1.

Introdução

As proteínas são os maiores constituintes de toda célula viva, e cada uma delas,
de acordo com sua estrutura molecular, tem uma função biológica associada às atividades
vitais. [1]
Nos alimentos, além da função nutricional, as proteínas têm propriedades
organolépticas e de textura. Podem vir combinados com lipídeos e carboidratos. [1]
A tabela 1 apresenta a quantidade de proteína nos vários tipos de alimentos.

Tabela 1: Teor de proteínas em vários tipos de alimentos. [1]

Origem animal
Leite integral 3,5%
Carne assada 25%
Ovo integral 13%
Origem vegetal
Arroz integral 7,5% -9,0%
Arroz polido 5,2% - 7,6%
Farinha de trigo 9,8% - 13,5%

Os peptídeos e as proteínas são moléculas formadas por aminoácidos ligados

entre si por ligações peptídicas. Enquanto os peptídeos podem possuir de 2 (dipeptídeo)
até dezenas (oligopeptídeo) de resíduos, majoritariamente as proteínas contêm um
número próximo ou bastante superior a 100 aminoácidos.[2]
A maioria dos peptídeos de baixa massa molar não exibe estrutura secundária
definida quando dissolvidos em água (comportamento conformacional randômico). Tal
comportamento, porém, podem ser alterados em presença de proteínas, sais, detergentes
ou solventes orgânicos. Ao contrário, as proteínas apresentam estruturas secundárias e
terciárias bem definidas em soluções aquosas. Muitas também exibem estrutura
quaternária. [2]

1
 Os peptídeos podem atuar como neurotransmissores, toxinas, antibióticos,
adoçantes, substratos e inibidores de proteases, fatores liberadores de hormônios ou
hormônios. As proteínas desempenham funções variadas que vão desde as estruturais até
as metabólicas, passando pelas de defesa, motilidade ou de reserva. Essa enorme
diversidade funcional coloca os peptídeos e as proteínas em posição de destaque no
campo das aplicações biotecnológicas. [2]
Tal conhecimento gerou enorme interesse por estas biomoléculas e por
metodologias que levassem à sua produção, isolamento, purificação, identificação e
quantificação. Estas passaram a ser sistematicamente estudadas e aprimoradas. [2]
Em relação às metodologias empregadas, o procedimento mais comum para a
identificação de proteína é a determinação de um elemento ou de um grupo pertencente a
proteína. Os elementos analisados geralmente são carbono ou nitrogênio, e os grupos são
aminoácidos e ligações peptídicas. Entre os métodos de análise de grupos, destacam-se
os seguintes: (i) método por biureto, (ii) método por fenol, (iii) método por
espectrofotometria ultravioleta, (iv) métodos turbidimétricos, (v) método dye-binding e
(vi) métodos físicos. [1]

1.1 Método por fenol ou Follin-Ciocalteau-Lowry. [1]

Foi uma das primeiras determinações colorimétricas de proteína, realizada a partir

de 1912. O método de Lowry apresenta limite de detecção de 0,7 mg.L-1 e leituras de
absorbância em comprimento de onda 750 nm. Neste método, ocorre redução dos
constituintes ativos do reagente folin-fenol por meio das cadeias laterais de alguns
aminoácidos que contribuem com quatro elétrons ou pela retirada de dois elétrons de
cada unidade tetrapeptídica dos peptídeos e proteínas, que é facilitada pela formação do
quelato entre o cobre (II) e peptídeos/proteínas [3]. Após a reação acima ocorrer, a
solução desenvolve uma cor que será medida num colorímetro e comparada com uma
curva padrão.
Contudo, o método apresenta algumas vantagens e desvantagens, abaixo citadas
[1]:
Vantagens:

2
 (i) É de 10 a 20 vezes mais sensível que a determinação por UV, e 100
vezes mais sensível que o método por biureto.
(ii) É bastante específico, pois são poucas as substâncias potencialmente
interferentes, sendo a sacarose, em alta concentração, uma das poucas.

Desvantagens:

(i) É lento.
(ii) Destrói a amostra.
(iii) Operações múltiplas (muita manipulação).
(iv) Necessita de curva padrão com proteína conhecida.
(v) Necessita período de incubação entre a adição dos reagentes.
(vi) A intensidade da cor pode variar com a composição da proteína
hidrolisada.

