1- INTRODUO

O leite um alimento imprescindvel tanto para a alimentao de crianas quanto de adultos

pois constitui uma importante fonte dos mais variados tipos de nutrientes (protenas, lipdeos,
carboidratos, sais minerais, vitaminas sobretudo D e as do complexo B). Mesmo no sendo um
alimento completo, o leite um dos alimentos que mais se aproxima de tal, devendo estar livre de
qualquer tipo de contaminao, seja por microorganismos patognicos, seja por substncias estranhas
sua constituio normal.
O leite obtido a partir do bere saudvel sob condies sanitrias adequadas e com a aplicao
de boas prticas higinicas contm relativamente poucos microrganismos, mas no raro, pode tornar-
se contaminado tanto no momento da ordenha quanto nas demais aes executadas durante o seu
processamento. O leite cru se constitui em um excelente meio nutritivo para o crescimento de
microrganismos que nele encontram condies timas de multiplicao, tornando-se sensvel tanto
deteriorao microbiana quanto ao desenvolvimento de microrganismos patognicos.
O leite ao sair do bere, j contm inibidores naturais termolbeis com ao bacteriosttica
conhecidos como lacteninas, dentre os quais se encontram anticorpos, complemento C, lisozimas,
lactoferrinas, xantino-oxidase, sistema lactoperoxidase, dentre outros. Mesmo assim, no sentido de
controlar a multiplicao microbiana e retardar o aparecimento de alteraes provocadas pelos
microorganismos, substncias inibidoras tm sido adicionadas ao leite, mesmo sendo sua utilizao
proibida segundo o RIISPOA (artigo 514). O uso de inibidores ou conservantes alm de proibido,
desnecessrio, pois os mesmos resultados podem ser obtidos atravs da adoo de prticas de higiene
durante a produo de leite aliadas a uma refrigerao adequada. Os principais produtos
inibidores/conservantes adicionados intencionalmente ao leite so os antibiticos, o perxido de
hidrognio e o formol.
Em muitos casos, porm, a contaminao do leite com antimicrobianos se d de forma
involuntria, como consequncia, por exemplo, do tratamento de vacas em lactao com problemas
de mastite, metrite ou outras doenas infecciosas, alm do tratamento contra mastite no perodo
seco. Nesses casos, deve-se respeitar o perodo de carncia recomendado pelo fabricante do
antibitico, durante o qual o leite das vacas em tratamento deve ser descartado por apresentar
resduos acima dos limites permitidos. O perodo de excreo de antibiticos no leite varia de produto
para produto, dependendo do tipo de preparao, da dose administrada e da via de aplicao,
podendo chegar a at 7 dias. Vacas tratadas devem ser ordenhadas separadamente, devendo-se evitar
o uso de ordenhadeira mecnica, pois mesmo que o leite seja recolhido separadamente, pequenos
volumes retidos nas tubulaes ou nos recipientes coletores so suficientes para contaminar com
antibitico grandes volumes de leite.
A importncia da presena de resduos de inibidores no leite se refere no somente s questes
ligadas a sade publica, na medida em pode induzir resistncia bacteriana aos antibiticos (alterao
da flora bacteriana intestinal), problemas alrgicos, distrbios dentrios, anemias, etc, mas envolve
tambm aspectos econmicos relacionados a fabricao de produtos derivados em laticnios. A
presena de inibidores no leite, mesmo em quantidades pequenas, so capazes de provocar a inibio
do crescimento e da atividade de culturas lcteas, prejudicando a fabricao de queijos e leites
fermentados, ocasionando grandes perdas para o setor. O processo de pasteurizao tem pouco ou
nenhum efeito sobre o contedo de antibiticos do leite, e diferentes antibiticos apresentam
diferentes percentuais de resistncia aos tratamentos trmicos.
A nica substncia inibidora de microorganismos cujo uso permitido pela FAO, em
quantidades controladas, o perxido de hidrognio (H
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). Isso feito em pases onde o clima
quente e o perodo de transporte do leite longo. Contudo, essa prtica no aceita na maioria dos
pases, inclusive no Brasil, pois dentre outras desvantagens de natureza fsico-qumica, essa prtica
consiste em um empecilho para adoo de melhorias das condies higinico-sanitrias nas
propriedades rurais.
Existem vrios testes capazes de detectar a presena de substncias inibidoras no leite cru.
Alguns mtodos se baseiam na inibio do crescimento bacteriano, outros em reaes imunolgicas
(como o teste de ELISA) ou enzimticas, alm de tcnicas de separao, identificao e quantificao
do inibidor, como as tcnicas de cromatografia gasosa ou liquida, sendo alguns muito caros, outros
trabalhosos. Um mtodo simples e facilmente aplicvel para deteco dessas substncias no leite o
mtodo do Cloreto 2,3,5-Trifeniltetrazolium ou mtodo TTC.

