COLORAÇÕES CITOQUÍMICAS

INTRODUÇÃO E IMPORTÂNCIA
Citoquímica é a aplicação de corantes bioquímicos à células do sangue e medula
óssea, de maneira a refletir sua composição sem modificar apreciavelmente sua morfologia.
Colorações citoquímicas são auxiliares diagnósticos importantes em leucemias e em outras
doenças hematológicas.
É importante compreender que o estudo das células do sangue e da medula, através
técnicas especiais, é complementar ao estudo clássico de suas morfologias ( evidenciadas
após colorações panóticas). Sem dúvida, a riqueza de detalhes observáveis em extensões
assim coradas (Leishmann, May-Grunwald, Giemsa...), é o ponto de partida indispensável
para estudos subseqüentes.
Como qualquer reação colorida ou técnica de coloração por adsorção ou partição, a
sensibilidade é o “calcanhar de Aquiles” dos métodos citoquímicos, Assim, embora
saibamos que existam lipídeos e proteínas em todas as células, não é possível corar, com
técnicas específicas para estas classes de substâncias, todas as estruturas que as contém. Por
outro lado, interessam-nos apenas as colorações que possam esclarecer aspectos da
fisiopatologia das células do sangue e seus precursores, mais precisamente, aquelas que
tenham valor diagnóstico e/ou prognóstico. As colorações citoquímicas incluem:
- Sudan Black B;
- Ácido periódico de Schiff (PAS);
- Perls (reação do azul da prússia);
- Colorações para várias enzimas etc;
Note que, embora existam métodos histoquímicos (i.é., colorações bioquímicas em
tecidos, preservando a morfologia) para proteínas, peptídeos e ácidos nucléicos, estas
colorações são quase ausentes da rotina laboratorial, porque seu interesse diagnóstico é
menor.
Há um grande número de estudos feitos com granulócitos de humanos e de animais,
que procura estabelecer o mecanismo de ação destas células, desde sua migração (da
medula óssea para o sangue), até os fenômenos responsáveis pela morte de
microorganismos ou a fagocitose de substâncias estranhas presentes na circulação e nos
tecidos. Os dados presentes na literatura nem sempre são coincidentes, devido as variações
de material e procedimentos utilizados. Entretanto, o reconhecimento dos tipos de
granulações presentes nestas células, a dinâmica de seu aparecimento durante a maturação
da linhagem, as enzimas nelas contidas e seu papel nos diversos processos fisio e
patológicos, de que participam os granulócitos, devem muito a este tipo de estudo.
 TÉCNICAS MAIS USADAS: PRINCÍPIO

COLORAÇÃO PELO PAS

A reação do ácido periódico de Schiff é importante na histo e na citoquímica de
carbohidratos. Reações positivas indicam a presença de glicogênio, um polímero de glicose
e de outros 1,2-glicóis. É uma reação efetuada em duas etapas: na primeira, grupos vicinais
hidroxil são oxidados a aldeídos; na segunda etapa, os dialdeídos formados são
demonstrados usando-se o reagente de Schiff, que é o corante fucsina básica. A cor
produzida varia entre o púrpura e o magenta, nos sítios onde se localizam carboidratos
oxidáveis (mono-, oligo- e polissacarídeos, glico- e mucoproteínas).
Os granulócitos neutrófilos maduros contêm altos níveis de glicogênio, necessário
à célula, para fagocitose.
As células blásticas granulocíticas quase não possuem glicogênio. Na verdade, é a
partir do promielócito, que o teor de glicogênio torna-se evidente, demonstrável pelo PAS.
A positividade aumenta com a maturação. Este glicogênio é bastante lábil e é rapidamente
consumido em situações de baixa glicemia, sendo também rapidamente reposto.
Os granulócitos eosinófilos e basófilos possuem polissacárides como os neutrófilos.
Nos basófilos, a heparina e o ácido hialurônico são responsáveis pela basofilia, Nos
eosinófilos, os polissacárides não parecem se localizar nas granulações, que por conterem
grande quantidade de proteínas básicas ricas em arginina (responsáveis pela afinidade aos
corantes ácidos), não se coram pelo PAS.

SUDAN BLACK B
Os corantes de SUDAN, como o sudan black B são substâncias provenientes de
uma série de pigmentos lipossolúveis, que detectam lípides celulares. As células
hematopoiéticas contém lípedes finamente dispersos em seu citoplasma, lípides complexos
( lipoproteínas) na membrana celular e nas membranas de mitocôndrias e de outras
organelas. Estes lípides não são identificáveis em extensões coradas por corantes panóticos.
Entretanto, quando o sudan black b cora estas células, particiona-se entre os lípedes
celulares e a solução corante, concentrando-se nas estruturas lipídicas, emprestando-lhes
uma coloração escura, negra. Reações positivas são associadas aos granulócitos. A série
monocitária apresenta reações variáveis e a linfocitária é negativa.
Comparando-se com o conteúdo lipídico dos eritrócitos, os leucócitos são muito
mais ricos em glicolipídios (400:1). Além disso, os leucócitos leucêmicos, têm um teor de
fosfolipídios mais elevado do que o dos linfócitos normais. A partir dos promielócitos a
coloração é fortemente positiva, aumentando com a maturação; porém nos mieloblastos,
podem ser vistas colorações sudanófilas pequenas e escassas, na linhagem neutrofílica. A
coloração em outras linhagens granulocíticas é variável: nos eosinófilos, uma sudanofilia
fraca, delimita as granulações específicas. Os basófilos podem ter a positividade aumentada
em leucemias (acompanha a positividade para o PAS). Devido a uma série de dificuldades
inerentes ao método, ele é considerado, por alguns autores, menos esclarecedor. Muitos
lipídios, associados a outras substâncias, não apresentam positividade,
 ENZIMAS
Desempenham papel muito importante na fisiologia leucocitária e, por esse motivo,
sua demonstração tem crescido em importância. As enzimas estão associadas, nos
granulócitos às estruturas granulares e intervêm nos processos de ataque e morte de
microrgranismos. Cumprem, em geral, funções de hidrólise e de oxidação. Nem todas
podem ser demonstradas citoquimicamente. De um modo geral, o mecanismo de coloração
citoquímica-enzimática segue o seguinte esquema :

