Histórico de Revisões: 01 17/01/2018 Emissão de Documento

HOSPITAL SÃO MATEUS
Procedimento Operacional Padrão

Título: Quimiocitológico de Líquido Cefalorraquidiano (LCR) Versão: 01
Setor: Citologia, Hematologia, Bioquímica, Imunologia e Sorologia
Histórico de Revisões
Versã Data Descrição Elaborado por: Aprovado por:

o
01 17/01/2018 Emissão de documento
1. INTRODUÇÃO
A análise de líquor é indicada em casos de meningite bacteriana, viral e fúngica;

Neoplasias do sistema nervoso central; Hemorragia subaracnóidea; Doenças
desmielinizantes; Leucemias e linfomas (Estadiamento e tratamento); Imunodeficiência;
Processos granulomatosos; Hidrocefalia; Doenças auto-imunes.
2. OBJETIVO
A análise do líquido cefalorraquidiano abrange suas características físicas,

bioquímicas, citológicas, imunológicas, sorológicas e microbiológicas, auxiliando nos
diagnósticos das doenças citadas acima.
3. MATERIAL
Líquido cefalorraquidiano.
3.1 Sinonímia e Mnemônico:
Líquido cefalorraquidiano, líquor ou LCR.
3.2 Estabilidade dos Espécimes:
O líquor colhido para exame microbiológico deve ser processado imediatamente

após a colheita, durante o transporte deve-se armazená-lo em temperatura ambiente.
Elaborado por: Assinatura: Data:

Elisabete R Carrasco Abrão
Revisado por: Assinatura: Data:
Ricardo Rocha
Aprovado por: Assinatura: Data:
Paulo Henrique B Mota

Para citologia deve-se analisa-lo tão rapidamente quanto os exames

microbiológicos, se houver necessidade de armazená-lo para contagem citológica
posterior, deve-se refrigerar o espécime por 24h no máximo. Para exames bioquímicos
e sorológicos deve-se refrigerar a amostra.
3.3 Características Físicas:
3.3.1 Volume:
Definido pela mensuração do volume colhido em milímetros (mL).
3.3.2 Aspecto:
O aspecto é definido pela turbidez e cor do líquido cefalorraquidiano, onde o

fisiológico é que esteja límpido como água de rocha. Os aspectos utilizados são:
Límpido Aspecto semelhante à água de rocha, em que

podemos enxergar através do espécime.
Opalascente Aspecto semelhante à água de cal diluída, promove
tom esbranquiçado ao espécime.
Hemorrágico Quando há presença excessiva de sangue,
proveniente de acidente de punção ou não.
Ligeiramente turvo Aspecto apresentado por turbidez média do espécime.
Tuvo Aspecto apresentado por turbidez intensa do
espécime.
3.3.3 Coloração
O líquido cefalorraquidiano não possui cor fisiologicamente, onde é definido

como incolor quando se assemelha à água de rocha, quando apresenta cor vermelha é

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definido por eritrocrômico, quando apresenta cor amarelada é definido por

xantocrômico e quando apresenta cor esbranquiçada é definido por esbranquiçado.
Incolor Semelhante à água de rocha; É translúcido.

Eritrocrômico Coloração vermelha.
Xantocrômico Coloração amarela.
Esbranquiçado Semelhante à água de cal.
4. TÉCNICA PASSO A PASSO:
4.1 Abrangência:
Setor de Citologia, Hematologia, Bioquímica e Sorologia.
4.2 Colheita:
A colheita de LCR deve ser realizada somente por profissionais médicos

habilitados. A punção pode ser realizada na região lombar entre as vértebras L3/L4 ou
L4/L5, no espaço suboccipital, ventricular ou através da fontanela em recém-nascidos.
4.3 Centrifugação:
Uma pequena quantidade de LCR é centrifugada a 1500 rpm por 5 minutos, o

sobrenadante é avaliado quanto aos mesmos requisitos citados no item 3.3.2. A
ocorrência de formação de botão de hemácias ao fundo do tubo é importante para
verificar se o aspecto hemorrágico e a cor eritricrômica significam presença de
hemácias integras ou lisadas, se não houver a mesma formação.
4.3.1 Observações Referentes às Características Físicas:

