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Bioquímica Clínica:
Automação em Bioquímica e
Controle de qualidade
Profª Valeska Sena
valeska_sena@hotmail.com
@acupuntura_valeskasena

Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

• Várias determinações realizadas no laboratório clínico são baseadas em

medições da energia radiante emitida, transmitida, absorvida, dispersa/
refletida em condições controladas.
Energia radiante é a quantidade de energia emitida por um
corpo sob a forma de fótons (J)

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Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

Tipo Exemplo
Absorção Absorção Atômica, densitometria, fotometria,
espectrofotometria, fotometria de reflexão,
espectroscopia de raio X
Emissão Espectrofotometria de emissão de chama, espectroscopia
de correlação de fluorescência (fcs), espectroscopia de
transferência de energia de fluorescência (fret),
fluorimetria, luminometria, fosforimetria, fluorimetria
com resolução temporal
Polarização Espectroscopia de polarização de fluorescência,
polarimetria
Dispersão Nefelometria, turbidimetria
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Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

• A quantificação de biomoléculas
✓ Impossibilidade de se trabalhar a olho nu ou microscopicamente

Observe os frascos de sangue coletados abaixo e responda: qual dos quatro pacientes é
diabético, ou seja, apresenta glicemia elevada mesmo em jejum?

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Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

• A quantificação de biomoléculas
– Impossibilidade de se trabalhar a olho nu ou microscopicamente
Concorda que é impossível saber quanto há de glicose em cada soro? Afinal, a presença de glicose não
altera o aspecto visual do soro in natura.
Para obter esse dado é preciso traçar uma estratégia...

Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

• A quantificação de biomoléculas
– Estratégia (ou princípio) para “ver” a glicose

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Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

• A quantificação de biomoléculas
– Estratégia (ou princípio) para “ver” a glicose
– Exemplo:
• Separadamente são adicionados em tubos de ensaio:
Reação de cor
Reagente específico Soro do paciente
proporcional à
para glicose que será analisado
glicose

– A reação colorimétrica é diretamente (ou inversamente) proporcional

– Quanto mais glicose, mais cor

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• A Espectrofotometria
– Transformando a intensidade de cor em valores numéricos:

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Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

• Espectrofotometria
• Medida da intensidade da luz em comprimentos de onda selecionados.
• Ou seja, o quanto uma substância química absorve a luz, quando
um feixe de luz passa através da solução da amostra.

“A quantidade de luz
absorvida ou transmitida é
proporcional à concentração
da substância em solução.

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Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

• Espectrofotometria
• Baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda
entre o ultravioleta e o infravermelho

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Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

TRANSMITÂNCIA X ABSORBÂNCIA
Transmitância é a fração
Absorbância exprime a
da energia luminosa que
fração da energia luminosa
consegue atravessar uma
que é absorvida por uma
determinada espessura de
determinada espessura de
um material, sem ser
um material. Ou seja, a
absorvida. Ou seja, a
capacidade de absorver a
capacidade de transmitir a
luz.
luz.

• Transmitância e absorbância são complementares.

• A soma dessas grandezas (para a mesma energia e comprimento de onda
incidente) é aproximadamente igual a 1, ou 100%. Então, se 90% da luz é
absorvida, então 10% é transmitida.
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• A Lei de Lambert “A concentração de uma substância é diretamente proporcional à

quantidade de luz absorvida ou é inversamente proporcional ao
logaritmo da luz transmitida"

A = a.b.c

Onde:
A = absorbância
Johann Heinrich Lambert
a = constante de proporcionalidade definida
como absortividade;
b = caminho luminoso em centímetros e
c = concentração do composto absorvente,
geralmente expressa em gramas por litro

Demonstração da lei de Beer:

Atenuação de um laser de luz verde
numa solução de rhodamine 6B

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Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

• Instrumentação
Os instrumentos modernos isolam uma faixa estreita de comprimentos de onda do
espectro para as medições.

(a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora (e) cubeta contendo
solução, (f) detector, (g) leitor.
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• Padrão Branco
• Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma cubeta, parte da luz sofre
refração, reflexão, absorção pelos reagentes e outras interações indesejáveis.

• Para eliminar tais interferências, deve-se zerar o aparelho com uma solução que é
denominada “branco”.

• O branco deve conter todos os constituintes do sistema (solvente), exceto a

amostra a ser estudada.

• A cada conjunto de determinações, bem como após alterar o comprimento de

onda, o aparelho deve ser sempre zerado e calibrado com o branco.

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• Padrão Branco

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• 1º - um bloco opaco substitui a cubeta, de modo que nenhuma luz atinja a

fotocélula, e o leitor é ajustado para a leitura de 0% T
• 2º - um branco de reagente é inserida e o leitor é ajustado para a leitura
de 100% T (absorbância zero)
• 3º - Amostra

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• Turbidimetria e Nefelometria
– Técnicas analíticas que são usadas para medir a luz dispersa.
– Quantificação de proteínas séricas em fluidos, LCR, PCR,
Imunglobulinas, Apoliproteínas....
A dispersão da luz é um fenômeno físico que resulta da interação da luz
com partículas em solução.

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• Fatores que influenciam na dispersão da luz incluem:

– 1) Tamanho da partícula;
– 2) Dependência do comprimento da onda;
– 3) Distância de observação;
– 4) Efeito da polarização da luz incidente;
– 5) Concentração das partículas;
– 6) Massa molecular das partículas;

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• Turbidez e Concentração
• Redução da transparência de uma amostra devido a presença
de partículas em suspensão que interferem a passagem de luz
pelo fluido.
• Quanto mais turva, mais concentrada.

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Turbidimetria
• Mede a luz não dispersa determiinando a turbidez da amostra.
• Pode medir a absorbância.

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Nefelometria
• Detecção de energia de luz dispersa ou refletida em direção a um detector
que não se encontra na trajetória direta da luz transmitida.
• Mais sensível, pois mede a luz em vários ângulos de 45 e 90º

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Usadas em conjunto para aumentar a sensibilidade

Turbidimetria
Luz incidente Luz não
dispersa
Lâmpada
Amostra Luz dispersa

Neflometria

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• UNIDADE DE MEDIDA – NTU

• Unidade de turbidez nefelométrica que caracteriza a turbidez

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Bioquímica Clínica: Controle de qualidade

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Bioquímica Clínica: Automação em Bioquímica

• GRÁFICO DE LEVEY-JENNINGS
• Gráfico de controle em função do tempo ou número de corridas;
• Média ± DP obtido a partir de controles do próprio laboratório;
• 20 a 30 dosagens, sendo 1/dia
• A média obtida deve estar dentro dos padrões aceitáveis pelo fabricante
dos kits

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Referência:
Kricka et al. Técnicas Ópticas In: Tietz fundamentos de
química clínica e diagnóstico molecular. 7ª ed. Rio de
Janeiro : Elsevier, 2016, Cap. 9.

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