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JournalofThermalBiolo
gy69(2017)76-84

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Journal of Thermal Biology

página inicial da revista: www.elsevier.com/locate/jtherbio

O controle epigenético da expressão cyp19a1a é crítico para a masculinização da

tilápia do Nilo induzida por altas temperaturas
Yi Ya Wanga,1Li Xue Suna,1, Jia Jie Zhuc,1Yan ZhaoaHui Wang, Hui WangaHong Jun Liub,
Xiang Shan Jia,⁎
a
Faculdade de Ciência e Tecnologia Animal, Universidade Agrícola de Shandong, Taian 271000, China
b
Instituto de Pesquisa em Biologia Marinha da Província de Shandong, China
c
Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture, Guangxi Institute of Fisheries, Nanning 530021, China

A R T I C L EIN F
A B S T R A C T
O
Em fish espécies com determinação sexual dependente da temperatura (TSD) ou determinação sexual genotípica
Palavras-chave: mais tem- peratura effects (GSD + TE), a temperatura pode tanto affect sexo di fferentiation ou determinar o
Tilápia do sexo. Entretanto, não se sabe se o controle epigenético da expressão cyp19a1a é crítico para a masculinização
Nilo
induzida por altas temperaturas na água doce fish tilápia do Nilo. Analisamos os níveis de metilação do DNA
Inversão de
cyp19a1a em três grupos etários e descobrimos que eles eram menores nas fêmeas do que nos machos. Aos 8
temperatura
Sexo meses de idade, os homens tinham níveis de metilação de DNA do promotor cyp19a1a que eram quase duas
Cyp19a1a vezes mais altos do que os das fêmeas. A exposição a altas temperaturas aumentou os níveis de metilação do
Expressão da DNA do promotor cyp19a1a de 30,87 ± 4,56% para 48,34 ± 0,92% (P = 0,035) nas fêmeas e de 50,33 ± 7,38%
proteína de para 51,66 ± 4,75% nos machos (P = 0,867). Os aumentos nos níveis de metilação do DNA cyp19a1a pró-
metilação de DNA motriz foram associados aos níveis de expressão do mRNA e podem desempenhar um papel no gonadal pró-
motriz differentiation no grupo de fêmeas induzidas por altas temperaturas em direção ao caminho dos machos.
A análise da mancha ocidental revelou que os níveis de expressão da proteína cyp19a1a nas fêmeas
significantly diminuíram após tratamento a altas temperaturas; apenas um ligeiro declínio foi registrado nos
machos fish. Estes resultados revelam que o controle epigenético da expressão do mRNA cyp19a1a e da
proteína cyp19a1a está relacionado com a temperatura ambiental e as relações sexuais em fish com TSD ou
GSD + TE.

1. Introdução períodos termossensíveis (TSP) também resultam em mudanças na

Os peixes são animais poikilotérmicos (de sangue frio); são
amplamente distribuídos e apresentam uma ampla faixa de tolerância
à temperatura (Ospina- Alvarez e Piferrer, 2008). Alterações
relativamente marcantes da tempera- tura ocorrem durante o
desenvolvimento embrionário em ambientes extremos, o que poderia
explicar o importante papel da temperatura na terminação sexual e
differentiation em fish. De acordo com o papel da temperatura na
determinação do sexo, os mecanismos de determinação do sexo em
fish podem ser amplamente classified como genotípico (GSD),
temperatura (TSD), ou genotípico mais temperatura effects (GSD+TE)
(Valenzuela et al., 2003; Valenzuelaetal., 2004; Ospina-Alvareze
Piferrer,2008; Bachtrog et al., 2014). O first evidência de TSD em fish
espécie foi obtida no Silverside Atlantic, Menidia menidia (Conover e
Kynard, 1981). As espécies de peixes com TSD apresentam uma
resposta de proporção de sexo à temperatura dentro da faixa de
temperatura durante o desenvolvimento na natureza (RTD) e não têm
cromossomos sexuais (Ospina-Alvarez e Piferrer, 2008). How- ever,
artificially temperaturas altas ou baixas durante a fase crítica
relação sexual em muitos fish. Estes fish são classified como GSD +
TE. Para TSD ou GSD + TE fish, uma temperatura alta ou baixa pode
sobrepor-se ao genético original influences e mudar para um novo
caminho de sexo differentiation quando a gônada for undifferentiated
(Tessemaetal.,2006).
Durante a determinação do sexo e differentiation em espécies fish,
existem consideráveis differences na expressão gênica entre os dois
sexos (Taoetal.,2013), resultando na razão androgênio/estrogênio
different. Independentemente do sistema de determinação do sexo, a
razão androgênio/étrogênio em vertebrados não-mamíferos
determina se um undifferentiated gonad differentiates sexualmente
em um testículo ou ovário (Navarro-Martín et al., 2011). Portanto,
fadrozole (uma aromatase no hibidor) e 17β-estradiol (E2) são
freqüentemente usados para induzir a inversão sexual na tilápia
(Afonso et al., 2001; Kobayashi et al., 2003; Kobayashi et al., 2008; Leet
et al., 2011; Gennotte et al., 2014). O citocromo P450 aromatase,
codificado por cyp19a1a, catalisa a conversão de tes- tosterona para
17β-estradiol e geralmente de andrógenos para estrogênios
(Guiguenetal.,2010;Gohinetal.,2011; SheneWang,2014). Se