Substrato -----------------
corante precursor ----------------
coloração final

enzima captador

É fácil perceber que alterações de localização e de atividade da enzima podem

ocorrer, gerando falsos resultados, O principal problema é a difusão dos produtos formados
durante a reação. Uma outra interferência importante é a diferença de atividade entre as
diversas isoenzimas. Dentre as principais enzimas demonstráveis citoquimicamente nos
granulócitos, temos:
- Alfa-1,4-glicosidase;
- Aril sulfatases;
- Beta-glicuronidase;
- Esterases;
- Fosfatase ácida;
- Fosfatase alcalina;
- Lipase ácida;
- Mieloperoxidase;
- Proteases.
Nossa experiência limita-se às fosfatases, algumas esterases e à mieloperoxidase.

FOSFATASES
As fosfatases são enzimas largamente distribuídas nos tecidos de mamíferos. Como
um grupo, elas liberam ortofosfato de um fosfato orgânico. A classificação em ácida e
alcalina deve-se ao pH de sua atividade ótima. Sua determinação baseia-se na formação
de precipitados de fosfatos orgânicos por elas hidrolizados.

FOSFATASE ALCALINA

Hidrolisa ésteres naturais ou sintéticos, liberando o ácido ortofosfórico em meio

alcalino (pH 9,2 – 9,6), É inibida pelo cianeto, fosfato e arsenato. Está presente nas
granulações específicas dos neutrófilos e é encontrada em maior quantidade nas células
maduras. Nas células precursoras de metamielócitos, bem como nos outros granulócitos
(eosinófilos e basófilos) a atividade enzimática detectável por esta técnica é mínima. Nem
todos os neutrófilos segmentados têm reação fortemente positiva da fosfatase alcalina. Ao
contrário, predominam as células negativas e fracamente positivas em extensões sangüíneas
de indivíduos normais. A atividade é maior nos neutrófilos circulantes do que nas células
medulares, indicando que o teor enzimático máximo deve ser obtido após a emissão da
medula. As células recém formadas possuem maior atividade enzimática. O método de
avaliação é semi-quantitativo, através escores. A atividade enzimática aumenta em certas
condições fisiológicas, como estresses, gestação e em certas patologias como infecções,
infarto do miocárdio, hemopatias malignas do tipo policitemia vera e mielofibrose
primária. Entretanto, o maior interesse dessa reação é a baixa atividade característica da
Leucemia Mielóide Crônica. É relevante no diagnóstico diferencial desta condição. Nas
Leucemias Agudas, ao contrário, a fosfatase alcalina pode estar normal ou mesmo
aumentada, nos escassos segmentos neutrófilos comumente encontrados. Em reações do
tipo leucemóide, o usual é encontrar um escore elevado.
Embora muitas dúvidas existissem sobre a localização celular da fosfatase alcalina,
concluiu-se que os núcleos são desprovidos de atividade. A enzima é granular (granulações
específicas) e, dependendo de fatores técnicos como fixador, temperatura, tempo de
incubação e anticoagulante, pode difundir na célula.

FOSFATASE ÁCIDA

Hidrolisa ésteres naturais ou sintéticos de fosfato, liberando em meio ácido (pH 4,5
a 6,0), o ácido ortofosfórico. É inibida por íons fluoreto em baixas concentrações.
Constitui uma hidrolase importante no processo de ataque e morte de microorganismos
fagocitados e atua, juntamente com a fosfatase alcalina, no processo de defesa primária. A
fosfatase ácida situa-se nas granulações primárias: é uma enzima lisossomal. A intensidade
da reação da fosfatase ácida é menor nos neutrófilos do que a da fosfatase alcalina. Nas
células linfocitárias, ao contrário, o teor de fosfatase ácida é maior do que o da alcalina, e
sua determinação citoquímica pode ser importante na caracterização da linhagem, quando
envolvida em um processo leucêmico. Nos agranulócitos, a fosfatase ácida aparece
intensamente positiva em monócitos e com pequena atividade em linfócitos. Porém, as
células T exibem intensa positividade na região do Golgi, enquanto as células B podem ser
positivas ou negativas.
Um estudo adicional de inibição pelo ácido tartárico pode ser feito. A maioria das
isoenzimas da fosfatase ácida é inibida pelo ácido L-tartárico. São resistentes enzimas das
células de reticuloendoteliose leucêmica (leucemia de células cabeludas), síndrome de
Sézary e algumas leucemias linfoblásticas agudas de células T.

