aderir lmina por um
dia em estufa 37 oC.
2- Desparafinizar e hidratar as lminas, deixando-as por 5
minutos em cada banho nas respectivas solues (ver pretapa da colorao).
3- Colocar cerca de 2 litros de tampo citrato em pH 6,0 em
uma panela de presso. Deixar esquentar e, quando o tampo
estiver fervendo, colocar as lminas imersas no tampo e fechar a
panela. Quando a panela comear a apitar, deixar por mais 1
minuto e apagar o fogo. Aliviar a presso pela vlvula de segurana da panela e deixar a panela destampada para esfriar um pouco
a soluo (cerca de 10 minutos). Aps esse tempo, lavar os
cortes em gua corrente por mais 10 minutos.
4- Lavar as lminas por 10 minutos em PBS (tampo fosfato de
sdio 0,1M em pH 7,2) trocando o tampo por duas vezes.
5- Incubar com anticorpo primrio de um dia para o outro ( over
night) em geladeira a 4C. Cobrir os cortes delicadamente com
o anticorpo, mantendo as lminas em cmara mida.
6- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5
minutos.
7- Incubar as lminas por 20 minutos em uma soluo de perxido
de hidrognio 3% em PBS.
8- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5
minutos.
sobre o tecido;
retrao ou intumescimento tecidual provocado por algum componen-
te qumico do fixador;
autlise associada proliferao bacteriana devido demora em se
fixar o material;
fragmentao e/ou rachadura do tecido provocada por elevao da
histolgico.
Referncias bibliogrficas
BANCROFT, J. D.; STEVENS, A. Teory and Practice of Histological Techniques. 4.
ed. Nova York: Churchill Livingstone, 1996.
BOGOMOLETZ, W. Avantages de la coloration par le rouge sirius de lamyloide et des
eosinophiles. Arch. Anat. Cytol. Pathol., n. 28, p. 253-253, 1980.
CAPUTO, L. F. G. Manual da disciplina de Histotecnologia do curso tcnico d
e Pesquisa em Biologia Parasitria do Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro: Fiocruz,
2008.
CARSON, F. L. Histotechnology: A Self-Instructional Text. 2. ed. Chicago: American
Society of Clinical Pathologists, 1997.
CARSON, F. L.; MARTIN, J. H.; LYNN, J. A. Formalin Fixation for Electron
Microscopy: A Re-evaluation. Am. J. Clin. Pathol., n. 59, p. 365-373, 1973.
FEULGEN, R.; ROSSENBECK, H. Mikorskopisch-chemischer Nachweis einer
Nucleinsaure vom Typus der Thymonucleisaure und die darauf beruhende elektive Farbung
vom Zellkernen in mikroskopischen Praparaten. Z. Phys. Chem., n. 135, p. 203-248,
1924.
FITE, G. L.; CAMBRE, P. J.; TURNER, M. H. Procedure for Demonstrating Lepra
Bacilli in Paraffin Sections. Arch. Pathol., n. 43, p. 624, 1947.
GOMORI, G. Silver Impregnation of Reticulum in Paraffin Sections. Amer. J. Path., n.
13, p. 993-1.002, 1937.
GRIMALDI FILHO, G. Manual de tcnica histolgica. Rio de Janeiro: CME/IOC/
Fiocruz, 1981.
GROCOTT, R. G. A Stain for Fungi in Tissue Sections and Smears using Gomori
Methenamine Silver Nitrate Technique. Am. J. Clin. Pathol., n. 25, p. 975, 1955.
JUNQUEIRA C. U.; JUNQUEIRA, L. M. M. S. Tcnicas bsicas de citologia e
histologia. So Paulo: Santos, 1983.
KERR, D. A. Improved Warthin-Starry Method for Tissue Sections. Amer. J. Clin. Path.
Tech., supp. 8, p. 63-67, 1938.