⁎
Autor correspondente.
Endereço de e-mail: xsji@sdau.edu.cn (X.S. Ji).
1
Contribuiu igualmente.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jtherbio.2017.06.006
Recebido em 7 de abril de 2017; Recebido na forma revisada em 11 de junho de 2017; Aceito em 18 de junho de 2017
Disponívelonline21Junho de 2007
0306-4565/©2017ElsevierLtd. Allrightsreserved.
 JournalofThermalBiol

cyp19a1a expressão e síntese são inibidas, a produção de estrogênio é machos), foi leptada a frio pelo Shandong Freshwater Fisheries Research
bloqueada (Guiguenetal.,1999). Durante a masculinização induzida Institute (Jinan, Shandong, China) e criada em 3tanques de 40 m na
por altas temperaturas na tilápia do Nilo, muitos estudos anteriores Universidade Agrícola de Shandong (Taian, Shandong, China). O fish
mostraram que a expressão cyp19a1a e outros genes relacionados ao foi alimentado
sexo (por exemplo, foxl2 e sox9) foram alterados
(D'Cottaetal.,2001a,2001b,2007, 2008; Poonlaphdecha et al., 2013;
Vernetti et al., 2013; Li et al., 2014; SheneWang,2014).
Nos últimos anos, mecanismos epigenéticos, como a metilação do
DNA e a história modifications, têm sido implicados na complexa reg-
ulation da expressão cyp19 (Zhang et al., 2014). Zhang et al. (2013)
sugeriram que os mecanismos epigenéticos envolvendo a metilação do
DNA e a desactilação e desacetalização da história affect cyp19a1a
expressão e impulsionam mudanças sexuais naturais na enguia
ricefield (um protóginoso her- maphrodite fish). Em 2011, Navarro-
Martín et al. descobriram que a exposição de undifferentiated larvas
de robalo a altas temperaturas aumentou os níveis de metilação
promotora da cip19a tanto em fêmeas quanto em machos, ao ditar que
a metilação do DNA desempenha um papel importante na conexão da
temperatura ambiental e relações sexuais em espécies fish com
mecanismos de determinação sexual GSD + TE (Navarro-
Martínetal.,2011).
A tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), uma água doce fish, é a
terceira aqüicultura mais importante fish depois da carpa e do salmão,
e os machos crescem significantly mais rápido do que as fêmeas. Foi
realizada uma pesquisa substancial sobre o desenvolvimento de
abordagens de controle sexual na tilápia do Nilo. A tilápia do Nilo é
uma determinação sexual GSD + TE fish, e tem um sistema de
determinação sexual XX/XY que pode ser substituído pela alta
temperatura (masculinizando effect acima de 32 °C) (Baroiller et al.,
1995). O período sensível para tratamento a altas temperaturas se
estende de 10 dias pós fer- tilização (dpf) (reabsorção vitelina-sac) a 25-
30 dpf (formação de uma cavidade ovariana ou de um duto
intratesticular efferent). Tratamento de alta temperatura aplicado após
eclosão (~10 dpf) e que dura de 10 a 28 dias significantly aumenta as
proporções masculinas (Abucayetal.,1999;Baras etal.,
2001;BaroillereD'Cotta,2001; Baroilleret al., 2009; Dang etal.,2001;
Tessemaetal.,2006; Rougeotetal.,2008). Portanto, o controle térmico do
sexo na tilápia do Nilo é um método econômico e ambientalmente
amigável (Martínez et al., 2014). O genoma inteiro da tilápia do Nilo
foi sequenciado em 2012 (http://www.ensembl.org; Or- enil1.0
GCA_000188235.1). A tilápia do Nilo é um bom modelo para estudar
os mecanismos moleculares subjacentes ao TSD e ao GSD + TE. Para
entender melhor os papéis do controle epigenético da expressão de
cyp19a1a durante a masculinização da tilápia do Nilo induzida por
altas temperaturas, analisamos as mudanças de expressão
dependentes da metilação do DNA em cyp19a1a mRNA e níveis de
proteína na tilápia do Nilo. Hipotecamos que o controle epigenético da
expressão de cyp19a1a durante o tratamento a altas temperaturas
poderia affect síntese de estrogênio e inversão de sexo.

2. Materiais e métodos

2.1. Amostragem das gônadas de tilápia do Nilo em different ages

As tilápias do Nilo aos 4 meses (21,8-25,5 g), 8 meses (125,5-155,6 g)

e 1 ano (212,6-286,3 g) de idade foram obtidas de uma fazenda de
tilápias do Nilo (aldeia de Qiaogou, cidade de Taian, província de
Shandong) e criadas a 28 °C na base experimental da Universidade
Agrícola de Shandong por uma semana. De acordo com relatórios
anteriores (Liu et al., 1983) e histologia go- nadal, a gônada de uma
criança de 4 meses de idade fish utilizada neste estudo era imatura, e a
gônada de uma criança de 8 meses de idade e de 1 ano de idade fish
ma- curada. As gônadas de três fêmeas e três machos com idade de
different (4 meses, 8 meses e um ano) foram amostradas e congeladas
em nitrogênio líquido para extração de RNA e DNA.