2- OBJETIVOS
- Detectar a presena de inibidores no leite atravs do mtodo do Cloreto 2,3,5-
Trifeniltetrazolium (TTC);
- Avaliar o mtodo frente a diferentes concentraes de gua oxigenada no leite (avaliar a
sensibilidade do mtodo).

3- MATERIAIS E MTODOS
- 10 mL de leite em tubo de ensaio (amostra contendo 0,03% de perxido de hidrognio);
- Aquecer em banho maria a 80C por 15 minutos com o objetivo de eliminar a microbiota do
leite e os inibidores naturais. Para evitarmos que os inibidores naturais termorresistentes persistam,
deve ser feito no mnimo 6 horas aps a ordenha;
- Resfriar 45C;
- Inocular 0,3mL de cultura de iogurte, ou 1mL quando a cultura estiver diluda a 1%;
- Adicionar 0,3mL de TTC (1/25);
- Incubar 45C por 30 minutos.

4- RESULTADOS:
A amostra contendo 0,03% de perxido de hidrognio apresentou colorao rosa, cuja
interpretao resultado negativo (houve crescimento de cultura reduzindo-se o TTC formazone).

5- DISCUSSO:
Os inibidores ou conservantes so substncias que so adicionadas diretamente ao leite ou
fornecidas s vacas em lactao, mas que resultam na presena de resduos no leite, e possuem a
finalidade de retardar ou previnir o aparecimento de alteraes provocadas por microorganismos, e
com isso aumentar o perodo de validade do produto. A adio de inibidores ao leite proibida no
Brasil e o leite contendo seus resduos considerado imprprio para o consumo. Contudo, em muitos
pases a utilizao de inibidores, como o perxido de hidrognio, ainda constitui uma prtica comum.
O TTC ou Cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazolium um mtodo muito simples e de fcil aplicao
para a deteco de substncias inibidoras de crescimento microbiano no leite. O principio da tcnica
consiste na converso do cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazolium em formazone, resultando na mudana
de colorao do leite para cor de rosa (resultado negativo). Essa reao ocorre na presena de clulas
bacterianas vivas, sendo utilizadas geralmente, culturas lcticas comerciais, como o S. thermophilus.
Na presena de um inibidor, a amostra de leite permanecer branca, indicando que no houve
crescimento bacteriano, e portanto, no houve reduo do TTC (resultado positivo).
As amostras a serem avaliadas na aula continham H
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em diferentes concentraes, sendo que
cada grupo ficou responsvel pela avaliao de uma amostra diferente. Aqui foi realizada a avaliao
para a amostra com 0,03% de H
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Esta amostra apresentou ao final do procedimento a colorao
rosa, indicando que houve reduo do cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazolium em formazone, sendo o
resultado considerado negativo. Portanto a concentrao de 0,03% de H
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no foi suficiente para
inibir o crescimento e a atividade da cultura lctica e este leite poderia ser utilizado pela indstria para
a produo de derivados lcteos, como queijos e leites fermentados. Na prtica, isso pode acontecer
nas situaes em que o leite com inibidor, ao ser misturado ao de outros produtores no caminho
isotrmico, leva a diluio desse inibidor, que muitas vezes pode no ser detectado e o leite acaba
sendo utilizado. Por outro lado, a presena da substncia inibidora continua representando um
problema de sade pblica e um ato que contraria a legislao brasileira, a qual probe a adio de
H
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ao leite. A principal razo dessa proibio estimular a adoo de boas prticas de higiene e
limpeza durante a ordenha e armazenamento adequado do leite pelos produtores, tornando
desnecessria a adio de qualquer tipo de substancia ao produto.

6- CONCLUSO:
A concentrao de 0,03% de perxido de hidrognio no foi capaz de inibir o crescimento
microbiano da cultura lctica adicionada amostra de leite, sendo portanto esta concentrao
compatvel com a utilizao do leite para fabricao de produtos lcteos derivados, como por exemplo,
leites fermentados. Contudo, a presena dessa substncia no leite continua representando um risco
para a sade pblica, e o leite que a contm considerado imprprio para o consumo.

7 -BIBLIOGRAFIA
Brasil. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Decreto n 2.224, de 04/06/1997.
RIISPOA.Braslia: MAPA.1997. (www.agricultura.gov.br/SDA/DIPOA).
Brasil. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Instruo Normativa n 51, de
18/07/2002.Braslia: MAPA.2002. (www.agricultura.gov.br/SDA/DIPOA).
Roteiro de aula prtica.
Anotaes de aula.