FACULDADE PANAMERICANA DE JI-PARANÁ

CURSO DE FARMÁCIA

ESTRESSE OXIDATIVO E ANTIOXIDANTES

Prof. Me. Jeferson de Oliveira Salvi

Ji-Paraná (RO)
 O ESTRESSE OXIDATIVO
 Estado de desequilíbrio no qual substâncias oxidantes excedem os sistemas de
proteção antioxidantes proporcionando a formação de ERO, incluindo os radicais
livres (RL).
Espécies reativas de Oxigênio (ERRO)
 OXIGÊNIO MOLECULAR
Indispensável para vida aeróbia
 [ ] provoca danos aos sistemas vivos

• Descreveu o papel dos radicais livres de oxigênio em

inúmeras doenças.
Rebeca Gerschman (1954)

Metabolismo intermediário - RL/ EAO

Toxicidade do oxigênio

JM McCord (1969/1972)
A CAIXA DE PANDORA

Denham Harman (1956)

• Descreveu os Radicais Livres como a “Caixa de Pandora”.

Por dano celular

Responsáveis Por mutagenese
Pelo envelhecimento
Mccord e Fridovich (1969)

 Descoberta da enzima SOD

 Salientam a importância dos radicais livres
 Sugerindo a SOD como potencial uso clínico (Orgoteina)

Dano sobre

Proteinas Lipídios DNA

 Mittal e Murad (1979)

• Primeiros trabalhos  efeito benéfico dos Radicais Livres sugerindo formação

O2•- H2O2

• OH

Estimulando
Ativação de guanilato ciclase  formando 2º mensageiro  GMPC

O radical NO  no controle do relaxamento da musculatura lisa vascular

 OH••
OH O22••
O LOO••
LOO

Lesão
Lesão
Proteção
Proteção tissular
tissular
contra
contra Antioxidantes Radicais Livres ee doença
doença
doença
doença
AÇÃO DA MELATONINA NA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA
GRAVE EM RATOS
RADICAIS LIVRES

Moléculas muito instáveis DANO HEPÁTICO

Alterações dos substratos energéticos
e do aumento da ativação de
enzimas geradoras de espécies
reativas de oxigênio (ERO) e
nitrogênio (ERN)

(Halliwell e Gutteridge, 2007; Trachootham et al., 2008)

 FÍGADO
 Devido as importantes funções que exerce, o fígado é suscetível a intoxicações
oriundas das mais diversas fontes:

Drogas Abuso de álcool Vírus Desconhecidas

A hepatoxicidade induzida por drogas é uma importante causa de insuficiência hepática aguda

(Nijoku, 2014;Tarantino et al., 2014)

INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA GRAVE

ESTRESSE
OXIDATIVO

Evolução
Lesão hepática Necrose celular sem rápida
Fígado normal
aguda grave regeneração evidente fulminante

• ALTERAÇÕES GRAVES DE COAGULAÇÃO

• ENCEFALOPATIAS
Mortalidade 85% dos casos
• COMA
(Lee et al., 2012; Bernal e Wendon, 2013; Panackel et al., 2015)
 ANTIOXIDANTES

Transferência de radicais de regiões mais

sensíveis para compartimentos
intracelulares onde existe menor prejuízo
caso o dano oxidativo ocorra.

3 moléculas antioxidantes para 1000

potencialmente produtoras de RL

(Sies, 1997; Lü et al., 2010)

MELATONINA

C13H16N2O2

N-acetil-5-metoxitriptamina (Hickman et al., 1999; Song et al., 2015)

MELATONINA
AFLOTOXINA CCL4

SEPSIS METAIS PESADOS

METÁSTASE

TAA
INSÔNIA

EFEITOS Marcadores sensíveis:

• SOD, CAT, GPx, GST, GSH

Antioxidantes • ALT, AST, PA, COX2,

• TNFα, NFκβ, iNOS, ICAM-1, IL-6, IL-1β

Inflamação
• ↑RNAm, LPO

(Verma et al., 2014; Jardim-Perassi et al., 2015)

TRANSPLANTES HEPÁTICOS NO BRASIL
2000
1800
1600
1400
nº transplantes

1200
1000
1723 1756 1809
800 1601
1413 1496
1334
600
977
400
200
0
2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015

(Associação Brasileira de Transplante de Órgãos, 2016)