2.2. Piscicultura e desenvolvimento familiar

A tilápia do Nilo de 18 anos de idade, de 3 anos (12 fêmeas e 6

7

alimento de tilápia granulada de tamanho apropriado duas vezes ao
dia. Após 2 semanas, as 18 tilápias foram divididas em seis grupos.
Cada grupo continha duas fêmeas e um macho, e foram cultivadas
em 3tanques de 20 m sob um fotoperíodo natural e temperatura da
água (23-29 °C). As bocas fish eram verificadas a cada 7 dias. Se
houvesse embriões na boca, eles eram removidos em artificially e
cultivados em aquários de 10-L como uma família independente.
Cada aquário 10-L tinha uma pedra aerante e a temperatura da água
era mantida a 28-29 °C.
JournalofThermalBiol
quantitativo em tempo real (qRT-PCR) foi conduzido em um sistema
de PCR em tempo real Mx3000p™. Os primers cyp19a1a qRT-PCR
foram projetados em Primer Premier 5.0, e as seqüências dos primers
são mostradas na Tabela S1. As reações quantitativas de PCR em
tempo real (20 μl) consistiram de 10 μl de SYBR

2.3. masculinização induzida por altas temperaturas

A masculinização induzida pela alta temperatura da tilápia do

Nilo foi realizada como descrito anteriormente
(BaroillereD'Cotta,2001; Tessemaetal.,2006;Lietal.,2014). Briefly, ~500
larvas a 10 dpf de cada família foram divididas igualmente em dois
grupos. Um grupo serviu como controle e estas larvas foram
cultivadas a 28 °C. O outro foi o grupo induzido pela alta
temperatura e estas larvas foram cultivadas a 36 °C durante 12 dias,
o que promove o desenvolvimento dos machos. A indução a altas
temperaturas foi realizada em duplicata. Depois disso, as larvas dos
grupos induzidos por altas temperaturas foram gradualmente
reaclimatadas a 28 °C. As larvas do grupo de controle e de alta
temperatura induzida foram então transferidas para 3tanques de 20
m e cultivadas sob temperaturas ambientes de água (21-30 °C) por
108 dias. O fish foi alimentado com alimento de tilápia granulada de
tamanho apropriado quatro vezes por dia. Três famílias no total
foram utilizadas para este estudo.

2.4. Amostragem

Com 120 dpf, o fish foi eutanizado e uma gônada foi processada
para sexo identification por microscopia ótica. A porcentagem de
homens em cada família foi determinada, e a família (F8) com a
maior porcentagem foi usada neste estudo. As gônadas de três
fêmeas e três machos de F8 fêmeas de controle (CF), F8 machos de
controle (CM), F8 fêmeas tratadas a alta temperatura (TF) e F8
machos induzidos a alta temperatura (IM) foram congelados em
nitrogênio líquido para extração de DNA e RNA.

2.5. Bisulfite seqüenciando PCR

Para rastrear o status de metilação de DNA do cyp19a1a,

realizamos bisulfite seqüenciando a PCR (BSP). Os primers BSP-PCR
projetados com MethPrimer são detalhados na Tabela
Complementar S1. A conversão bisulfite do DNA genômico gonad
extraído foi demonstrada com um BisulFlash™ TM DNA
Modification Kit (Epigenetik). O por- tion alvo foi amplified com
duas rodadas de PCR usando Takara Ex Taq (Ta- kara). Para o
promotor cyp19a1a, a PCR externa consistiu de 5 min a 94 °C; 25
ciclos de 40 s a 94 °C, 40 s a 51 °C, e 60 s a 72 °C e depois uma
extensão de 7 min a 72 °C em final. A subseqüente PCR externa
consistiu de 5 minutos a 94 °C com 30 ciclos de 40 s a 94 °C, 40 s a 55
°C, e 60 s a 72 °C e depois uma extensão de 7 minutos a 72 °C no
final. A PCR
Os produtos foram clonados no vetor pGEM®-T e transformados em
E. coli DH5α células competentes (Tiangen). Três fish por gene foram
utilizados e dez clones por fish foram selecionados aleatoriamente
para o seqüenciamento. O nível médio de metilação, o nível de
metilação observado em cada local de CpG e o nível de metilação
para cada padrão foram então computados. As taxas de conversão de
C, que não estão no contexto de um local CpG, foram calculadas em
todos os clones testados. A porcentagem média de citosinas
convertidas foi
95,94 ± 0,28% para o promotor cyp19a1a.

2.6. qRT-PCR

O RNA foi extraído das gônadas utilizando o reagente Trizol

(Tiangen) de acordo com as instruções do fabricante. O RT-PCR

7
 JournalofThermalBiol

Premix Ex Taq (2 ×), 0,4 μl de cada gene specific primer (10 nmol), 2 μl foram menores em homens de fe- do que em homens de 4 meses (P =
de cDNA, e 0,4 μl de corante de referência ROX ІІ. O procedimento de 0,008), 8 meses (P = 0,006) e 1 ano de idade (P = 0,104). Os machos de
PCR amplification foi o seguinte com uma desnaturação inicial a 95 °C 8 meses de idade em estágios
durante 30 s com 40 ciclos de 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 30 s, e 72
°C durante 30 s e depois
análise da curva de desassociação para determinar o alvo specificity. A
expressão EF-1α foi usada como um controle interno. Foram realizadas
três réplicas para cada gene e para cada indivíduo, e as intensidades
fluorescence de cada gene, medidas pelos valores do limiar do ciclo
(Ct), foram comparadas pelo método 2 −△△Ct(Livak e Schmittgen,
2001). A PCR specificity foi avaliada através da análise da curva de
fusão.

2.7. Preparação de anticorpos policlonais para cyp19a1a

Para obter os anticorpos policlonais para a tilápia do Nilo cyp19a1a,

uma região parcial ORF 1221-bp de cyp19a1a foi amplified usando
primers adequados (Tabela Suplementar S1), e os fragmentos de
amplified foram ligados em um vetor de expressão pET-28a(+).
Aplicamos então 0,5 M IPTG para induzir a expressão da proteína
recombinante cyp19a1a em E.coli BL21. A proteína recombinante
cyp19a1a era purified com uma coluna de cromatografia em gel de
agarose Ni2+ -NTA. Ratos Kunming brancos de oito semanas foram
injetados subcutaneamente com 100 µg de proteína recombinante para a
imunização primária. Duas injeções de reforço foram dadas com 50 µg
de proteína recombinante cada uma com o adjuvante incompleto de
Freund em intervalos de 2 semanas. Após três aumentos, a resposta
imunológica foi mon- itorada por ELISA (ensaio de imunoabsorção
enzimática). O anti-soro foi colhido dos ratos aos 10 dias após o
impulso de final.