ESTERASES
É um grupo de enzimas muito diversificado. A propriedade mais significativa destas
enzimas é o fato de que seus substratos naturais são ésteres de ácidos carboxílicos. As
esterases são enzimas capazes de hidrolisar ligações éster de álcoois, fenóis e naftóis.
Muitas esterases têm uma baixa especificidade pelo substrato e são referidas como
esterases não específicas. Aquelas com alta especificidade pelo substrato são denominadas
conforme esta propriedade, por exemplo, a cloroacetato esterase.
 Vários tipos de reações de esterase pedem ser usadas em leucócitos na diferenciação
das linhagens neutrofílica e monocitária.
Se um substrato – naftol AS-D cloroacetato – é enzimaticamente hidrolisado por
uma esterase cloroacetato específica, um naftol livre é liberado. Esse composto é acoplado
a um sal diazônico para formar um depósito bastante colorido nos sítios de atividade
enzimática. Reações positivas são observáveis em células da linhagem granulocítica. Esta
enzima foi ocasionalmente observada em promonócitos e monócitos maduros. Monoblastos
são negativos. As reações com estes substratos são similares tanto à coloração com o Sudan
Black B quanto à reação para a mieloperoxidase, no que diz respeito às células positivas.
As esterases aparecem um pouco mais tardiamente na diferenciação celular, usualmente
entre os estadios de mieloblasto e promielócito.
As esterases não específicas (por exemplo, alfa- naftil acetato e butirato esterase)
são usadas clinicamente para reconhecer células de origem monocitária. Nesta linhagem, e
não nas linhagens granulocítica e linfocitária, a enzima é inibida pelo fluoreto de sódio.
Esta reação também libera um naftol livre do substrato. Este naftol é captado por um sal de
diazônio, como na reação anterior, para formar um depósito negro, nos sítios de atividade
enzimática. A reação é fortemente positiva nos monócitos, fracamente positiva ou negativa
nos granulócitos e positiva em outros tipos celulares.

MIELOPEROXIDASE
Peroxidases são enzimas relativamente raras em tecidos animais. São bastante
comuns em tecidos vegetais. Em humanos, peroxidases são encontradas nos microssomas
das células hepáticas e renais, e nos grânulos das células mielóides e monocitóides.
A mieloperoxidase localiza-se nos grânulos azurófilos primários. Os blastos
primitivos, comprometidos com a linhagem mielóide, demonstram atividade de peroxidase
em áreas como o retículo endoplasmático e a região do Golgi.
A reação catalizada pela peroxidase é a decomposição dos peróxidos, liberando
oxigênio (que vai oxidar um determinado receptor). Na identificação, o peróxido usado é o
de hidrogênio, e o receptor é, em geral, a benzidina. O mecanismo é a oxidação da
benzidina, incolor, ao azul de benzidina, que é instável, e finalmente ao composto estável
de cor castanho-esverdeada, ou quase negra, dependendo da técnica usada.
A coloração é positiva nos granulócitos num padrão granular. O padrão de reação
positiva em células jovens pode aparecer como estruturas em bastão ou manchas,
denominadas corpúsculo Phi. As células granulocíticas exibem positividade crescente
com a maturação, enquanto que nas células monocitárias a reação é menos intensa,
caracterizada por depósitos granulares finos, dispersos por toda a célula. Outras linhagens
são negativas. A reação da mieloperoxidase freqüentemente acompanha o Sudan, mas não
obrigatoriamente. Esta reação é útil na diferenciação de leucemias agudas. Casos em que a
mieloperoxidase não acompanha a coloração pelo Sudan, incluem estados pré-leucêmicos
ou infecciosos graves (negativa) e reações positivas em linfócitos em pessoas com
reticuloendoteliose leucêmica (leucemia de células cabeludas). Existe também uma
condição de diminuição hereditária da mieloperoxidase.
 REDUÇÃO DO NBT
O NBT é um corante oxidado, amarelo, que tem um potencial de oxi-redução baixo
o suficiente para competir com o O2 como receptor de elétrons e pode aceitar elétrons de
oxidases e desidrogenases. Isto fez com que ele fosse proposto em Histologia, com outros
corantes da mesma “família”, como detector de atividade redox. Seu produto de redução
total, a diformazana, é uma substância insolúvel em água e com uma cor azul intensa. O
sucesso e seu uso para este fim originou um teste “clínico” que, baseado no aumento de
atividade oxidativa nos neutrófilos em infecções, buscava distinguir entre infecções
bacterianas e virais. Foi, por razões da própria filosofia celular, um fracasso. Mesmo assim,
alguns clínicos ainda solicitam o “teste do NBT”. O resultado é expresso como no escore
das enzimas, só que na forma de índice (escore/100).
 COLORAÇÕES CITOQUÍMICAS DE INTERESSE NO
ESTUDO DA SÉRIE ERITROCITÁRIA

Diversos tipos de inclusões podem ser vistas em eritrócitos corados pelos corantes
panóticos. Além de parasitas como o plasmódio, as substâncias observáveis em extensões
de sangue periférico incluem ácidos nucléicos residuais (DNA e RNA), agregados de
mitocôndrias, ribossomos e partículas e ferro. A maioria das inclusões é visível na
coloração panótica usual. Algumas, entretanto, requerem colorações especiais. É o caso do
RNA residual, que pode ser corado (demonstrado) por corantes supravitais (novo azul de
metileno ou o azul de cresil brilhante), ou então dos precipitados de hemoglobinas
anormais, que são demonstráveis como precipitados de cristal violeta.