1.2 Sobre o leite

Do ponto de vista biológico, o leite é o produto da secreção das glândulas

mamárias de fêmeas mamíferas [5]. Possui elevado valor nutritivo, sendo o único
alimento que satisfaz às necessidades nutricionais e metabólicas do recém-nascido de
cada espécie. [4]
Do ponto de vista físico, o leite é um fluido viscoso constituído de uma fase
líquida e partículas em suspensão, formando uma emulsão natural, estável em condições
normais de temperatura ou de refrigeração. É uma mistura homogênea de grande número
de substâncias (lactose, glicerídeos, proteínas, sais, vitaminas, enzimas, etc.), das quais
algumas estão em emulsão (a gordura e as substâncias associadas), algumas em
suspensão (as caseínas ligadas a sais minerais) e outras em dissolução verdadeira
(lactose, vitaminas hidrossolúveis, proteínas, do soro, sais, etc.).

3
 1.2.1 Proteínas do leite [5]

As caseínas e as proteínas do soro diferenciam-se (tabela 2) por sua origem e

características químicas.

Tabela 2: Concentração média de substâncias nitrogenadas (% nitrogênio total) do leite

de vaca.
Proteínas 95
Caseínas 76
αs1 30
α s2 8
β 27
κ 9
γ 2
Proteínas do soro 19
β-lactoglobulina 9,5
α -lactoalbumina 3,5
Soroalbumina bovina 1,0
Imunoglobulinas 2,0
Outras 3,0
Nitrogênio não-protéico 5
Peptídeos 0
Aminoácidos livres 0

4
 Outras substâncias 0

Do ponto de vista tecnológico, as diferenças mais destacáveis são:

(i) Sua solubilidade distinta a pH 4,6: as proteínas do soro são solúveis e as

caseínas não (esse pH é o ponto isoelétrico destas). Graças a essa
característica, fabrica-se iogurte, por exemplo, e podem separar-se
facilmente as duas espécies proteicas.
(ii) A capacidade de algumas proteases coagularem as caseínas e formar gel
(base da indústria de queijo), enquanto as proteínas do soro são insensíveis
à enzima.
(iii) A termorresistência das caseínas, que permite a esterilização do leite sem
que geleifique. As proteínas do soro se desnaturam pela ação do calor.
(iv) As caseínas formam partículas coloidais (as micelas), enquanto as
proteínas do soro encontram-se dissolvidas na fase aquosa do leite.

1.2.1.1 Micelas [5]

Já foi anteriormente citado, que no leite, as caseínas encontram-se sob a forma de

dispersão coloidal, formando partículas de tamanho variável. Essas partículas que
dispersam a luz e que, portanto, conferem ao leite sua cor característica, recebem o nome
de micelas. Cerca de 95% das caseínas formam partículas coloidais, ficando as restantes
molecularmente dispersas dentro do leite. A micela não é formada apenas por caseínas,
mas, em termos de extrato seco, aproximadamente 7% são componentes de baixo peso
molecular, e recebem o nome de fosfato coloidal. O tamanho e o número de micelas
estão inversamente relacionados; isto é, quanto menores são as micelas, maior é seu
número. A micela é uma partícula muito hidratada; calcula-se que para cada grama de
matéria seca pode haver 3 g de água.

1.2.2 Proteínas do soro

5
 Nas últimas décadas, numerosas pesquisas vêm demonstrando as qualidades
nutricionais das proteínas solúveis do soro do leite, também conhecidas como whey
protein. As proteínas do soro são extraídas da porção aquosa do leite, gerada durante o
processo de fabricação do queijo. Durante décadas, essa parte do leite era dispensada pela
indústria de alimentos. Somente a partir da década de 70, os cientistas passaram a estudar
as propriedades dessas proteínas [5].
Evidências recentes sustentam a teoria de que as proteínas do leite, incluindo as
proteínas do soro, além de seu alto valor biológico, possuem peptídeos bioativos, que
atuam como agentes antimicrobianos, anti-hipertensivos, reguladores da função imune,
assim como fatores de crescimento [5].
As proteínas do soro do leite apresentam uma estrutura globular contendo
algumas pontes de dissulfeto, que conferem certo grau de estabilidade estrutural. As
frações, ou peptídeos do soro, são constituídos de: β-lactoglobulina (BLG),
α-lactoalbumina (ALA), albumina do soro bovino (BSA), imunoglobulinas (Ig‘s) e
glicomacropeptídeos (GMP). Essas frações podem variar em tamanho, peso molecular e
função, fornecendo às proteínas do soro características especiais. Presentes em todos os
tipos de leite, a proteína do leite bovino contém cerca de 80% de caseína e 20% de
proteínas do soro [6].
Os sistemas de obtenção de proteínas do soro são diversos e a escolha de um deles
baseia-se na matéria-prima disponível e do grau de pureza desejado. Os principais
métodos empregados são: (i) precipitação ácida, (ii) coagulação enzimática ou (iii)
centrifugação [5].