2.8. Mancha ocidental

As gônadas de três fish em cada grupo (CF, CM, TF e IM) foram

solubilizadas em 900 μl de lise buffer contendo um coquetel inibidor
de protease PMSF (Beyotime) e sonicado em gelo. Após a adição de 4
× carregamento de SDS buffer em tubos, as amostras foram fervidas
por 2 min e eletroforadas em um gel de 12% de SDS-PAGE. As
proteínas foram transferidas foreticamente para uma membrana PVDF
(Solarbio). A imunodetecção de cyp19a1a foi realizada com os
anticorpos policlonais preparados, e o grupo de controle foi
imunodetectado por anticorpos beta-actina (Bioss cat. número: bs-
oo16R; 1 mg/1 ml) sob as mesmas condições, que foi seguido de
incubação com anticorpos secundários conjugados peroxidase-.

2.9. Análises estatísticas

Todos os dados são apresentados como o meio ± SEM. Os grupos

differences be- entre different foram determinados pela ANOVA
unidirecional seguida pelo teste Duncan usando o software SPSS (SPSS,
Inc., Chicago, Illinois). O differences entre todos os grupos foi
considerado significantly dif- ferent para P < 0,05.

3. Resultados

3.1. Cyp19a1a Metilação do DNA e mudanças na expressão do

mRNA em different grupos etários

Para entender a metilação do DNA differences do promotor

cyp19a1a entre imaturo e maduro fish e determinar um estágio
apropriado para analisar essas mudanças após o tratamento a altas
temperaturas, medimos os níveis de metilação do DNA cyp19a1a em
gônadas de tilápia do Nilo na faixa etária different. Primeiro, os
dinucleotídeos CpG no promotor cyp19a1a foram determinados
usando Methprimer. Seis di- nucleotídeos CpG na tilápia do Nilo
cyp19a1a promotora, localizada em -4, -13,
-40, -56, -190 e -198 relativos ao local de início da transcrição (TSS)
(Fig. 1), foram utilizados para análise BSP neste estudo. Os
resultados revelaram que os níveis de metilação de DNA cyp19a1a

7
 JournalofThermalBiol
Correspondentemente, o
cyp19a1a Os níveis de expressão do mRNA do gene cyp19a1a diminuíram
de 1,17 ± 0,39 para

Fig. 1. A posição de seis dinucleotídeos CpG na tilápia do Nilo cyp19a1a promotora. Os

seis dinucleotídeos CpG são destacados em vermelho, e suas posições em relação ao TSS
(tran- scription start site) são mostradas. O fator de transcrição (SF-1, CRE, e SOX) locais
de encadernação são previstos. SF-1: fator-1 esteroidogênico; CRE: elemento de resposta
cAMP; e SOX: caixa HMG relacionada ao SRY. (Para a interpretação das referências a
cores nesta legenda figure, o leitor é referido à versão web deste artigo).

tinha quase o dobro dos níveis de metilação de DNA do promotor

cyp19a1a como fêmeas (Fig. 2A, B). Em contraste, os níveis de
expressão do mRNA cyp19a1a foram significantly mais altos nas
mulheres do que nos homens nas três faixas etárias analisadas (Fig.
2C). Estes resultados são consistentes com o fato de que as fêmeas têm
um nível mais alto de aromatase do que os machos durante o
desenvolvimento. A análise dos níveis de metilação do DNA nas
posições de different CpG nas três faixas etárias analisadas revelou
que os níveis de metilação de dinucleotídeos CpG simples eram mais
altos nos homens do que nas mulheres nas posições de 50% CpG
(Tabela S2).
Com seis CpGs analisados no promotor da tilápia do Nilo
cyp19a1a, o número máximo de padrões possíveis de metilação foi de
64, ou seja, 2 6. Neste estudo, foram observados 17 padrões de
metilação, e a freqüência dos 17 padrões de metilação observados de
acordo com o sexo e a faixa etária são mostrados na Fig. S1. Os dois
padrões de metilação mais freqüentes foram analisados
posteriormente (Fig. 3); estes incluíram um com as duas últimas
posições não metiladas e o restante metilado, e um com o first e as
duas últimas posições não metiladas e o restante metilado. A análise
de variância (ANOVA) de ambos os padrões revelou significant
differences entre homens e mulheres nas três faixas etárias (P <
0,001).

3.2. Effects de alta temperatura em gonadal cyp19a1a Metilação de DNA

e níveis de expressão de mRNA

Como a tilápia do Nilo gonad na fase de 4 meses de idade é suffi -

cientificamente grande para extração de DNA e RNA, e há diferenças
notáveis na metilação do DNA promotor do cyp19a1a entre os sexos
nesta fase, fish na fase de 4 meses de idade de três famílias foram
lecionadas para sexo identification e para amostragem. O resultado
sexuado fish das três famílias é mostrado na Tabela 1. A porcentagem
de machos no grupo induzido por altas temperaturas da família F8 foi
de 97,7% (49,7% para o grupo de controle). Como resultado, as
gônadas de F8 fêmeas de controle (CF), F8 machos de controle (CM),
F8 fêmeas tratadas com alta temperatura (TF) e F8 machos induzidos
com alta temperatura (IM) foram usados para caracterizar a relação
entre o tratamento com alta temperatura e a expressão epigenética
con- trol de cyp19a1a. Os resultados mostraram que os níveis de
metilação no promotor de cyp19a1a aumentaram de 30,87 ± 4,56%
para 48,34 ± 1,92% nas fêmeas (P = 0,035) e de 50,33 ± 7,38% para
51,66 ± 4,75% em homens (P = 0,867) (Fig.4A, B).

