MICROSCOPIA DE EPIFLUORESCÊNCIA

Fitoplâncton e Bacterioplâncton

Microscopia de Epifluorescência
- foi introduzida nas ciências aquáticas nos anos 70
- permitiu a observação de pequenos organismos (<2 µm) que são pequenos demais para se depositarem
com o método de Utermöhl (1958) ou para serem reconhecidos com um microscópio óptico
- permite a diferenciação entre organismos autotróficos e heterotróficos
- células flageladas frágeis são preservadas
- esta técnica deve ser usada juntamente com a microscopia de inversão

Princípio de Funcionamento
Um certo volume de água é filtrado por uma membrana apropriada; o filtro é colocado no microscópio
epifluorescente, no qual a luz é filtrada através de filtros apropriados, de modo a incidir luz de determinado
comprimento de onda, que vai excitar as moléculas, as quais vão fluorescer.

Soluções
Glutaraldeído a 25% para microscopia de epifluorescência – para fixar a amostra;
adicionar até uma concentração final de 2 a 5% (v/v)
Proflavina – dissolver 10 mg de proflavina em 40 mL de água destilada ou desionizada;
filtrar por filtro de 0,2 µm; armazenar no frio (4ºC) e no escuro; adicionar 50 µL de
proflavina por 5 mL de amostra de água
Acridina laranja – dissolver 0,25 g de acridina laranja em 250 mL de água destilada pré-
filtrada por 0,2 µm; armazenar no frio (4ºC) e no escuro

Fixação e Armazenamento de Amostras

- um volume apropriado de amostra de água deve ser colocado num frasco de vidro
escuro e fixado com glutaraldeído a 25% refrigerado (concentração final de glutaraldeído
= 2-3%; 15 mL amostra + 2 mL glutaraldeído 25% refrigerado - Cf = 2,9%)
- a amostra deve ser conservada no frio (4ºC) e no escuro e as preparações devem ser feitas
até 24 horas após a recolha, para evitar a perda de autofluorescência (preparações de
bactérias podem ser feitas até 1 semana depois da recolha)

- vantagens e desvantagens do glutaraldeído:

RIOSBD 1
 Preserva a morfologia celular de forma adequada
Amostra fixada tem que ser armazenada no frigorífico durante poucos dias
Preparação pode ser armazenada durante longos períodos de tempo (anos) no congelador
Extremamente tóxico
É usado em concentrações finais entre 2 e 5%

FITOPLÂNCTON
- montar o sistema de filtração composto por kitasato ligado a uma bomba de vácuo e funil
de filtração preso com uma mola
- colocar um filtro de acetato de celulose com diâmetro do poro ≥ 0,4 µm (serve de filtro de
suporte, permitindo uma distribuição uniforme dos organismos sobre o filtro de membrana)

- sob o filtro de suporte, colocar o filtro de membrana de policarbonato de cor negra com
diâmetro do poro 0,4 µm (se o filtro for branco deve corar-se previamente o filtro com irgalão negro)
- colocar a chaminé de filtração e prender com a mola
- pipetar um volume adequado (Guadiana 1-5 mL) de amostra para a chaminé (o volume de
amostra a filtrar depende da quantidade de organismos presentes na amostra e nas patículas em suspensão)

- adicionar proflavina (50 µL de corante para 5 mL de amostra), cobrir a chaminé com

papel de alumínio e aguardar 3 minutos (tempo de contacto)
- filtrar com pressão < 100 mm Hg (para evitar a destruição das células)
- colocar uma gota de óleo não fluorescente (Cargille tipo A) numa lâmina
- retirar a membrana do sistema de filtração, colocar a membrana sobre a gota de óleo,
colocar nova gota de óleo sobre a membrana e cobrir com lamela
- conservar a preparação no frio (-20ºC) e no escuro

Contagem do Fitoplâncton – Procedimento Geral

- devem ser contados no mínimo 50 campos visuais, 400 células no total e 100 células da
espécies mais abundante (precisão de contagem = 10%)
- cálculo da abundância:

x.A.d
abundância (cél.L !1 ) =
a.n.v

onde: x = número de células contadas

A = área da chaminé de filtração (mm2)