COLORAÇÃO PARA FERRO

A reação do azul da prússia precipita o ferro livre dos eritrócitos, em

pequenos grânulos azuis ou azul-esverdeados. Este ferro livre não é visualizável nas
extensões coradas por corantes panóticos. As formas celulares imaturas e maduras,
contendo ferro livre, são denominadas sideroblastos e siderócitos, respectivamente. Um
número aumentado de siderócitos é visto em doenças como a Talassemia “Major” ou em
pacientes pós-esplenectomizados. Se os grânulos de ferro circundam o núcleo do
eritroblasto, ele é denominado sideroblasto em anel ( ringer sideroblast ). Apesar da causa
mais comum de sideroblastos em anel ser o alcoolismo, eles também podem ser vistos em
anemias e em envenenamentos por chumbo.
 COLORAÇÕES CITOQUÍMICAS

Citoquímica
Aplicação de corantes bioquímicos a células do sangue e medula

óssea de maneira a refletir sua composição sem modificar apreciavelmente a sua
morfologia. As colorações citoquímicas são auxiliares diagnósticos importantes em doenças
hematológicas, principalmente nas leucemias.
Interessam-nos as colorações que possam esclarecer aspecto da fisiopatologia das
células do sangue e de seus precursores: mais precisamente aquelas que tenham valor
diagnóstico e/ou prognóstico.
As colorações citoquímicas incluem:

COLORAÇÃO PELO PAS (ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF)

Importante na citoquímica de carboidratos. Reações positivas incluem a presença de
glicogênio.
Presente nos neutrófilos maduros em altos níveis. As células blásticas granulocíticas
quase não possuem glicogênio. Passa a ser evidente a partir dos promielócitos e aumenta
com a maturação.

Fundamento
O ácido periódico oxida carboidratos à aldeídos, que reagem com o reativo de
Schiff para liberar um produto corado.

Reação
oxidação
Grupamento 1, 2 glicol (-CHOH -CHOH) -------- ------
Dialdeído
Dialdeído + Reativo de Schiff ---------
Coloração rósea

Interpretação:
A cor produzida varia entre púrpura e magenta brilhante, nos sítios onde se
encontram os carboidratos oxidáveis.

Distribuição em células hematopoiéticas normais:

- Leucócitos polimorfonucleares: reação intensa, difusa, corando de rosa ou

vermelho. Presente nos neutrófilos maduros em altos níveis.
 - Monócitos: reação fraca, levemente rósea.
- Plaquetas: cora intensamente.
- Precursores granulocíticos: reação aumenta à medida em que as células se
diferenciam. As células blásticas granulocíticas quase não possuem glicogênio.
Passa a ser evidente a partir dos promielócitos e aumenta com a maturação.
- Precursores eritróides: não se coram.
- Megacariócitos: reação difusa intensa.
- Linfócitos: algumas vezes apresentam reação fraca sob a forma de finos
grânulos.

Neoplasias Hematológicas:

Leucemia Mielóide Aguda (LMA):

- M1 e M2: negativo.
- M3: Leucemia Promielocítica Aguda, com uma leve coloração difusa com ou
sem grânulos finos dispersos.
- M4 e M5: em geral negativo e algumas vezes positiva em grânulos finos.
- M6: eritroleucemia, apresenta PAS intenso. PAS em precursores eritróides.
ocorrem na Eritroleucemia, LMA e Síndrome Mielodisplásica e, algumas
vezes, em Talassemias.
- M7: positividade difusa e granular, com grânulos grosseiros na periferia.

Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) : variabilidade na atividade PAS. A maioria

dos casos apresenta pelo menos alguns blastos com grânulos grosseiros ou blocos
PAS positivos. As LLAs, classificação FAB L3, são negativas.

SUDAN BLACK B
Para detecção de lípides celulares. As células hematopoéticas contém lípides
finamente dispersos em seu citoplasma, lípides complexos como lipoproteínas na
membrana celular e nas membranas das mitocôndrias e na de outras organelas.

Fundamento:
O Sudan Black cora uma variedade de lipídios, incluindo gorduras neutras,
fosfolípides e esteróis.
A reação baseia-se na habilidade do corante, solúvel em gordura, se dissociar de seu
solvente e penetrar no complexo lipoprotéico.

Interpretação:
Uma coloração positiva é indicada pela presença de grânulos citoplasmáticos
negros.

Distribuição em células hematopoiéticas normais:

- Leucócitos polimorfonucleares: reações positivas.
 - Monócitos: reações variáveis.
- Plaquetas: cora intensamente.
- Precursores granulocíticos: reação aumenta à medida que as células se
diferenciam. É fortemente positiva a partir dos promielócitos e aumenta com a
maturação. Nos mieloblastos podem ser vistas granulações finas e escassas.
- Precursores eritróides: o conteúdo de lípides é muito pequeno em relação
aos neutrófilos (1:400).
- Linfócitos: Reação negativa.
- Eosinófilos: uma fraca coloração delimita as granulações específicas.
- Basófilos: positividade aumentada nas leucemias.