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 JournalofThermalBiol

Fig. 2. Mudanças na metilação do DNA do cyp19a1a em different grupos etários. (A) Padrões típicos de metilação da tilápia do Nilo cyp19a1a promotora de fêmeas e machos nos grupos
etários de different, conforme observado neste estudo. Três fish por grupo foram usados para análise BSP e pelo menos dez clones de cada produto de PCR foram submetidos à análise da
seqüência de nucleotídeos. Cada linha horizontal representa uma molécula de DNA individual, e os círculos representam dinucleotídeos CpG. Os círculos preenchidos são CpGs
metilados enquanto os círculos abertos são CpGs não metilados. A seleção de moléculas individuais de DNA é baseada em sua freqüência de ocorrência em todos os clones seqüenciados.
(B) Mudanças de metilação de DNA de cyp19a1a em ambos os sexos em different grupos etários. O nível médio de metilação foi calculado como o número de locais de CpG metilados por
número total de locais de CpG em cada grupo. (C) A expressão mRNA muda de cyp19a1a em ambos os sexos em different faixas etárias. Different cartas indicam significant di fferences (p
< 0,05).

0,61 ± 0,03 nas fêmeas (P = 0,019) e de 0,68 ± 0,03 a temperaturas nas mulheres e na posição -40 nos homens (Tabela
0,31 ± 0,06 em homens (P = 0,042) após tratamento de alta S3).
temperatura (Fig. 4C). Considerando o importante papel do citocromo
P450 ar- omatase, codificado por cyp19a1a, na regulação da síntese de
esteróides sexuais, e os resultados de Navarro-Martín et al. (2011) no
robalo europeu, estamos convencidos de que as mudanças induzidas
por altas temperaturas na metilação do DNA e nos níveis de
expressão do mRNA em cyp19a1a desempenham um papel crítico
na masculinização da tilápia do Nilo induzida por altas
temperaturas.
A análise dos níveis de metilação de DNA em different posições de
CpG entre o grupo de controle e o grupo induzido por altas
temperaturas revelou que o tratamento a altas temperaturas aumentou
o nível de metilação de DNA de 50% de dinucleotídeos CpG (Tabela
S3). Além disso, os níveis de metilação de DNA nas posições -190, -
56 e -40 significantly aumentaram após o tratamento a altas

8
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Foram observados dezessete padrões de metilação de acordo com
o sexo e o tratamento de alta tem- peratura. A freqüência dos 17
padrões de metilação observados de acordo com o tratamento a altas
temperaturas e sexo são mostrados na Fig. S2. Os quatro padrões de
metilação mais freqüentes foram analisados posteriormente (Fig. 5).
A análise de variância (ANOVA) destes quatro padrões revelou
significant differences entre os grupos de controle e de alta
temperatura induzida em ambos os sexos (P < 0,05 ou P < 0,001).
Para o first e os dois últimos padrões de não metilação, o tratamento
a altas temperaturas significantly aumentou os níveis de metilação
do DNA em ambos os sexos (P < 0,001) (Fig.5B).

3.3. Expressão da proteína Cyp19a1a após tratamento a altas temperaturas

Os anticorpos policlonais para a tilápia do Nilo cyp19a1a foram

preparados através da imunização de ratos brancos Kunming com
expressa e purified

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 JournalofThermalBiol

Fig. 3. Frequência absoluta dos dois padrões de metilação do promotor cyp19a1a mais freqüentemente observados, de acordo com a idade e sexo. (A) Padrão de metilação com o first e as
duas últimas posições não metiladas e as restantes metiladas. (B) O padrão de metilação com as duas últimas posições não metiladas e as restantes metiladas.

Tabela 1 73,33% no ovário (Wenetal.,2014). Resultados similares também foram

O resultado sexuado de três famílias no grupo de controle e indução de alta temperatura. obtido em buffalo (Mongaetal.,2011). Cyp19a1a desempenha papéis
importantes no controle de fish sexo differentiation e determinação
(Baroiller
Temperatura
grupo
eD'Cotta,2001), e existem correlações negativas em significant...
FamilyControl
grupo
(28 °C) (36 °C) entre os níveis de metilação de DNA e a expressão de mRNA de cyp19a1a
Macho No. Feminino Total Macho No. Feminino No. Total (Navarro-Martínetal.,2011;Sietal.,2015). Como resultado, o differential
Não. sexua sexua cyp19a1a metilação promotora entre os sexos pode affect cyp19a1a
do do
expressão do mRNA e síntese de estrogênio. Havia significantly
No. No.

metilados no ovário (Contractor et al., 2004). No robalo europeu de um

As larvas no grupo induzido por altas temperaturas foram cultivadas a 36 °C durante 12 ano, os níveis de metilação de DNA do promotor cyp19a eram duas
dias a partir de 10 dias após a fertilização, e as larvas no grupo de controle foram vezes mais altos nas gônadas masculinas com- parelhas com as
cultivadas a 28 °C. femininas (Navarro-Martín et al., 2011). Em japonês flounder, 97,5% dos
CpGs promotores do cyp19a foram metilados nos testículos e
cyp19a1a proteína recombinante (Fig. S3). A detecção do título do
anticorpo policlonal anti-cyp19a1a do rato mostrou que os anticorpos
policlonais da tilápia do Nilo cyp19a1a eram reativos e positivos
quando a razão de diluição sérica era > 1:8000 (Tabela S4). A mancha
ocidental com anticorpos policlonais cyp19a1a preparados mostrou que
o nível de expressão de cyp19a1a era significantly mais alto nas
mulheres do que nos homens (P = 0,027), o que concorda com o
differences em cyp19a1a mRNA expres- sion entre os sexos. O
importante finding foi que o nível de expressão da proteína cyp19a1a
nas fêmeas significantly diminuiu após tratamento a altas
temperaturas (Fig.6). O nível de expressão da proteína cyp19a1a em
homens só diminuiu ligeiramente após o tratamento a altas
temperaturas.