JUSTIFICATIVA

Condição rara

Alta mortalidade

Distintos agentes etiológicos

Ausência de tratamento precoce

IHAG
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliar a sobrevivência dos ratos submetidos à administração de TAA e tratados
com Mel por meio da curva de Kaplan-Meier.
2. Verificar a integridade hepática através da análise das enzimas séricas: Aspartato
Aminotransferase (AST), Alanina Aminotransferase (ALT) e Fosfatase alcalina (FA)
em ratos tratados e não tratados com Mel.
3. Avaliar a peroxidação lipídica no tecido hepático por meio das substâncias que
reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) em ratos tratados e não tratados com
Mel.
4. Quantificar a atividade enzimática antioxidante no tecido hepático das enzimas:
Superóxido Dismutase (SOD), Catalase (CAT), Glutationa Peroxidase (GPx) e
Glutationa Transferase (GST) em ratos tratados e não tratados com Mel.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS

5. Quantificar a presença dos metabólitos do Óxido Nítrico em ratos tratados e não

tratados com Mel.

6. Verificar as alterações histológicas no tecido hepático por meio da coloração de

hematoxilina e eosina em ratos tratados e não tratados com Mel.

7. Quantificar a expressão imuno-histoquímica das proteínas iNOS, NF-κB e TNF-

α, em ratos tratados e não tratados com Mel.
TIOACETAMIDA
CH3CSNH2 CH3CONH2 (acetamida)

CH3CSONH2
(Tioacetamida S-óxido)

CYP2E1
Dano
tecidual
CH3CSNH2
(Tioacetamida S-Dióxido)

Ligação covalente

(Hajovsky et al., 2012; Koen et al., 2013)

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL - 24 HORAS
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL - 48 HORAS
 ANIMAIS
Ratos machos Wistar (±250 g)
A água e a ração ad libitum,
Ciclo 12 h claro/escuro (18-22ºC) 56 animais foram randomizados em oito grupos (n=7)

0h 8h 8,5h 24h 36h 48h

E24h E24h
1D Mel 2D Mel 3D Mel E48h
E48h E48h
1D TAA 2D TAA Morte Morte

TAA = 400 mg/Kg/animal (i.p.)

Mel = 20 Mg/kg por animal em 5 uL de etanol (1%) e em 0,5 ml de NaCl (0,9%) (i.p.)
MATERIAIS E MÉTODOS

Sobrevivência Integridade hepática

AST, ALT e FA
Kaplan-Meier (Labtest®)
MATERIAIS E MÉTODOS
Proteínas totais e lipoperoxidação Atividade Antioxidante

TBARS (Buege e Aust, 1978) SOD (Mirsa e Fridovich, 1972)

Bradford (1979) CAT (Boveris e Chance, 1973)

GPx (Flohe e Gunzler, 1984)

Metabólitos do Óxido Nítrico

GST (Mannervik e Gluthenberg,1981)

Reação de Gries (Granger et al., 1999)
MATERIAIS E MÉTODOS

Avaliação
Imunohistoquímica
Histológica

Hematoxilina
TNF-α, iNOS, NF-κB
Eosina (200X)
AÇÃO DA MELATONINA NA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA
GRAVE EM RATOS
CURVA DE KAPLAN-MEIER

• A partir da 39ª hora

Óbitos somente no
experimento de 48 horas

Diferença significativa
(p<0,001) entre as curvas de
sobrevivência dos grupos
TAA e TAA+Mel
Tabela 1. Concentrações séricas das enzimas hepáticas aspartato aminotransferase
(AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (FA) para o
experimento de 24 horas.

Enzimas CO CO+Mel TAA TAA+Mel

AST (U/L) 36,12 (±7,38) 41,66 (±5,12) 415,98 (±32,18)* 258,56 (±22,64)#

ALT (U/L) 21,85 (±2,04) 24,64 (±3,46) 265,48 (±8,49)* 62,48 (±5,15)#

FA (U/L) 15,03 (±0,95) 16,99 (±1,81) 56,62 (±2,03)* 23,59 (±1,83)#

Os dados estão expressos como média (±erro padrão). *Aumento significativo em relação aos grupos CO e CO+Mel
(p<0,001). #Diminuição significativa em relação ao grupo TAA (p<0,001).
PROTEÍNAS TOTAIS
p<0,0001
p<0,01
25 p<0,01
p<0,0001
# #
20

15
mg/mL prot

10 * *

0
24h 48h
CO CO+Mel TAA TAA+Mel
PROTEÍNAS TOTAIS
 A redução das proteínas totais se deve à ação dos metabólitos reativos da TAA, óxido
e dióxido de tioacetamida, que induzem a disfunção dos hepatócitos.