Neoplasias Hematológicas:

Leucemia Mielóide Aguda (LMA)

- M1 e M2: positivo.
- M3 e M4: fortemente positivo.
- M5 e M7: negativo.
-

ENZIMAS:
Desempenham um papel muito importante na fisiologia leucocitária. As enzimas
estão associadas, nos granulócitos, às estruturas granulares e intervêm nos processos de
fagocitose e morte dos microorganismos. Cumprem, em geral, funções de hidrólise e
oxidação.
Mecanismos de coloração:

Substrato ---------------- corante precursor ------------------ coloração final

Enzima Captador

Dentre as principais enzimas demonstráveis citoquimicamente nos granulócitos,

temos:
- Alfa-1, 4- glicosidase
- Aril sulfatases
- Esterases
- Fosfatase ácida
- Fosfatase alcalina
- Lipase ácida
- Mieloperoxidase
- Proteases

1) FOSFATASES:
 São enzimas largamente distribuídas nos tecidos dos mamíferos. A classificação em
ácida e alcalina se deve ao pH de sua atividade ótima. Sua determinação se baseia na
formação de precipitados de fosfatos orgânicos por elas hidrolisados.

FOSFATASE ALCALINA

Fundamento:
A enzima é identificada por meio de sua ação hidrolítica sobre um substrato que
apresenta o grupo naftol-fosfato. O grupo naftol é liberado e, em seguida, captado por um
sal de diazônio (Fast Blue BB), resultando na formação de um precipitado corado, no sítio
da atividade enzimática.

Reação:
fosfatase alcalina
Substrato (naftol fosfato) --------------------------- naftol (aril naftolamida) + sal diazônico
(Fast Blue BB) ------------------- corante insolúvel.

Resultados:
Classifica-se a intensidade do corante precipitado em 100 neutrófilos segmentados e
bastonetes, com um score variando de 0 a 4+, somando-os.
0- Negativo, sem grânulos;
1- Positivo, com poucos grânulos;
2- Positivo, com moderados grânulos;
3- Fortemente positivo, com numerosos grânulos;
4- Fortemente positivo, com grânulos densos em todo o citoplasma.

Interpretação:
< 15: LMC;
> 120: Reação leucemóide, metaplasia mielóide, policitemia Vera;
Reação fraca ou ausente: Hemoglobinúria Paroxística Noturna.

FOSFATASE ÁCIDA

Fundamento:
Hidrolisa ésteres naturais ou sintéticos de fosfato, liberando o ácido ortofosfórico
em meio ácido (pH 4,5 a 6,0). É uma hidrolase importante no processo de ataque e morte de
microorganismos fagocitados e atua, juntamente com a fosfatase alcalina, no processo de
defesa primária.

Distribuição em células hematopoéticas normais:

- Neutrófilos: Reação menos intensa que a da fosfatase alcalina;

- Monócitos: Intensamente positiva;
 - Linfócitos: Pequena atividade porém, os linfócitos T exibem intensa
positividade na região do Golgi, enquanto as células B podem ser positivas ou
negativas.
-

2) ESTERASES:
As esterases permitem a distinção entre células da série monocítica e série
neutrofílica, utilizando-se diferentes substratos. As esterases inespecíficas utilizando o
substrato α-naftil acetato é fortemente positiva em monócitos e fraca em neutrófilos.

Fundamento:
A esterase leucocitária hidrolisa um substrato sintético, um éster derivado do
naftaleno (α-naftil acetato). Um composto naftol é liberado e se liga rapidamente a um sal
diazônico (pararosanilina), resultando em um precipitado colorido, próximo à atividade da
enzima.

Reação:
esterase
R-CO-R’ + H2O ----------------------- RCOOH + R’OH
Éster carbônico Ácido carbônico Álcool

Ésteres de naftol têm sido usados predominantemente em citoquímica de esterase

porque o naftol liberado se junta com uma amina diazotada apropriada para dar um azo
corante:

Reação de captação:
esterase
Naftol do éster de --------------------- Naftol + sal +H2O --------Azo corante
ácido carbônico de diazônio

ESTERASES ESPECÍFICAS (CAE):

Fundamento:
A enzima esterase específica, dentro dos granulócitos, hidrolisa o substrato naftol
cloroacetato. O substrato hidrolisado é captado pelo sal diazônico (pararosanalina),
formando um precipitado corado fora do sítio de atividade enzimática.

Interpretação:
Coloração vermelha no citoplasma dos granulócitos e mastócitos teciduais.

ESTERASES INESPECÍFICAS:
ANAE- α-naftil acetato esterase;
ANBE- α-naftil butirato esterase;
 NASDA Esterase- naftol SA-D acetato esterase.

Distribuição das Esterases Inespecíficas em Células Hematopoéticas Normais:

- Monócitos, macrófagos, megacariócitos e plaquetas: reação positiva
intensa;
- Basófilos;
- Plasmócitos;
- Linfócitos T: reação focal (em bloco);
- Eritroblastos: reação fraca;
- Inibição pelo fluoreto: monócitos, megacariócitos, plaquetas e plasmócitos;
- Fluoreto resistente: linfócitos e granulócitos.

3) MIELOPEROXIDASE:
É uma enzima lisossômica, localizada em grânulos azurófilos (primários) de
neutrófilos e em grânulos de eosinófilos e monócitos. Útil no diagnóstico diferencial das
LMA e LLA.

Fundamento:
As peroxidases são enzimas que catalizam a oxidação de substratos específicos
(fenóis, ácidos aromáticos e outros) na presença de peróxido de hidrogênio. Na
citoquímica, utilizam-se corantes como substratos que, ao serem oxidados, originam um
derivado colorido no local da atividade enzimática. São utilizados como indicadores da
atividade desta enzima, a benzidina e os derivados benzidínicos.