4. Discussão

4.1. Differences em cyp19a1a níveis de metilação de DNA promotores entre

os sexos

Neste estudo, descobrimos que os níveis de metilação do DNA no

promotor cyp19a1a eram significantly mais altos nos homens do que
nas mulheres em todas as faixas etárias analisadas. Os níveis de
metilação do DNA do promotor cyp19a1a em homens de 8 meses de
idade foram quase duas vezes maiores do que nas mulheres da mesma
idade. Há muitos relatórios considerando os níveis de metilação de
DNA de cyp19a do differential entre os sexos. Por exemplo, o sexo -
specific differences sobre os níveis de metilação de cyp19a também
foram encontrados no modelo fish medaka, uma espécie GSD, onde
five CpGs localizados dentro de uma região de ~300 bp do promotor
cyp19a foram metilados principalmente em testículos, mas não são

8
 F2 68 58 126 108 20 128 níveis mais altos de estrogênio sérico nas fêmeas de tilápia do Nilo em
comparação com os machos
F8 88 89 177 177 4 181 (Sunetal.,2014), o que também foi o caso em japonês flounder (Si
JournalofThermalBiol
F9 36 44 80 42 38
entiação de fish gonad (Sunetal.,2014), sexo differentiation das
80 etal.,2015). Porque há papéis-chave do estrogênio no sexo differ-
gônadas poderia ser regulado através da metilação do DNA de genes-
chave, como o cyp19a1a, de forma semelhante à observada em outros
tecidos (Navarro- Martínetal.,2011).
No presente estudo, a expressão mRNA do cyp19a1a significantly
aumentou do estágio de 4 e 8 meses de idade para o estágio de 1 ano
de idade nas fêmeas de tilápia do Nilo, que era o oposto nos machos.
Tais resultados foram similares aos relatados anteriormente em
teleosts. Na truta, a expressão profiling durante o desenvolvimento
dos testículos revelou uma diminuição na expressão relativa de cyp19a
mRNA durante a maturação dos órgãos, atingindo um nível
indetectável na gônada totalmente madura (Delalande et al., 2015).
Embora os níveis de expressão do mRNA cyp19a1a mRNA entre
fêmeas e machos sejam mais significant nos grupos etários de
different, os níveis de expressão do mRNA cyp19a1a foram
significantly mais altos nas fêmeas do que nos machos na fase de 4
meses de idade. Além disso, a tilápia do Nilo com 6 meses de idade
amadureceu (Gómez-Márquez et al., 2003). Portanto, fish da F8 no
estágio de 4 meses de idade foram selecionados para a vestigação das
mudanças de expressão dependentes da metilação do DNA em
cyp19a1a na tilápia do Nilo após tratamento a altas temperaturas. Os
robalos europeus são geralmente maduros durante seu segundo ano
de vida (Valero et al., 2015), e fish de 1 ano de idade foi usado para
estudar o papel da metilação do DNA do promotor do cyp19a nas
mudanças de proporção de sexo dependentes da temperatura
(Navarro-Martínetal.,2011).

4.2. As altas temperaturas experimentadas durante a vida precoce na

tilápia do Nilo podem masculinizar as populações, aumentando os níveis
de metilação do DNA promotor cyp19a1a e diminuindo a expressão do
mRNA cyp19a1a

A atividade da aromatase e a concentração de estrogênio são

fundamentais para o desenvolvimento - trocas mentais para o
desenvolvimento de ovários ou testículos nas espécies fish, e a
diminuição da atividade da aromatase e da concentração de
estrogênio pelo tratamento com um inibidor de aromatase pode
resultar na reversão sexual das fêmeas em machos (Sunetal.,2014). A
aromatase é codificada por cyp19a1a, e também foi demonstrado que
o nível de cyp19a1a ex-pressão era consistente com os altos níveis de
atividade da aromatase

8
 JournalofThermalBiol

Fig. 4. Tratamento a altas temperaturas significantly alterou os níveis de metilação do DNA cyp19a1a e expressão do mRNA em ambos os sexos. (A) Padrões típicos de metilação da tilápia
do Nilo cyp19a1a promotora de fêmeas e machos em grupo de controle e tratamento de alta temperatura, conforme observado neste estudo. Três fish por grupo foram usados para análise
BSP e pelo menos dez clones de cada produto de PCR foram submetidos à análise da seqüência de nucleotídeos. Cada linha horizontal representa uma molécula de DNA individual, e os
círculos representam os dinucleotídeos CpG. Os círculos preenchidos são CpGs metilados enquanto os círculos abertos são CpGs não metilados. A seleção de moléculas individuais de
DNA é baseada em sua freqüência de ocorrência em todos os clones seqüenciados. (B) O tratamento a altas temperaturas significantly aumentou os níveis de metilação de DNA cyp19a1a
nas fêmeas. O nível médio de metilação foi calculado como o número de locais de CpG metilados por número total de locais de CpG em cada grupo. (C) O tratamento a altas temperaturas
significantly diminuiu os níveis de expressão do mRNA cyp19a1a em ambos os sexos. *Estatisticamente significantly di fference (p < 0,05).