Diminuição Mel
da síntese
proteica

Estresse EFEITO HEPATOPROTETOR

metabólico

Manutenção ou resistência da
Aumento integridade proteica
de ALT,
AST, FA

(Colares, et al., 2016; Damm e Krameer, 2016 Esteban-Zubero et al., 2016)

LIPOPEROXIDAÇÃO

1,2
p<0,001 p<0,01 p<0,01
p<0,001
1,0
*
50% 40%
*
nmol/mg Prot

0,8

0,6 # #

0,4

0,2

0,0
24h 48h
CO CO+Mel TAA TAA+Mel
 LIPOPEROXIDAÇÃO
 A LPO pode desencadear a síntese e a proliferação das células estreladas
hepáticas em decorrência do estresse oxidativo.

Células de Kupffer ficam mais propensas à Os níveis de peroxidação lipídica foram

ativação
mais elevados no grupo TAA e reduzidos
Redução da cadeia de respiração em ambos os grupos tratados com Mel,
mitocondrial o que sugere o seu efeito protetor.

Cirrose por ligadura do ducto biliar (Colares et al., 2016)

Mel Hepatoxicidade induzida por amitriptilina (Taziki et al., 2015)
Cirrose por uso de tetracloreto de carbono (Rosa et al., 2010)
SOD
120 p<0,001
p<0,01 *
100 *
p<0,01
USOD/min/mg Prot

80 p<0,01
49%
59% #
60
#
40

20

0
24h 48h
CO CO+Mel TAA TAA+Mel
 ATIVIDADE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES
CITOSOL, MITOCÔNDRIA E EXTRACELULAR

GST

Detoxificação

CITOSOL E PEROXISSOMOS
CITOSOL, MEMBRANA CELULAR E MITOCONDRIA

↓ SOD, GPx, GST

Atividade
Mel antioxidante
↑ CAT
ATIVIDADE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES
 A lipoperoxidação decorrente da administração de TAA influencia no aumento
SOD dos níveis do ânion superóxido e na maior atividade da SOD detectada nos
grupos TAA

Reduziu SOD
Mel Citotoxicidade hepática induzida por frutose (Demirtas et al., 2015)

 Representam a primeira linha de defesa do sistema antioxidante.

SOD + CAT
 A redução da concentração da CAT, observada nos grupos TAA, é indício
do desequilíbrio redox e do consequente dano oxidativo celular.

Aumentou CAT Lesão de glândulas salivares e de agressão ao tecido testicular.

Mel (Karaer et al., 2016; Sokolovic et al., 2015)

Madhu et al., 2015; Sokolovic et al., 2015

ATIVIDADE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES

GPx e GST

 A enzima GPx oxida a forma reduzida da glutationa (GSH) para neutralizar

lipoperoxidação lipídica;

 GST utiliza GSH como substrato para detoxificação de compostos. (Halliwell, 2015)

Atividade antioxidante Diferentes doses, esquemas terapêuticos e

Mel
modelos de hepatoxicidade

Popov et al., 2015 Marroni et al., 2015 Esteban-Zubero et al., 2016

METABÓLITOS DO ÓXIDO NÍTRICO (NO2 E NO3)

p<0,001
p<0,001
50 60
45 * 55 *
45% 50 35%
40
45
35 749% 600%
40 #
30 35

mmo/L
mmol/L

#
25 30
20 25
15 20
15
10
10
5 5
0 0
CO Mel TAA TAA+Mel CO Mel TAA TAA+Mel
METABÓLITOS DO ÓXIDO NÍTRICO

Níveis aumentados de NO3/NO2 nos grupos TAA

Reduzidos quando da administração da Mel

Resultados anteriores evidenciaram a efetividade da Mel na redução dos níveis

de derivados de óxido nítrico

(Janjetovic et al., 2014) (Vinod e Jagota, 2016)

HISTOLOGIA - 24 HORAS
 Nos grupos CO e Mel, observa-se a
estrutura de um parênquima hepático
normal (A e B) evidenciado pela
presença de cordões de hepatócitos
bem definidos apresentando núcleos
corados.
 Em C observa-se a desorganização
tecidual promovida pelo grupo TAA.
 A necrose (Ne) presente é evidenciada
pela ausência dos núcleos em diversos
pontos;
 Os infiltrados inflamatórios (In)
indicam a migração induzida dos
leucócitos;
 Também se observa hemorragia (He).
HISTOLOGIA 48 HORAS
Grupos TAA