Reação
Peroxidase + H2O2 -----
H2O + ½ O2 ----
Benzidina ------------- complexo
(citoplasma da célula) (incolor) oxidação (corado)

Interpretação:
Uma reação positiva para MPO é indicada pela presença de grânulos que variam de
castanho-esverdeado à quase negro.

Distribuição de Peroxidase em Células Hematopoéticas Normais:

Positiva:
- Série granulocítica neutrofílica e eosinofílica: a partir do estadio de
promielócitos até as formas segmentadas. Presença de reação discreta em mieloblastos;
- Série granulocítica basofílica: reatividade até o estadio de metamielócito;
- Série monocítica: reação fraca com grânulos dispersos.

Negativa:
- Eritrócitos;
- Linfócitos;
- Megacariócitos;
- Basófilos maduros: reação negativa ou quase negativa.
Neoplasias hematológicas

Negativa:
- LLA;
- LMA–M7.

Positiva:
- LMA-M1: Positiva em mais de 3% dos blastos;
- LMA-M2: Positiva em mais de 85% dos blastos;
- LMA-M3: Positiva em mais de 85% dos blastos, de elevada intensidade,
recobrindo toda a célula.

Variável:
- LMA-M4 e M5: os precursores monocíticos são algumas vezes fracamente
positivos e, freqüentemente, negativos. Na LMA-M4, o componente mielóide
é peroxidase negativa.
- LMA-M6: precursores eritróides negativos e precursores granulocíticos
positivos.

Deficiência Hereditária de mieloperoxidase:

Deficiência em todos os neutrófilos e monócitos, mas os eosinófilos não são
afetados.

REAÇÃO DE PEARLS PARA FERRO

Fundamento:
O ferro da hemossiderina é liberado pelo ácido diluído. A combinação do ferro
inorgânico com ferrocianeto de potássio, em solução ácida, forma ferricianeto férrico de
coloração azul da prússia.

Reação:
4 FeCl3 + 3 K4Fe(CN)6 --------------
Fe4[Fe(CN)6]3 + 12 KCl

Resultados:
A localização da partícula de ferro corado em azul na medula óssea pode ser intra e
extra-celular. O ferro intra-celular está localizado dentro de siderócitos, sideroblastos e
macrófagos.

Interpretação:
a) Pela quantidade de ferro (ausente, normal e aumentada);
b) Pelo tamanho da partícula (grande ou pequena);
c) Pela distribuição dos grânulos (sideroblastos em anel ou normais).
 TERMINAL DEOXINUCLEOTIDIL TRANSFERASE (TdT):
A terminal deoxinucleotidil tranferase é um marcador para populações linfóides
primitivas. A enzima é derivada do núcleo e é observada em células pré-B e linfoblastos
T, mas ausente em linfócitos B maduros.

Fundamento:
Anti-corpo de cabra anti-coelho marcado com isotiocianatode fluoresceína (FITC) é
incubado com a amostra. A atividade da TdT no núcleo é indicada pela presença de
fluorescência na célula.

Interpretação:
Atividade TdT positiva:
LLA de Células T e pré-B
Linfomas
50% das leucemias indiferenciadas
30% das LMC em crise blástica
5% das LMA

PEROXIDASE (método de GRAHAM mod.):

SOLUÇÃO I
Benzidina purificada --------------------------------------- 0,3 ml
Álcool etílico ------------------------------------------------ 99,0 ml
Juntar 1 ml de solução saturada de nitroprussiato de sódio (3,6%), que deve ser conservada
em frasco escuro, a 4ºC.

SOLUÇÃO II
H2O2 (10 v) -------------------------------------------------- 0,1 ml
(2 gotas padronizadas)
H2O destilada ----------------------------------------------- 10,0 ml
Preparar no momento do uso

Colocar cerca de 1,0 ml da solução I sobre extensões sangüíneas (obtidas logo após
a coleta e sem o uso de anticoagulante); deixar fixar por 3 minutos; adicionar igual volume
de solução II (sobre as lâminas) e deixar durante 5 minutos; decantar, lavar delicadamente
com água corrente; secar ao ar e contracorar com corante panóptico.

Interpretação: Os grânulos apresentam uma coloração que varia do amarelo-

esverdeado ao marrom.
 FOSFATASE ALCALINA EM LEUCÓCITOS
(técnica de KAPLOW)

1) SOLUÇÃO FIXADORA
Formol -------------------------------------------- 10 ml
Álcool metílico ---------------------------------- 90 ml
Acertar pH para 7,2 e guardar em geladeira.

2) TAMPÃO SOLUÇÃO ESTOQUE

Propanol em solução 0,2 M
2-amino, 2-metil, 1, 3-propanodiol -------------------------- 1,8 g
H2O dest. -------------------------------------------------------- 100 ml
Guardar em geladeira

3) TAMPÃO SOLUÇÃO EM USO

Propanol em solução 0,05 M, pH = 9,75
Tampão solução estoque ------------------------------------------------- 50,0 ml
HCl 0,1 N ----------------------------------------------------------- + ou - 2,5 ml
H2O dest. q.s.p.----------------------------------------------------------- . 200 ml
Guardar em geladeira

4) SUBSTRATO
(deve ser preparado imediatamente antes do uso pH= 9,5)
Tampão solução de uso -------------------------------------------------- 17,5 ml
Alfa-naftil fosfato de sódio ---------------------------------------------- 17,5 mg
Fast Blue (sal diazônico) ------------------------------------------------- 17,5 mg
Filtrar o substrato diretamente sobre a lâmina

