Curso de Boas Práticas Laboratoriais

Preparo,
Identificação e
Armazenamento
de amostras
biológicas

Silene Peres Keusseyan

Maio/2011
 Centrifugas

Poucos experimentos são realizados sem pelo menos uma

passagem pela centrífuga

Usadas para separar partículas de uma solução

Em laboratórios de pesquisa biológica:
 Sangue
 Células
 Separação de fases
 Organelas
 Isolamento de macromoléculas (DNA, RNA, vírus,
proteínas)
 Centrifugação

Qual velocidade? rpm x rfc (g) ?

Qual o tipo de separação desejado?

Qual centrífuga usar?

Que temperatura?

Qual o tubo apropriado?

Qual o rotor?

Como centrifugar
 Força centrífuga
A força centrífuga relativa (Rcf) cuja unidade é o g é gerada quando
uma partícula ou conjunto de partículas é sujeito a um movimento
circular de aceleração

Rcf (g) = 1,12 x 10-5 x R x N2

R = raio em centímetros
N = velocidade de centrifugação em rpm
1 g equivalente à aceleração da gravidade na superfície da Terra
Força centrífuga
 Tipos de centrifugação

Centrifugação diferencial (separação de fases)
Amostras centrifugadas a certa velocidade resultam em sobrenadante
e pélete (baseada no tamanho das partículas)
Tamanho maior sedimenta mais rápido
Ex: separação do sangue em elementos figurados e plasma / soro,
 Tipos de centrifugação

Centrifugação por gradiente de densidade
 Centrifugação de escala zonal
Separação de partículas com diferentes densidades
Ex: separação de mononucleares por Ficoll-Hypaque
Hemácias:1095 densidade, mononucleares 1065 e Ficoll 1077
Utiliza gradiente de meio viscoso

soro
Sangue plaquetas
diluído Mononucleares “nuvem”
Ficoll-Hypaque
Ficoll-
Hypaque eritrócitos
granulócitos
 Centrífugas

Centrífuga de bancada

Centrífuga de bancada refrigerada

Centrífuga de alta velocidade

Ultracentrífuga

Microcentrífuga

Citocentrífuga
 Centrífuga de bancada

Múltiplos fins: peletizar células e bactérias, sedimentação de soro,
urina, células e sangue
 Suporte oscilante: até 3.800g ou 6.000 rpm
 Capacidade:
normalmente 32 x 5mL ou 16 x 10mL
 Com ou sem tacometro
 Controle de tempo
 Sem freio

Fanem Excelsa
Baby mod 206
 Centrífuga de bancada
refrigerada

Múltiplos fins: peletizar células e bactérias, sedimentação de soro,
urina,células e sangue
 Ângulo fixo
 2 tipos de rotores:
28 x 2 mL – máx 14500rpm – 17400rcf (g)
10 x 10 mL – máx 13500rpm – 16900rcf (g)
 Refrigeração : -8°C até +40°C
 Controle de aceleração/desaceleração
(alta para peletização, baixa para gradientes)
 Memória para programas
 Sensor tampa fechada
Jouan MR 18.22
 Centrífuga de alta velocidade
refrigerada

Precipitações de grandes volumes
 2 tipos de rotor (R24A e R12A3)
 Ângulo fixo
R24A: 8 x 50mL – máx 24000rpm – 68900rcf (g)
R12A3: 6 x 300mL – máx 12000rpm – 23800rcf (g)
 Refrigeração: -20°C até +40°C
 Controle de aceleração/desaceleração
 Controle de tempo
 Sensor tampa fechada

Hitachi Himac CR21

 Ultracentrífuga

Sedimentação de macromoléculas, ribossomos, vírus...
 Ângulo fixo ou suporte oscilante
 Até 100.000rpm - 800000rcf (g)
 Tubos tamanhos variáveis ,
 Chão ou bancada
 Programável Sorvall WX
 Sempre refrigerada
 Câmara fechada à vácuo (atrito com ar eleva temperatura
e diminui velocidade)
 Programável
 Microcentrífuga

Volumes pequenos, precipitação de células (baixa

velocidade), retirada de “debris”, extrações com etanol e
minifenol
 Ângulo fixo: máx 14000rpm
 Capacidade :tubos eppendorf 20 x 2mL
 Sensor tampa
 Sem refrigeração

Jouan A14
 Citocentrífuga

Produção de monocamada de células em área definida

Ex: lâminas para detecção de Anca
 Cytofunnel saída única ou dupla
 Programável
 Capacidade até 12 câmaras
 Suporte oscilante:200 a 2000rpm
 Sensor tampa fechada + tampa de segurança

Cytospin 2 Shandon
Rotor
 Tubos

Seleção do tubo adequado:
 De acordo com o tipo de rotor
 Evitar vazamento ou perda da amostra (mecanismo de lacre)
 Assegura compatibilidade química (resistência)
 Permite fácil recuperação da amostra (transparência)
 Como centrifugar

Conheça as limitações de velocidade da centrífuga e dos

rotores

Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas,
proteção e pinos

Se usar um tubo para equilibrar, encha-o com material
similar ao que vai centrifugar - água = contrabalancear fora
do meio