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Dentre as observações mais frequentes, a que se destaca é a ocorrência de

coágulos e fibrinas no LCR, o que impossibilita a citologia global e diferencial fidedigna.
4.4 Características Bioquímicas
Analisadas de acordo com as instruções de trabalho dos equipamentos

disponíveis e/ou kits.
4.4.1 Proteínas totais:
A dosagem de proteínas totais no LCR é realizada pelo método de nefelometria

pela alta sensibilidade do mesmo. A barreira hematoencefálica não permite que
proteínas de alto peso molecular atravessem-na, por esse motivo o valor de referência
é pequeno (VR = <40mg/dL – de acordo com o local da punção), quando há infecção
das meninges com consequente inflamação o espaço entre as células aumenta devido
ao edema gerado, fazendo com que as células epiteliais que eram justapostas percam
esta configuração e permitam a entrada de elementos maiores, como o caso de
proteínas, este processo é bem evidenciado nas meningites bacterianas. Nas doenças
desmielinizantes há degradação de mielina e como produto disto há aumento de
proteínas e aminoácidos no LCR.
Quando o espécime apresentar aspecto límpido e opalescente não há

necessidade de pré preparo da amostra para a dosagem, nos outros casos é
interessante centrifugar o material a 1500 rpm por 5 minutos e realizar a dosagem
somente com o sobrenadante, diminuindo a interferência gerada por precipitados e
elementos figurados.
4.4.2 Glicose
O sistema nervoso central utiliza como única fonte energética a glicose e por
esse motivo há chegada de glicose em massa para suprir suas necessidades, a
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concentração de glicose no LCR (glicorraquia) é cerca de 1/3 da concentração

plasmática.
Quando há infecção bacteriana nas menunges, os neutrófilos e bactérias

consomem esta glicose, diminuindo a glicorraquia. Em pacientes diabéticos é
importante correlacionar os níveis glicêmicos coma a glicorraquia, já que a diminuição
de glicose no LCR pode manter a mesma em níveis fisiológicos (lembrar que a
concentração de glicose em ambos os compartimentos é maior do que a fisiológica). A
dosagem de glicorraquia é feita pelo método na glicose-oxidase. Os critérios de pré-
preparo da amostra são iguais aos descritos no item 4.4.1.
4.4.3 Cloretos:
Os cloretos são dosados no LCR para auxiliar nos diagnósticos das infecções do
SNC (Sistema Nervoso Central) pelo Treponema pallidum e outras bactérias. Sua
importância clínica é caracterizada pela diminuição de cloretos, que remete às
condições citadas acima, o aumento do mesmo remete à doenças renais onde há
hipercloremia e consequentemente os níveis elevam-se no LCR também. Os critérios
de pré preparo da amostra são iguais aos descritos no item 4.4.1.
4.4.4 Outros Parâmetros Bioquímicos:
É comumente solicitado LDH do LCR. Os níveis de LDH no líquor são baixos e

seu aumento está relacionado à lise e dEGradação celular. O ácido lático ou lactato
são solicitados com a finalidade de determinar a resposta ao tratamento. Nas infecções
bacterianas há aumento dos mesmos e a queda dos níveis é rápida quando há êxito no
tratamento servindo como fator prognóstico.
As dosagens de albumina e eletroforese de proteínas no LCR são solicitadas

para verificar os níveis das proteínas envolvidas nas respostas inflamatórias, a

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albumina representa cerca 52,8 – 73% das proteínas presentes no LCR, a pré-
albumina representa 2,3 – 6,9%, a Alfa 1 representa 3,7 – 8,1%, Alfa 2 representa 4,2 –
8,8%, a Beta representa 7,3 – 14,5% e a Gama representa cerca de 3,0 – 9,0%.
Quando há aumento de alguma dessas frações é indicativo de um processo
inflamatório ou auto-imune, dependendo da fração elevada, as frações Alfa 1 e 2 estão
relacionadas à resposta inflamatória, a Alfa 2 está elevada em traumas; A Beta está
elevada em doenças vasculares encefálicas, meningites e neoplasias; A Gama
encontra-se elevada nos processos de esclerose múltipla e neurossífilis.
4.5 Citologia Global:
A citologia global do LCR tem como finalidade determinar a quantidade de

células por milímetro cúbico, evidenciando se há inflamação, infecção e hemorragias.
Para realização da citologia global é necessário seguir alguns passos:
● Verificar se há coágulos e fibrinas;
● Homogeneizar o LCR através de inversão 10 vezes;
● Preencher o espaço da câmara de Fuchs-Rosenthal com o LCR

homogeneizado;
● Prosseguir com contagem em microscopia óptica.
Todo o espaço da câmara de Fuchs-Rosenthal deve ser preenchido pelo LCR,

na mesma há o total de 16 quadrantes e cada um destes possui outros 16
quadrados/campos, totalizando 256 quadrados ou campos. A contagem global deve ser
feita diferenciando hemácias e células necleadas (Leucócitos e células epiteliais), os
256 quadrados devem ser observados e contados, respeitando-se a regra de exclusão
de células que tocam as linhas. As células que tocarem a linha externa não deverão ser
contadas e as células que tocam o limite inferior e o direito devem ser contadas. A
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somatória deve ser dividida por 3,2 para resultar em células/mm3. Quando o LCR
estiver com alto número de células há a possibilidade de contarmos 16 quadrados de
quadrantes diferentes, multiplicar por 16 e dividir por 3,2 para acharmos o valor real.
Isto se aplica somente aos casos onde o material possui numerosas células e na
câmara observamos homogeneidade do conteúdo.
O valor 3,2 que utilizamos na divisão é proveniente do cálculo que leva em