Técnica:
a- fixar extensões, secas ao ar, por 30 segundos, em temperatura + ou – de 5ºC;
b- lavar em água destilada por 10 segundos;
c- incubar com substrato por 10 minutos, em temperatura ambiente, no escuro;
d- lavar em água destilada por 10 segundos; secar;
e- contracorar com verde de malaquita, por 20 segundos

VERDE DE MALAQUITA
Verde malaquita 2% -------------------------------------------------- 0,01 ml
Água destilada --------------------------------------------------------- 10 ml

Obs.: Também pode ser corado com Hematoxilina de Mayer ou Hematoxilina Carazzi (de
1 a 2 minutos). Grânulos marrons.
Referências: Kaplow, L. S.; Blood 10: 123, 1955; Amer J. Clin. Path. 39: 439, 1963.
 SUDAN BLACK (método de SHEEHAN)
1) FORMALDEÍDO 37%

2) SOLUÇÃO ESTOQUE DE SUDAN BLACK

Sudan Black ------------------------------------------------------- 0,3 g
Etanol absoluto --------------------------------------------------- 100 ml
Agitar, filtrar e envelhecer

3) SOLUÇÃO TAMPÃO
Cristais de fenol -------------------------------------------------- 16 g
Etanol absoluto --------------------------------------------------- 30 ml
Dissolver e acrescentar:
Na2HPO4 x 12 H2O ----------------------------------------------- 0,3 g
H2O dest. ----------------------------------------------------------- 100 ml

4) SOLUÇÃO CORANTE
Solução estoque de Sudan --------------------------------------- 60 ml
Solução tampão --------------------------------------------------- 40 ml
Filtrar após sucção - o corante é estável por 2 a 3 meses.

Técnica:
a- fixar as lâminas em vapor de formol por 10 minutos;
b- deixar em Jarra de Coplin por 60 minutos com a solução corante;
c- lavar em etanol a 70% por 2 a 3 minutos, para remover o excesso de corante;
d- lavar em água;
e- contracorar com corante panótico. Grânulos verde-escuro ou negros.

P.A.S. (ÁCIDO PERIÓDICO DE SCHIFF)

Método de HOTCHKISS

REAGENTES:

1) SOLUÇÃO DE ÁCIDO PERIÓDICO

Cristais de ácido periódico ---------------------------------------------- 5,0 g
H2O dest. q.s.p. -----------------------------------------------------------.500 ml
Estocar a 4ºC – estável por 3 meses
2) REATIVO DE SCHIFF
H2O dest. em ebulição ---------------------------------------------------- 200 ml
Fucsina básica (B.D.H.) -------------------------------------------------- 1,0 g

Adicionar à água, a fucsina, tomando o cuidado para que não haja a formação de
bolhas de ar que poderiam extravasar o líquido.
Após dissolução, esfriar em água corrente até que a temperatura atinja cerca de
50ºC.
Adicionar 1,0 g de HCl concentrado, agitar e esperar esfriar à temperatura ambiente.
Transferir para frasco com rolha esmerilhada.
Adicionar 2,0 g de metabissulfito de sódio e agitar. Deixar em repouso, ao abrigo da
luz, durante 24 horas.
Adicionar 1,0 g de carvão absorvente (Norita). Agitar fortemente, esperar 30
minutos, e filtrar ( papel de filtro “Whatman”). O filtrado deverá ser incolor. Para isto,
adicionar 1,0 g de carvão e 2,0 ml de HCl . Filtrar novamente e armazenar a 4ºC em frasco
âmbar.

Obs.: Para se testar o reagente de Schiff, adicionar a ele algumas gotas de reagente
de formaldeído (37%). Imediatamente deve-se desenvolver uma cor púrpura-
avermelhada. Descartar se a cor desenvolvida for púrpura-azulada.

3) SOLUÇÃO SULFUROSA (remove excesso de reagente de Schiff)

H2O dest. ----------------------------------------------------------- 200 ml
Metabissulfito de sódio e potássio (0,5%) --------------------- 10 ml
HCl 1N -------------------------------------------------------------- 10 ml
Preparado no momento do uso

4) FIXADOR
Formaldeído (37%) ----------------------------------------------------- 10 ml
Álcool etílico absoluto ------------------------------------------------- 90 ml

Técnica:
a- fixar por imersão em mistura etanol-formaldeído (9:1) por 10 minutos;
b- lavar com álcool 70% por 30 segundos;
c- cobrir as extensões com ácido periódico por 15 minutos;
d- decantar; imergir em álcool 70% por 10 minutos;
e- lavar com HO dest. e secar bem;
f- imergir em reativo de Schiff por 30 minutos – manter ao abrigo da luz;
g- lavar com solução sulfurosa (se necessário);
h- lavar com H2O corrente (até a solução ficar límpida)
i- contracorar com hematoxilina de Mayer ou de Carazzi por 5 minutos, ou Verde de
Malaquita por 30 segundos.
j- lavar com água corrente e secar.
Resultado: Grânulos Vermelhos
 HEMATOXILINA DE CARAZZI OU MAYER

1) HEMATOXILINA DE CARAZZI
H2O dest. ------------------------------------------------------------ 400 ml
Glicerina ------------------------------------------------------------- 100 ml
Alúmen de K -------------------------------------------------------- 25,0 g
Iodeto de sódio ------------------------------------------------------ 0,1 g
Hematoxilina -------------------------------------------------------- 0,7 g
Misturar todos os reagentes, dissolver sem aquecer, filtrar, deixar envelhecer
durante dois meses em frasco escuro.