Utilize tubos, tampas e suportes apropriados (filme
plástico)

Preencha os tubos até 1 ou 2 cm da borda

Tubos íntegros ( sem rachaduras)
 Como centrifugar

Suportes não utilizados podem desequilibrar a centrífuga

Materiais infecciosos SOMENTE EM TUBO FECHADO

Retire as amostras da centrífuga assim que terminar -
amostras paradas = pélete disperso

Centrífugas refrigeradas: feche a tampa no intervalo das
centrifugações (evitar queda de temperatura e
condensação) e deixe aberta quando terminar (secar)

Limpe com pano macio e hipoclorito/álcool 70% quando
acabar de usar
 Como equilibrar os tubos

Tubos frente a frente = mesmo peso

Microcentrífuga – ajuste por volume, não por peso

Alta velocidade ou ultra centrífuga – pesar tubos em duplas
com balança de pratos

Suportes de 4 tubos ou mais – equilibrar dois conjuntos em
balança de pratos e colocá-los frente a frente

Suportes não completos = equilibre na diagonal

Amostras estéreis – equilibre o volume dos pares “a olho”,
se necessário ajustar suportes use álcool 70% fora do tubo

Use o mesmo meio que sua amostra para ajustar tubos
sem par
 Armazenamento de
amostras

Tubos e caixas apropriados e identificados
 Identificação

Canetas permanentes e durex sobre o escrito para tubos e caixas

NUNCA identifique amostras de pacientes pelas iniciais
 Ex: MCO = Maria Cristina Oliveira – quantas ?
 Todo material coletado pela disciplina, pertence à disciplina , não ao
pós-graduando
 Material devidamente identificado pode ser utilizado no futuro

Caixa 1
001 LESa De 001 a xxx
SPK 03/05/11 LESa ou
protocolo YY
NPS ano 2011
 Banco de dados

001 LESa
SPK 20/07/2004

data coleta Nº ENSAIO RG HSP Nome SEXO Idade Sledai ETNIA ACR FAN DNAifi DNA EIA CH100/C2
20/07/2004 1 1058511 Bruna Suzuki Donoso F 14 6 NC 4 PF 1:320 NEG 101 182U/>100%
27/09/2004 2 1485459 Helen Micaela A Aguiar F 6 6 C 9 PF>1:320 NEG 94 161U/67
17/08/2004 3 10068367 Fernando de Souza M 16 8 C 5 NEG NEG 50 150
14/09/2004 4 10070001 Liliam Bruna O Magalhães F 17a 11m 8 C 6 PF 1:80 NEG 81 263/88%
28/09/2004 5 1061544 Juliane B de Oliveira F 18a 11m 12 C 7 PF 1:80 NEG 173 234/>100%
19/10/2004 6 10099595 Paula Ferreira F 16 13 C 6 PF1:640 NEG 74 <30/43%
15/07/2004 7 10052027 Thiago L de Oliveira M 14 16 C 9 PF 1:320 NEG 81 203/100
16/08/2004 8 1134111 Isabela C de Souza F 18 14 NC 6 HO >1:640 1/40 505 239/>100%
19/04/2005 9 10104632 Jaqueline R S Albuquerque F 11 8 C 5 PG >1:640 NEG 173 277/>100%

Entregue ao orientador ao final da tese

Conservação de amostras
 Conservação de amostras

Geladeira: material biológico temporariamente, reagentes e
soluções pelo prazo de validade dos mesmos

Sangue total: utilização imediata para ensaios
hemodinâmicos e dosagens bioquímicas, geladeira por 1
semana* ou -20ºC somente para futura extração de DNA

Soro ou plasma: -20ºC por tempo indeterminado (selado)

Células sempre em solução de tamponamento para morte
celular
 -70ºC por tempo limitado, nitrogênio líquido (-196°C ) por
tempo indeterminado

Tecidos ou orgãos: -70ºC
 Conservação de amostras

Alíquotas
Por que fazer?

 Prevenir decomposição por congelamentos e

descongelamentos repetidos
 Prevenir contaminação por múltiplos usos
 Por conveniência física
 Para economizar tempo no preparo de uma solução ou
tempo de descongelamento
 Freezers -20º e -70ºC

Só abra a porta quando necessário e por pouco tempo

Se precisar manipular alguns tubos, retire a caixa do freezer
e coloque no gelo enquanto procura

Todas caixas ou recipientes colocados no freezer devem
estar devidamente ROTULADOS e TAMPADOS

Periodicamente descarte material que não for mais utilizar

Mantenha um registro da localização de seus materiais

Respeite os espaços

Não altere localização de material alheio

Providencie descongelamento quando necessário (só -20ºC)
 UNIFESP
Disciplina de Reumatologia

“Na Bancada - Manual de iniciação científica em laboratório de pesquisas

biomédicas”, Kathy Baker, Editora Artmed, 2002

“Boas Práticas de Laboratório” , Maria de Fátima da Costa Almeida, Editora

Difusão, 2008

“Centrifugation: Essential Data”, by David Rickwood et al, 1994