Desarranjo e perda organizacional

Lipoperoxidação

Instabilidade na membrana

Extravasamento do líquido intracelular

HISTOLOGIA

Efeito Manutenção da integridade das membranas celulares e

Mel das enzimas associadas à integridade hepática
hepatoprotetor

Shokrzadeh et al., 2014

Eficácia da Mel na proteção de
células hepáticas
Serikov e Lyashev, 2015

Zhou et al., 2016

↑↑↑ Hepatócitos normais e ↓↓↓ degeneração

Na reperfusão do fígado: ausência de necrose nos tecidos tratados com Mel

IMUNOHISTOQUÍMICA INOS - 24 HORAS
IMUNOHISTOQUÍMICA NF-ΚB - 24 HORAS
IMUNOHISTOQUÍMICA TNF-α - 24 HORAS
PROCESSO INFLAMATÓRIO

Resposta Estresse Oxidativo

inflamatória Inflamação
sistêmica
NF-B

NO

TAA
iNOS

TNF-α
IMUNOHISTOQUÍMICA
Grupos TAA Maior expressão de iNOS, NF-κB e TNF-α
Grupos TAA+Mel Menor expressão de iNOS, NF-κB e TNF-α

Mesmos efeitos observados para a Mel em outros modelos:

Czechowska (et al., 2015)

↓ TNF-α e NF-κB Luxán-Delgado (et al., 2016)

Oszoy (et al., 2016)

Kireev (et al., 2013)

↓ iNOS
Esteban-Zubero (et al., 2016)
ESTRUTURA DA MEL
Compartilhar elétrons com indol
COCH3 Prevenir reações pró-oxidativas
CH3O
Receber a adição eletrofílica

5 3 .
OH

Núcleo indol

Scavenger
Característica anfipática
(Tan et al., 2002; Rosen et al., 2006)
AÇÃO DA MELATONINA NA INSUFICIÊNCIA HEPÁTICA AGUDA
GRAVE EM RATOS
 OBJETIVOS
1. Sobrevivência dos ratos submetidos à
administração de TAA e tratados com
Mel por meio da curva de Kaplan-
Meier;
2. Integridade hepática: AST, ALT e FA em
ratos tratados e não tratados com Mel;
3. Peroxidação lipídica no tecido hepático
(TBARS) em ratos tratados e não
tratados com Mel;
4. Atividade enzimática antioxidante SOD,
CAT, GPx e GST em ratos tratados e
não tratados com Mel;
A MEL FOI CAPAZ DE:
1. Aumentar o tempo de sobrevida
dos animais;
2. Restabelecer as concentrações
séricas das enzimas relacionadas à
integridade hepática;
3. Reduzir a lipoperoxidação;
4. Diminuir a atividade das enzimas
SOD, GPx e GST, bem como,
aumentar a atividade da CAT;
 OBJETIVOS A MEL FOI CAPAZ DE:

5. Quantificar a presença dos metabólitos 5. Diminuir os níveis dos metabólitos

do Óxido Nítrico em ratos tratados e
do óxido nítrico;
não tratados com Mel.
6. Verificar as alterações histológicas no
6. Reestruturar a integridade do tecido
tecido hepático por meio da coloração
hepático;
de hematoxilina e eosina em ratos
tratados e não tratados com Mel.
7. Reduzir a expressão
7. Quantificar a expressão imuno-
histoquímica das proteínas iNOS, NF-κB imunohistoquímica dos marcadores
e TNF-α, em ratos tratados e não inflamatórios iNOS, NF-κB e TNF-α.
tratados com Mel.

Concluímos que a melatonina promoveu a proteção e a sobrevivência dos

animais submetidos ao modelo de IHAG, nos dois tempos estudados.
PERSPECTIVAS FUTURAS

O avanço nos estudos com a melatonina no modelo de IHAG induzida

por tioacetamida e sua interação com diferentes marcadores
inflamatórios e relacionados à morte celular, além do estudo dos
mecanismos moleculares de ação da melatonina contribuirão para
estreitar a relação bancada e leito hospitalar promovendo dessa forma a
translacionalidade
PERSPECTIVAS FUTURAS
AGRADECIMENTOS
UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL (ULBRA)
Laboratório de Estresse Oxidativo e Antioxidantes
jefersonsalvi@hotmail.com