e produção de estrogênio em muitas espécies fish (Guiguen et al.,

Em 2011, Navarro-Martín et al. relataram que as altas temperaturas em
2010). Como resultado, o cyp19a1a up-regulation pode acionar o
cyp19a1a de metilação de DNA de 37,1 ± 3,45% para
ovariano differentiation em teleosts, enquanto que seu down-
53,9 ± 3,49% nas fêmeas do robalo europeu, e de 77,0 ± 1,81% para
regulation induz à regulação testicular differentiation (Guiguen et al.,
85,3 ± 3,28% em homens (Navarro-Martín et al., 2011). Resultados
2010; Zhang et al., 2013). Poderia a temperatura ambiente affect a
similares de mudanças na metilação do DNA cyp19a após tratamento a
metilação do DNA e o nível de expressão do mRNA de cyp19a1a?
baixa e alta temperatura também foram relatados em jacarés (Alligator
Neste estudo, descobrimos que uma temperatura alta significantly
mis- sissippiensis) (Parrott et al., 2014). Neste estudo, também
aumentou o nível de metilação do DNA promotor do cyp19a1a de
descobrimos que o tratamento a altas temperaturas significantly
30,87 ± 4,56% para 48,34 ± 0,92% nas mulheres e de 50,33 ± 7,38%
diminuiu a expressão do mRNA cyp19a1a em ambos os sexos,
para 51,66 ± 4,75% nos homens. Este é o relatório first de altas
particularmente nas fêmeas. Enquanto isso, a porcentagem de homens
temperaturas affecting a metilação do DNA do promotor cyp19a1a em
no grupo de alta temperatura induzida por F8 é de
água doce fish.

8

Fig. 5. Freqüência absoluta dos quatro padrões de metilação do promotor cyp19a1a mais freqüentemente observados, de acordo com o sexo e o tratamento a altas temperaturas. (A) Padrão
de metilação com as duas últimas posições não metiladas e as restantes metiladas. (B) Padrão de metilação com o first e as duas últimas posições não metiladas e as restantes metiladas.
(C) Padrão de metilação com a terceira e quarta posições sem metilação e o restante sem metilação. (D) Padrão de metilação de todas as seis posições não metiladas.
Fig. 6. cyp19a1a expressão da proteína em gônadas de tilápia do Nilo diminuiu após
tratamento de alta tem- peratura. (A) Resultados da manchadura ocidental. (B) A
intensidade da banda quantification foi realizada no software Image J, e β-actin foi
usado como controle de carga (n = 3;
*P < 0.05). CM: controlar os machos; IM: machos induzidos por altas temperaturas; CF:
fêmeas de controle;
e TF: fêmeas tratadas a alta temperatura.
8
JournalofThermalBiol
significantly aumentou em comparação com o controle. Portanto, as
altas temperaturas experimentadas durante a vida precoce na tilápia
do Nilo podem masculinizar as populações aumentando os níveis de
metilação do DNA promotor cyp19a1a e diminuindo a expressão do
mRNA cyp19a1a. Além disso, descobrimos que as tendências de
mudança no nível de metilação do DNA cyp19a1a após o tratamento a
altas temperaturas concordam com as proporções de inversão sexual
na tilápia do Nilo ou no robalo europeu. No robalo, a redução de 15%
das fêmeas no grupo de alta temperatura muito próxima à mata- curou
o aumento de 16,8% nos níveis de metilação do promotor sb cyp19a no
mesmo grupo (Navarro-Martín et al., 2011). Neste estudo, a re-dução
de 47,4% de fêmeas no grupo de alta temperatura correspondeu ao
aumento de 56,5% nos níveis de metilação do promotor cyp19a1a na
mesma família. Entretanto, a alta temperatura não resultou em
inversão de 100% do sexo feminino para o masculino. Relatórios
anteriores indicaram que a reversão sexual induzida pela alta tem-
peratura das fêmeas genotípicas cujo nível de metilação do promotor
cyp19a1a cai acima de um certo limite (Navarro- Martínetal.,2011).
Portanto, embora algumas fêmeas genotípicas tratadas com alta
temperatura tenham tido um aumento nos níveis de metilação, elas
permaneceram fêmeas porque seu nível de cyp19a1a promotor me -
nível de metilação cai abaixo do limiar.
O desenvolvimento sexual é um processo regulador complexo que
envolve uma rede de genes, como o cyp19a1a (Angelopoulou et al.,
2012; Hattori et al., 2012;Chen et al., 2014; PradhaneOlsson,2014) e amh
(Anti-Müllerian Hormone) (Li et al., 2015). Parece que o cyp19a1a é um
gene downstream no caminho do sexo differentiation (Wangetal..,
 JournalofThermalBiol