2) HEMATOXILINA DE MAYER
Hematoxilina ----------------------------------------------------------- 1,0 g
H2O dest. ---------------------------------------------------------------- 500 ml
Aquecer até ebulição e adicionar mais 500 ml de H2O.
Iodato de sódio --------------------------------------------------------- 0,2 g
Sulfato de potássio e alumínio --------------------------------------- 50 g
Estocar em frasco escuro à temperatura ambiente e filtrar antes do uso.

ESTERASE INESPECÍFICA
REATIVOS:

1) Na2HPO4 0,1M
Na2HPO4 ---------------------------------------------------------------- 7,09 g
H2O dest. ---------------------------------------------------------------- q.s.p. 500 mL

2) KH2PO4 0,1 M
KH2PO4 ------------------------------------------------------------------ 6,8 g
H2O dest. ----------------------------------------------------------------- q.s.p. 500 mL

3) MISTURA DE SUBSTRATO:
a) 100 mL de tampão pH 6,9
Na2HPO4 0,1M --------------------------------------------------------- 60 mL
KH2PO4 0,1 M ---------------------------------------------------------- 40 mL
 b) 5 mL de sal de naftol - AS – Acetato
Naftol - AS – Acetato --------------------------------------------------- 16 mg
Acetona ------------------------------------------------------------------- 3 mL
Propilenoglicol ----------------------------------------------------------- 2 mL

c) 0,2 g do sal de Fast Blue BB

Misturar a, b e c em um agitador magnético por 3 a 4 minutos e filtrar 50 mL da
mistura obtida, imediatamente antes do uso.
À outra parte, adicionar 0,075 g de NaF e filtrar.

Técnica:
- Fixar com vapor de formol por 10 minutos e secar ao ar;
- Incubar as extensões nas duas misturas (com e sem fluoreto) por 70 minutos, à
temperatura ambiente;
- Lavar delicadamente e secar ao ar;
- Contracorar com Hematoxilina de Harris.

Resultados:
Reação fortemente positiva nos monócitos, macrófagos, megacariócitos e plaquetas
(+++).
Neutrófilos: + a +++
Plasmócitos: ++ a +++
Linfócitos: a +
Eritroblastos: a +
Obs.: A presença do fluoreto inibe a reação positiva para a série monocítica.
Bibliografia: Daniel e cols., 1971.
DANIEL, M.T.; FLANDRIN, G.; LEJEUNE, F.; LISO, P.; LORTHOLARY, P.F.: Les
estérase spécifiques monocytaires: utilisation dans la classification des leucémies aigues.
Noure. Rev. Franç. Hemato, 11: 233-40, 1971.

COLORAÇÃO DO AZUL DA PRÚSSIA

Princípio:
A reação do Azul da Prússia emprega uma solução ácida de ferrocianeto para
demonstrar o ferro da parte não hemica que ocorre na forma de ferritina e hemossiderina
que são compostos que armazenam ferro. A ferritina é uma substância relativamente
homogênea composta por uma cápsula protéica (apoferritina) que rodeia um centro de
hidróxido de ferro. A composição da hemossederina é variável devido à incorporação de
lipídio, cálcio e cobre.
Comparando-se com a ferritina, a hemossiderina contém o dobro da quantidade de
ferro (40%). A ferritina é uma forma móvel de armazenamento de ferro, enquanto que o
ferro da hemossiderina é lentamente mobilizado. O ferro nos dois compostos é facilmente
identificado por ácidos diluídos que fornece o ferro iônico. Uma dessas reações é a
formação de um pigmento azul, o Azul da Prússia, que resulta da reação de íons férricos e
ferrocianeto.

Reagentes:
1) Fixador:Ácool metílico ou formol 40% - etanol 95% - 1:10;
2) HCl 10%
3) Ferrocianeto de Potássio 5% (armazenado em frasco âmbar e estável por 3
minutos);
4) Safranina 0,05 % ou vermelho neutro1% ou nuclear fast RED
Nuclear Fast RED ---------------------------------------------------------- 0,1 g
Sulfato de alumínio 5% --------------------------------------------------- 100 mL
Aqueça, filtre e adicione 1 g de Timol.
5) Corante: imediatamente antes do uso, misture partes iguais (250 mL) das soluções 2
e 3 e filtre a mistura em um jarro de Coplin.

Técnica:
1) Fixar a lâmina em formol – etanol por 1 minuto;
2) Enxaguar com água deionizada;
3) Corar com a mistura de ferrocianeto de potássio e HCl por 30 – 60 minutos, à
temperatura ambiente ou a 37ºC;
4) Enxaguar com água deionizada;
5) Contracorar com safranina por 5 minutos;
6) Lavar com água destilada,

Resultados:
O ferro da ferritina e da hemossiderina coram em azul, núcleos em vermelho e o
citoplasma em rosa.

Nota:
1) Toda vidraria e reagentes utilizados devem ser isentos de ferro;
2) Safranina, quando muito envelhecida, forma precipitados cristalinos.

Bibliografia:
SONNENWIRTH, A. C. & JARETT, L. – GRADWHOL’S Clinical Laboratory
Methods and Diagnosis – 8th ed. V. I. p. 765, 1980.