2. Objetivos

(i) Aplicação do método a um material biológico: dosagem das proteínas do

leite.
(ii) Utilizar aparelhagem destinada a medir a concentração de substâncias pela
absorção da luz que atravessa as suas soluções.

6
 (iii) Construir um gráfico da absorbância em relação à concentração de uma
substância.
(iv) Fazer a regressão linear dos dados e avaliar o valor do coeficiente de
correlação.
(v) Utilizar o gráfico obtido para determinar a concentração da substância em
uma solução de teor desconhecido.
(vi) Calcular o fator de diluição de uma amostra.
(vii) Expressar o teor de proteínas em uma amostra em mg/mL; g/L e em %.

3. Metodologia utilizada

3.1 Equipamentos e reagentes

3.1.1 Instrumentação

Para a condução do procedimento experimental, foram utilizados os seguintes

instrumentos: aparelho de espectrofotômetro UV-VIS (BIOESPECTRO SP-220).

3.1.2 Reagentes utilizados

Os seguintes reagentes foram empregados:

(i) Ácido clorídrico (Reagentes Analíticos Impex).

(ii) Hidróxido de sódio (Reagentes Analíticos Impex), ambos de grau
analítico.
(iii) Reagente de Folin-Ciocalteau (Pró-Químios).
(iv) Solução de leite em pó 1%.
(v) Solução padrão de proteína (BSA 1 mg/mL).

7
 (vi) Solução A (solução de sulfato de cobre 1% (p/v)).
(vii) Solução B (solução de tartarato de sódio e potássio 2% (p/v)).
(viii) Solução C (2% de carbonato de sódio + 0,1 M hidróxido de sódio).

3.2 Preparo do reagente E

Em um béquer, colocou-se na seguinte ordem:

(i) 0,3 mL da solução A;

(ii) 0,3 mL da solução B;
(iii) 30 mL da solução C.

A mistura das soluções acima descritas foi denominada de reagente E.

3.3 Procedimento para dosagem de proteína utilizando o método Lowry.

Pipetaram-se de acordo com a tabela 3, diferentes volumes da solução padrão

BSA, água e amostra.

Tabela 3: Procedimento para dosagem de proteína utilizando método de Lowry.

Volume de
Incubar
solução Aguardar Reagente
Volume durante 10’ à
padrão Reagente 10’ a de
Tubo de água temperatura
BSA E temperatura Folin-Cioc
μL ambiente e ao
(1mg/mL) ambiente. alteau
abrigo da luz

1 0 200 2 mL - 200 μL -
2 40 160 2 mL - 200 μL -
3 80 120 2 mL - 200 μL -
4 120 80 2 mL - 200 μL -
5 160 40 2 mL - 200 μL -

8
 6 200 0 2 mL - 200 μL -

Para completar a tabela 3 acima, os seguintes passos foram seguidos:

(i) Com uma pipeta adicionou-se em todos os tubos 2 mL do reagente E.

Misturou-se e deixou-se em repouso a temperatura ambiente por 10
minutos.
(ii) Decorrido o tempo de incubação, adicionou-se 200 μL do reagente de
Folin-Ciocalteau. Agitação foi feita e fez-se a incubação durante 30
minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
(iii) Após o término da incubação, o aparelho de espectrofotômetro foi ligado
e ajustado na posição do filtro no comprimento de onda desejado (750
nm).
(iv) Inseriu-se na cela do fotocolorímetro uma cubeta contendo o branco, e o
aparelho foi zerado.
(v) Inseriram-se no aparelho as soluções padrões e a amostra. A anotação dos
valores de absorbâncias foi feita.

3.4 Preparo da amostra 1

A amostra 1 foi preparada, de acordo com os itens abaixo:

(i) Mediu-se 5 mL de leite e adicionou-se 45 mL de água em um béquer de

100 mL.
(ii) Ácido clorídrico 5 M foi acrescentado com uma pipeta de 2 mL até
ocorrer a coagulação do leite.
(iii) O volume de ácido gasto foi anotado.
(iv) O material obtido foi filtrado, sendo que o material retido no papel de
filtro foi descartado. O filtrado foi denominado de Amostra 1 sendo reservado para uso
posterior.

