Dicas para o Desenvolvimento do Método Analítico por HPLC

 A eficiência da separação aumenta com a diminuição do tamanho da partícula da fase estacionária.

 Assimetria pode ter sua causa relacionada a mistura de mecanismos de retenção, incompatibilidade da
amostra com a fase móvel e/ou estacionaria e a existência de volume morto no topo da coluna.

 Fator de separação pode ser alterado por variações na FM e/ou estacionaria, temperatura, pH e força
iônica.

 Colunas cromatográficas de sílica: com silanois livres são mais acidas que as que possuem silanois
hidroxilados. Sílicas ácidas são boas para compostos ácidos e ruins para compostos básicos e vice-versa.
Sílicas comerciais e acidez:

Nunca utilizar FM com 100% de água, pois ela pode desativar a coluna, devido a sua alta polaridade e
afinidade com os grupos silanóis.
Nunca preparar FM com pH maior que 8 em colunas de sílica, pois elas se tornam solúveis.
Devido à alta polaridade é mais difícil separar compostos polares nesse tipo de coluna.

 Colunas C18 possuem fase estacionária apolar

Capeamento de colunas c18 (end-capping): colunas que reagiram com trimetilclorosilano para diminui
o rabeamento de picos.

 Fase Móvel: Fase Normal x Fase Reversa: na fase normal a fase estacionária é mais polar que a FM, já
na reversa é o inverso.
A retenção na fase normal aumenta com o decréscimo da polaridade da FM. É basicamente usada para
compostos neutros.
Moléculas menos polares (hidrofóbicas) são eluídas primeiro que moléculas mais polares (hidrofílicas)
na fase normal e o contrário ocorre na fase reversa.
Adicionar trietilamina na FM desativa silanóis mais reativos da FE, portanto melhora o formato do pico.
Na fase reversa a separação ocorre entre a interação não-polar do soluto e FE, ou seja a repulsão do
soluto pela FM.
Na fase reversa a maior quantidade de água da FM atrasa a saída do pico. Com a adição de solvente a
FM se torna mais forte acelerando a saída do pico. Agua (solvente mais fraco) < metanol < acetonitrila
< tetrahidrofurano
Nomografo para equivalência da força cromatográfica entre solventes:
 Separação de picos cromatográficos:
Fator de retenção (k): k pequenos (<1) significa que o composto interage pouco com a FE ou a
FM é muito forte e k grande (>5) o composto interage muito com a FE ou FM é muito fraca
causando alargamento do pico. Se k for pequeno a resolução aumenta rapidamente, se k
grande a resolução demora para aumentar.
O fator de retenção aumenta pelo aumento de água na FM, trocar a FE de C18 para C8
também, assim como o grau de acidez da sílica de diferentes fabricantes.

Fator de separação (α):