2007); portanto, outros genes a montante provavelmente também pequeno declínio em machos, o que é consistente com a expressão de
desempenham papéis importantes na inversão do sexo induzido por mRNA obtida anteriormente profile na tilápia do Nilo (Poonlaphdecha
altas temperaturas em espécies fish. Recentemente, descobriu-se que a et al., 2013; Li etal.,2014). Nossos resultados demonstram ainda mais que
expressão mRNA de cyp19a1a (Navarro-Martín et al., 2011; a metilação do DNA
Poonlaphdecha et al., 2013), dmrt1 (Poonlaphdecha et al., 2013), amh
(Fernandinoetal.,2008), e outros genes do sexo-differentiation ( Li et al.,
2014) são alterados após a indução de altas temperaturas nas espécies
fish. Como o tratamento a altas temperaturas, estudos anteriores
descobriram que um grande conjunto de cDNAs (~ 3400) de carpas
exclusivas são affected a frio ( Gracey et al., 2004). A metilação de DNA
em todo o genoma muda nas gônadas de tilápia do Nilo após
tratamento a altas temperaturas - tified 89 e 65 genes, que exibiram
DMRs em seus corpos gênicos e promotores (Sun et al., 2016). Por
exemplo, o fator de transcrição cyp19a1a eb-b2 com status de metilação
inferior em IM foi comparado com CF, e o iniciador sexual masculino
gsdf com status de metilação inferior em IM foi comparado com CM.
Com o aumento do conhecimento sobre as correlações entre a
metilação do DNA com o ambiente e a expressão gênica nos
organismos (Varriale,2014;Sunetal.,2016), mais genes serão
encontrados para desempenhar papéis na inversão sexual induzida
por altas temperaturas em fish por epigenetic modifications.

4.3. As alterações de metilação do DNA do gonadal cyp19a1a affected por

alta temperatura podem ser conservadas em fish espécies

O estímulo do cyp19a1a por gonadotropinas em fish ou ovários de

mamíferos foi mediado principalmente pelo cAMP (Zhang et al.,
2013). Os locais de ligação me- thylated CRE e SF-1 após tratamento de
alta temperatura na tilápia do Nilo podem bloquear diretamente a
ligação de CREB e SF-1, atenuando - atingindo o estímulo effects dos
sinais de gonadotropina/cAMP em cyp19a1a (Zhang et al., 2013) e
posteriormente resultando na reversão sexual da tilápia fêmea do Nilo
em machos. Relatórios anteriores mostraram que a hipermetrotilação
do robalo cyp19a promotor do cyp19a suprimiu completamente tanto a
transcrição in vitro Foxl2- e/ou SF-1 estimulada (Navarro-
Martínetal.,2011). Isto sugere fortemente que a permetilação da tilápia
do Nilo cyp19a1a promotor impede a ligação de elementos de cis-ação
a seus respectivos locais, bloqueando a ativação transcripcional do
cyp19a1a. Por outro lado, a mecânica molecular - isms subjacente às
respostas de relação sexual à temperatura deve ser conservada em
espécies fish (Devlin e Nagahama, 2002). Nosso resultado e outros re
portos revelaram que alguns dos locais de ativação do fator de
transcrição, tais como CRE e SF-1/Ad4BP no promotor cyp19a1a, são
conservados em todas as espécies fish (Navarro-Martín et al., 2011;
Zhang et al., 2013). Portanto, a metilação do DNA e as mudanças de
expressão do mRNA do cyp19a1a af-fecionado pela alta temperatura
podem estar presentes pelo menos em outras espécies fish.

4.4. Effects de alta temperatura na expressão da proteína cyp19a1a

Estudos anteriores demonstraram que o tratamento a altas

temperaturas pode modular os níveis de mRNA ou de metilação de
DNA em algumas espécies fish, por exemplo, robalo europeu
(Navarro-Martín et al., 2011), tilápia do Nilo (D'Cotta et al., 2008;
Vernetti et al., 2013), alabote do Atlântico (van Nes e Andersen, 2006) e
pejerrey (Elisio et al., 2014). Entretanto, ninguém jamais analisou as
mudanças na expressão cyp19a1a no nível de proteína após tratamento
a altas temperaturas em fish. Como o nível de expressão do mRNA de
alguns genes não se correlacionou com seu nível de proteína
(BauernfeindeBabbitt,2017), é muito necessário analisar as mudanças
na expressão da proteína cyp19a1a após o tratamento a altas
temperaturas. Estudos anteriores de imunohistoquímica observaram a
imunoreatividade do cyp19a1a nas células intersticiais do ovário e
Dmrt1-defi- cient testes na tilápia do Nilo (Li et al., 2013), nas células
de Leydig e todos os tipos de células germinativas em zebrafish
(Hinfray et al., 2013), e cistos de células germinativas em truta
(Delalande et al., 2015). Neste estudo, descobrimos que os níveis de
expressão da proteína cyp19a1a foram significantly diminuídos em fe-
machos após tratamento a altas temperaturas, e eles exibiram um

8
 JournalofThermalBiol
cyp19a1a mRNA mediado, e mudanças de expressão de proteínas
estão provavelmente envolvidas na conexão entre a temperatura
ambiente e a inversão de sexo feminino para masculino na tilápia do
Nilo.

Conflicts de interesse

Os autores declaram não ter conflicts de interesse. Os

patrocinadores fundadores não tiveram nenhum papel na concepção
do estudo; coleta, análise ou interpretação dos dados; redação do
manuscrito; e decisão de publicar os resultados.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências

Naturais da China (31472270) para Xiang Shan Ji; Fundo de Prêmio
de Pesquisa para Jovens Cientistas Notáveis da Província de
Shandong (2014BSB01303) para Yan Zhao; Projeto de Raça Fina
Agrícola na Província de Shandong (coleta de recursos de
germoplasma, preservação e avaliação de animais econômicos
aquáticos) para Hong Jun Liu e Fundos do Programa "Double Tops"
de Shandong para Hui Wang.

Apêndice A. Informações de apoio

Dados suplementares associados a este artigo podem ser

encontrados na versão online em
http://dx.doi.org/10.1016/j.jtherbio.2017.06.006.

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