consideração a área da câmara e sua profundidade. A câmara de Fuchs-Rosenthal
possui um quadrado de 4mm x 4mm, totalizando 16mm2 que são divididos em 16
quadrantes, onde cada quadrante possui 1mm2. Estes por sua vez são divididos em 16
quadrados de 1/16mm2. A profundidade da lâmina é de 0,2mm, logo 16mm2 x 0,2mm
resultam 3,2, que é o volume ocupado e serve de fator para o cálculo.
4.5.1 Cálculos
4.5.1.1 Câmara de Fuchs-Rosenthal:
4.6 Citologia Diferencial:
A citologia diferencial deve ser feita sempre que houver 5 ou mais células por
milímetro cúbico na citologia global. Para unidades que possuam citocentrífuga, é
necessário pipetar de 0,1 – 0,5 mL de LCR (dependendo do número de células) e
prosseguir com a centrifugação utilizando uma lâmina, papel filtro para citocentrífuga e
suporte para a lâmina. É necessário adicionar 200µL de plasma citratado junto com a
amostra.
O volume total não deve ultrapassar 500µL, já que geralmente 200µL de LCR e
200µL de plasma citrato são suficientes para obter uma boa lâmina. Para outras
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unidades é necessário pipetar um volume de 1-2 mL, dependendo do número de

células e prosseguir com a centrifugação em centrífuga comum à 2500 rpm por 5
minutos, o sobrenadante deve ser desprezado assegurando que haja no tubo de
ensaio cerca de 20µL para ressuspender o precipitado. Este volume é transferido para
uma lâmina fosca, onde é preciso espalhar o conteúdo formando uma forma oval no
centro da lâmina.
4.6.1 Coloração
A coloração pode ser feita utilizando diversos corantes sendo os mais utilizados:
Leishman, panótico rápido e HE. O tempo de coloração, volume do corante e outras
características pertinentes à técnica devem seguir as orientações do fabricante.
Geralmente a coloração feita por HE leva em torno de 15 segundos em cada reagente,
onde deve ser corada com cautela para evitar desprendimento do material.
4.6.2 Microscopia:
A leitura deve ser feita em microscópio óptico com a objetiva de aumento de

100x com óleo de imersão, são contadas 100 células diferenciando-as em
polimorfonucleares (Neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e monomorfonucleares
(Linfócitos e monócitos).
Pode haver infiltração de células leucêmicas no LCR, como blastos, quando o

paciente possui leucemia ou linfoma. Quando houver a presença destas células e/ou
células neoplásicas deve-se enviar o material para revisão do setor de citologia, onde o
patologista liberará o laudo.
4.7 VDRL
O ensaio realizado entre interação de anticorpos antifisfilípides e antígenos

treponêmicos adsorvidos à partículas de látex é denominado VDRL (Veneral disease
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research laboratory), tem como objetivo formar floculação entre as interações destes
complexos Ag-Ac.
Para que haja floculação, as concentrações de antígenos e anticorpos devem

estar balanceadas para que os anticorpos liguem-se a dois antígenos ou mais e
formem o floculado. Por este motivo o procedimento para realização desta análise é
diferente quando comparada ao procedimento do soro.
4.8 Bacterioscopia:
A bacterioscopia deve ser realizada através da coloração de Gram, onde o

mesmo precipitado utilizado para a confecção da lâmina de citologia diferencial é
pipetado para a confecção de outras 2 lâminas com as mesmas características. Após
fixação prévia do material nas lâminas, são submetidas a uma sequência de reagentes:
● Violeta de cristal (Corante primário): É responsável pela coloração do

citoplasma, independente do tipo celular;
● Solução de Iodo (Mordente): Complexa-se ao violeta de cristal formando

precipitados insolúveis dentro das células;
● Álcool-Acetona (Solvente lipofílico): Desidratação das paredes celulares de

bactérias Gram positivas, diminuição de porosidade e permeabilidade (O complexo
formado entre o cristal violeta e o iodo não consegue sair do citoplasma). Extração
lipídica da parede celular de bactérias Gram negativas, aumentando a porosidade e
removendo o complexo insolúvel.
● Fucsina básica (Contratante): Cora o citoplasma de bactérias Gram negativas

de vermelho. As bactérias Gram positivas não são afetadas.
4.8.1 Método de Coloração de Gram

