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1. Introduo
A tcnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon
1984) tambm pode ser denominada protein immunoblot e consiste na deteco de
protenas especficas em amostras de lisados celulares ou de tecidos. Os passos para a
elaborao dessa tcnica pode ser resumida em cinco etapas: (1) extrao e quantificao
das protenas; (2) fracionamento das protenas da amostra em um gel de poliacrilamida; (3)
transferncias dessas protenas para uma membrana; (4) incubao da membrana com um
anticorpo para detectar a protena especfica a ser analisada; e (5) revelao dessa
membrana para anlise dos dados.
3. Fracionamento de protenas
Para separar as protenas de uma amostra homognea, a tcnica mais utilizada a
eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Inicialmente prepara-se o gel de
SDS-poliacrilamida, que ser uma matriz inerte atravs da qual as protenas podero
migrar. O gel preparado pela polimerizao de monmeros de acrilamida e o tamanho dos
poros do gel pode ser ajustado variando a concentrao da acrilamida adicionada para
retardar a migrao da sua protena de interesse. As protenas podem possuir cargas
positivas ou negativas, dependendo das cargas dos aminocidos que as compem.
utilizado, ento, o SDS (sodium dodecyl sulfate), um poderoso detergente carregado
negativamente, que se liga nas regies hidrofbicas das molculas de protenas
mascarando a carga intrnseca, e permitindo que as protenas migrem em direo ao polo
positivo em um campo eltrico. Alm disso, o SDS quebra as ligaes no covalentes das
protenas, fazendo com que elas voltem a sua estrutura primria, liberadas da associao
com outros monmeros ou outras protenas e molculas de lipdeos. Alm disso, usa-se,
geralmente, um agente redutor tal como o -mercaptoetanol, que quebra as ligaes
dissulfito (S-S) dos resduos de cistena que promovem a ligao de protenas a outros
monmeros, outras protenas ou mesmo a estrutura terciria da mesma protena, mantendo
assim, as protenas separadas e linearizadas (Figura 1a). A partir dessas condies,
protenas de um mesmo tamanho tendem a correr em um gel de poliacrilamida, na
presena de um campo eltrico com as mesmas velocidades, uma vez que (1) suas
estruturas nativas encontram-se completamente desnaturadas devido ao SDS e ao -
mercaptoetanol fazendo com que suas formas sejam as mesmas e, (2) elas se ligam na
mesma quantidade de SDS e portanto tem a mesma quantidade de cargas negativas
(Figura 1b, c).
1. Prepara soluo estoque de BSA 10 mg/ml. Diluir 10 vezes a soluo para efetuar
as diluies para preparar a curva de calibrao.
- Eliminar o isopropanol lavando com gua destilada e secar com papel Watmann.
- Retirar o pente e transferir as placas para o suporte branco com a face da placa
menor voltada para o interior do suporte. Marcar a base dos pocinhos com caneta.
- Diluir o tampo com a amostra na proporo 1:4, e aquecer por 3-5 min a 95C
2.3. Corrida
3. Western
3.2. Transferncia
- Aps esse tempo, remover os papis Whatmann sem mover o gel e verificar se a
transferncia funcionou erguendo o canto do gel onde foi carregado o Marcador de Peso
Molecular.
3.3. Bloqueio
- Descartar a soluo do Tampo de Lavagem e adicionar um volume de Tampo de
Bloqueio suficiente para deixar o gel imerso.
- Deixar a membrana bloqueando sob leve agitao (orbital) durante 30 minutos a 1
hora. O tempo de bloqueio depende da especificidade de cada anticorpo primrio. Em todos
os casos, 1 hora pode ser o tempo inicial para testar anticorpos novos.
de Tampo de Bloqueio.
- Descartar a Soluo do Anticorpo Secundrio e lavar a membrana com
aproximadamente 30 ml de Tampo de Lavagem de acordo com os tempos definidos
abaixo: 2 X rpido, 2 X 15 min, 2 X 5 min.
- Preparar a membrana para revelao.
3.6. Revelao
- Scanear a membrana no aparelho Odyssey (Licor) no comprimento de onda que
excitar o fluorforo associado ao anticorpo secundrio utilizado no experimento (700 ou
800nm).
Material Suplementar
What is Cancer?
https://www.youtube.com/watch?v=LEpTTolebqo
Aurora Kinases
https://www.youtube.com/watch?v=Qn7lKYHjE_Y