9
 3.5 Preparo da amostra 2

A amostra 2 foi preparada segundo o método abaixo:

(i) Foi feita a diluição do leite em 1/80 com água destilada (1 mL de leite +
79 mL de água). Sendo que essa amostra contêm todas as proteínas do leite.

3.6 Leitura das absorbâncias da amostra 1 e da amostra 2 pelo método de

Lowry

As leituras de ambas as amostras foram feitas seguindo o método abaixo

apresentado:

(i) Enumeraram-se três tubos de ensaio em duplicata e prepararam-se

soluções de acordo com os volumes estabelecidos pela tabela 4.

Tabela 4: Esquema para dosagem das proteínas do leite.

Amostra Amostra Reagente Reativo de
Tubo Água * **
1 2 E Folin-Ciocalteau

0 0,2mL - - 2 mL Sim 0,2mL Sim

1 - 0,2mL - 2 mL Sim 0,2mL Sim

2 - - 0,2mL 2 mL Sim 0,2mL Sim

*Agitar os tubos e deixar em repouso por 15’.

** Agitar os tubos e deixar em repouso por 30’ no escuro (dentro do armário).

(ii) O espectrofotômetro foi ligado, o aparelho foi zerado com o tubo branco.

10
 (iii) As leituras dos padrões e das amostras foram feitas no aparelho a
750 nm.
(iv) As leituras de absorbância obtidas foram anotadas.

4. Resultados e discussão

4.1 Construção da curva padrão

Esse procedimento foi baseado de acordo com a tabela 3 apresentada no interior

da seção metodologia utilizada. Dessa maneira, a partir de uma concentração conhecida
de proteína, foi possível construir esse tipo de curva padrão.
A construção da curva foi feita a partir de leituras feitas no aparelho de UV-VIS,
sendo que todas as leituras referentes a cada um dos tubos foi foram feitas em duplicatas.
Portanto, o gráfico obtido refere-se às médias desses valores. Tal gráfico foi gerado de
maneira a estabelecer uma relação entre concentração versus absorbância.

Figura 1: Curva de calibração para BSA em diversas concentrações.

Após o gráfico ter sido gerado, obteve-se a seguinte equação da reta obtida a
partir da linearização do mesmo:
𝑦 = (𝐴 + 𝐵) * 𝑋

11
Tal que:
𝐴 = 0, 04571

𝐵 = 0, 61457

E, para coeficiente de regressão linear:

𝑅 = 0, 99029

O que gerou um desvio padrão da reta, igual a:

𝑆𝐷 = 0, 03609

O coeficiente R de regressão linear revelou uma forte correlação positiva entre as

variáveis concentração versus absorbância observadas na figura 1, evidenciando desse
modo um ajuste bastante favorável para a reta.
Toda a análise matemática acima demonstrada, assim como também o gráfico
gerado foram obtidos da ferramenta gráfica computacional Origin, versão 6.1.

4.2 Teor de proteínas nas amostras

A leitura das amostras no aparelho de UV-VIS retornou os valores expressos na

tabela 5.

Tabela 5: Valores de absorbância obtidos das amostras 1, 2 e branco.

Amostras Absorbância 1 (u.a) Absorbância 2 (u.a) Média das absorbâncias
Branco 0 0 0
1 0,398 0,295 0,406
2 0,413 0,351 0,323

12
 A partir das médias de absorbância obtidas na tabela 5, foi possível estimar
numericamente a concentração de proteínas de cada uma das amostras 1 e 2. Esse
resultado foi obtido da equação demonstrada no item 4.1, a qual foi gerada da curva
padrão de proteína conhecida.
Portanto, de forma a obter a concentração, empregou-se:

𝑦
𝑥= (𝐴+𝐵)
𝑚𝑔/𝑚𝐿

Amostra 1:
𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 1 = 𝑥 = 0, 615 𝑚𝐿

Amostra 2:
𝑚𝑔
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 2 = 𝑥 = 0, 489 𝑚𝐿

A partir desses valores obtidos de concentração para cada uma das amostras,
considerou-se o fator de diluição aplicada a cada uma delas, de maneira a encontrar a
concentração de proteína existente nas soluções originais.

Dessa maneira, como fator de diluição é tal que:

𝑥
𝐹𝐷 = 𝑦

Onde:
𝐹𝐷 = 𝐹𝑎𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜.