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● Cobrir o esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante

básico), esperar um minuto;
● Remover o excesso da solução de cristal violeta da lâmina, lavando-a

levemente com água corrente ou destilada;
● Cobrir o esfregaço com solução de lugol durante um minuto;
● Descorar o esfregaço usando solução de álcool – acetona (gotejar a solução

até que não saia mais o corante, ou deixar sobre a lâmina por 30 segundos);
● Cobrir o esfregaço com solução de fucsina básica, durante 30 segundos;
● Lavar levemente com água corrente;
● Esperar a lâmina secar naturalmente ao ar livre.
4.8.2 Microscopia:
A bacterioscopia deverá ser realizada através de microscopia óptica utilizando

aumento de 1000x e óleo de imersão. As bactérias devem ser classificadas de acordo
com:
● Coloração: Gram positiva ou negativa;
● Morfologia: cocos, bacilos, coco-bacilos e leveduras;
● Disposição: agrupados, em cachos, aos pares, diplococos, etc.
Exemplo: Diplococos Gram negativos e Cocos Gram positivos agrupados em

cachos.
4.9 Semeadura:

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O LCR deverá ser semeado em placas contendo Ágar Chocolate, Sangue e

MacConkey, respeitando esta ordem, através de estrias proporcionando isolamento de
colônias. O volume utilizado em cada placa é determinado pelo volume da alça
calibrada, neste caso deve ser utilizada a alça estéril descartável de cor azul, volume
10µL, e deve ser semeado em “zig-zag”.
Aproximadamente 10µL do LCR deverá ser adicionado ao meio de

enriquecimento BHI e incubado a 32,5º C 2º, da mesma forma que as placas.

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A análise do líquido cefalorraquidiano abrange suas características físicas,

3.1 Sinonímia e Mnemônico:

Líquido cefalorraquidiano, líquor ou LCR.

3.2 Estabilidade dos Espécimes:

O líquor colhido para exame microbiológico deve ser processado imediatamente

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Para citologia deve-se analisa-lo tão rapidamente quanto os exames

3.3 Características Físicas:

Definido pela mensuração do volume colhido em milímetros (mL).

O aspecto é definido pela turbidez e cor do líquido cefalorraquidiano, onde o

Límpido Aspecto semelhante à água de rocha, em que

O líquido cefalorraquidiano não possui cor fisiologicamente, onde é definido

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definido por eritrocrômico, quando apresenta cor amarelada é definido por

Incolor Semelhante à água de rocha; É translúcido.

4. TÉCNICA PASSO A PASSO:

Setor de Citologia, Hematologia, Bioquímica e Sorologia.

A colheita de LCR deve ser realizada somente por profissionais médicos

Uma pequena quantidade de LCR é centrifugada a 1500 rpm por 5 minutos, o

4.3.1 Observações Referentes às Características Físicas:

Elaborado por: Assinatura: Data:

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Dentre as observações mais frequentes, a que se destaca é a ocorrência de

4.4 Características Bioquímicas

Analisadas de acordo com as instruções de trabalho dos equipamentos

4.4.1 Proteínas totais:

A dosagem de proteínas totais no LCR é realizada pelo método de nefelometria

Quando o espécime apresentar aspecto límpido e opalescente não há

Procedimento Operacional Padrão

concentração de glicose no LCR (glicorraquia) é cerca de 1/3 da concentração

Quando há infecção bacteriana nas menunges, os neutrófilos e bactérias

4.4.4 Outros Parâmetros Bioquímicos:

É comumente solicitado LDH do LCR. Os níveis de LDH no líquor são baixos e

As dosagens de albumina e eletroforese de proteínas no LCR são solicitadas

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4.5 Citologia Global:

A citologia global do LCR tem como finalidade determinar a quantidade de

● Verificar se há coágulos e fibrinas;

● Homogeneizar o LCR através de inversão 10 vezes;

● Preencher o espaço da câmara de Fuchs-Rosenthal com o LCR

● Prosseguir com contagem em microscopia óptica.

Todo o espaço da câmara de Fuchs-Rosenthal deve ser preenchido pelo LCR,

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O valor 3,2 que utilizamos na divisão é proveniente do cálculo que leva em

4.5.1.1 Câmara de Fuchs-Rosenthal:

4.6 Citologia Diferencial:

Procedimento Operacional Padrão

unidades é necessário pipetar um volume de 1-2 mL, dependendo do número de

A leitura deve ser feita em microscópio óptico com a objetiva de aumento de

Pode haver infiltração de células leucêmicas no LCR, como blastos, quando o

O ensaio realizado entre interação de anticorpos antifisfilípides e antígenos

Procedimento Operacional Padrão

Para que haja floculação, as concentrações de antígenos e anticorpos devem

A bacterioscopia deve ser realizada através da coloração de Gram, onde o

● Violeta de cristal (Corante primário): É responsável pela coloração do