𝑥 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎.

𝑦 = 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎.

13
 Amostra 1:

𝑥 = 5 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑖𝑡𝑒 + 45 𝑚𝐿 𝑑𝑒 á𝑔𝑢𝑎 + 4 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝐻𝐶𝑙 = 54 𝑚𝐿

𝑦 = 5 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑖𝑡𝑒 = 5 𝑚𝐿

𝐹𝐷 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 1 ~ 11

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑑𝑜 𝑠𝑜𝑟𝑜 = (𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 1) 𝑥 ( 𝐹𝐷 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 1)

(
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑑𝑜 𝑠𝑜𝑟𝑜 = 0, 615
𝑚𝑔
𝑚𝐿 ) 𝑥 (11)

𝑚𝑔 𝑔
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑑𝑜 𝑠𝑜𝑟𝑜 = 6, 756 𝑚𝐿
= 6, 756 𝐿

Amostra 2:

𝑥 = 1 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑖𝑡𝑒 + 79 𝑚𝐿 𝑑𝑒 á𝑔𝑢𝑎 = 80 𝑚𝐿

𝑦 = 1 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑖𝑡𝑒 = 1 𝑚𝐿

𝐹𝐷 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 2 = 80

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 𝑑𝑜 𝑙𝑒𝑖𝑡𝑒 = (𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 2) 𝑥 (𝐹𝐷 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 2)

(
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 𝑑𝑜 𝑙𝑒𝑖𝑡𝑒 = 0, 489
𝑚𝑔
𝑚𝐿 ) 𝑥 (80)

14
 𝑚𝑔 𝑔
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 𝑑𝑜 𝑙𝑒𝑖𝑡𝑒 = 39, 12 𝑚𝐿
= 39, 12 𝐿

4.2.1 Cálculo para teor de caseína

𝐶𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 = 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 1 − 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 2

𝐶𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 = 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑑𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 𝑑𝑜 𝑙𝑒𝑖𝑡𝑒 − (0, 9 𝑥 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑑𝑜 𝑠𝑜𝑟𝑜)

O fator multiplicativo de 0,9 em relação a quantidade de proteínas do soro,

refere-se a proporção existente entre as proteínas do soro e as proteínas totais do leite.
Isto é, para cada 1 litro de leite, 0,9 litros corresponde à quantidade de soro em solução.
Portanto, para teor de caseína na amostra:

𝑔
𝐶𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 = [39, 12 − (0, 9 𝑥 6, 765)] 𝐿

𝑔
𝐶𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 ~ 33, 0 𝐿

Em porcentagem, esse valor é expresso empregando-se regra de três simples:

39, 12 𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 𝑑𝑜 𝑙𝑒𝑖𝑡𝑒 − 100%

33 𝑔 𝑐𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎 − 𝑥

𝑥 = 84%

Sendo assim, na análise feita, 84% das proteínas totais do leite, constituem-se de
caseína. Contudo, tal valor obtido nesse relatório, entra em conflito com a informação
fornecida na tabela 2, onde se aponta que a caseína compõe 75% das proteínas totais do

15
leite. Desse modo, verifica-se que deve ter ocorrido algum erro não identificado durante a
prática, causando esse tipo de distorção de valores.

16
 5. Referências bibliográficas

[1] Cecchi, H. M. Fundamentos teóricos e práticos na análise de alimentos.

2º edição. Campinas: Editora da Unicamp, 2003.
[2] Júnior, P. A., Kilikan, B. V. Purificação de produtos biotecnológicos. Barueri:
Manole, 2005.
[3] Miwa, A. C. P., Falco, P. B., Calijuri, M. C. ‘Avaliação de métodos
espectrofotométricos para determinação de proteína em amostras de lagoas de
estabilização’. Engenharia sanitária ambiental. Vol.13 - Nº 2 - abr/jun 2008, 236-242.
[4] Sgarbieri, V. C. ‘Propriedades fisiológicas-funcionais das proteínas do soro de
leite’. Revista de Nutrição. Campinas, 17(4): 397-409, out./dez., 2004.
[5] Ordoñez, A. J. P. Tecnologia de alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2005.
[6] Haraguchi, F. K., Abreu, W. C., Paula, H. ‘Proteínas do soro do leite:
composição, propriedades nutricionais, aplicações no esporte e benefícios para a saúde
humana’. Revista de Nutrição. Campinas, 19(4): 479-488, jul./ago., 2006

17