RIOSBD 2
 d = factor de diluição devido à adição de glutaraldeído (vol. final/vol.
amostra)
a = área do campo (mm2)
n = número de campos contados
v = volume de amostra filtrado (L)

- para medir as células usa-se o reticulado New Porton G12 (May, 1965)
- o biovolume celular médio é calculado com base nas fórmulas geométricas que melhor se
adequam a cada espécie (ex. Hillebrand et al., 1999)
- a biomassa é calculada como função não linear do volume celular médio, usando as
relações descritas na literatura (ex. Verity et al., 1992)

BACTERIOPLÂNCTON
- montar o sistema de filtração composto por kitasato ligado a uma bomba de vácuo e funil
de filtração preso com uma mola
- colocar um filtro de acetato de celulose com diâmetro do poro ≥ 0,2 µm (serve de filtro de
suporte, permitindo uma distribuição uniforme dos organismos sobre o filtro de membrana)

- sob o filtro de suporte, colocar o filtro de membrana de policarbonato de cor negra com
diâmetro do poro 0,2 µm (se o filtro for branco deve corar-se previamente o filtro com irgalão negro)
- colocar a chaminé de filtração e prender com a mola
- pipetar um volume adequado (Guadiana 1-5 mL) de amostra para a chaminé (o volume de
amostra a filtrar depende da quantidade de organismos presentes na amostra e nas patículas em suspensão)

- filtrar com pressão < 100 mm Hg (para evitar a destruição das células)
- adicionar acridina laranja (algumas gotas, de modo a cobrir o fundo), cobrir a chaminé
com papel de alumínio e aguardar 3 minutos (tempo de contacto)
- colocar uma gota de óleo não fluorescente (Cargille tipo A) numa lâmina
- retirar a membrana do sistema de filtração, colocar a membrana sobre a gota de óleo,
colocar nova gota de óleo sobre a membrana e cobrir com lamela
- conservar a preparação no frio (-20ºC) e no escuro

Contagem do Bacterioplâncton – Procedimento Geral

- devem ser contados no mínimo 20 campos visuais e 300 células no total, usando o
gratículo New Porton G12 (May, 1965)

RIOSBD 3
- cálculo do número total de bactérias (TBN):

x.A.d
TBN (cél.L!1 ) =
a.n.v

onde: x = número de células contadas

A = área da chaminé de filtração (mm2)
d = factor de diluição devido à adição de gluteraldeído (vol. final/vol.
amostra)
a = área do campo (mm2)
n = número de campos contados
v = volume de amostra filtrado (L)

Coloração de filtros de membrana com irgalão negro

- os filtros de membrana a usar em microscopia de epifluorescência devem ser negros
- os filtros brancos podem ser corados com irgalão negro a 2% (filtrar 98 mL de água
destilada por 0,2 µm, adicionar 2 mL de ácido acético e 0,2 g de irgalão negro, filtrar
novamente)
- colocar o irgalão numa placa de petri de vidro
- mergulhar os filtros no corante, deixar 24 horas
- lavar bem os filtros em várias placas de Petri com água destilada
- secar no exsicador

Bibliografia
Daley RJ, JE Hobbie (1975) Direct counts of aquatic bacteria by a modified epifluorescence technique.
Limnology and Oceanography 20: 875-882.
Haas LW (1982) Improved epifluorescence microscopy for observing planktonic micro-organisms. Annalles
de l’Institut Oceanographique de Paris 58: 261-266.
Hillebrand H, C-D Dürselen, D Kirschtel (1999) Biovolume calculation for pelagic and benthic microalgae.
Journal of Phycology 35: 403-424.
Hobbie JE, RJ Daley, S Jasper (1977) Use of Nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence
microscopy. Applied and Environmental Microbiology 33: 1225-1228.
May KR (1965) A new graticule for particle counting and sizing. J Sci Instrum 42: 500-501.
Utermöhl H (1958) Zur vervollkommung der quantitativen phytoplankton-methodik. Mitteilungen-
Internationale Vereiningung für Limnologie 9: 1-38.

RIOSBD 4
Verity PG, CY Robertson, CR Tronzo, MG Andrews, JR Nelson, ME Sieracki (1992) Relationships between
cell volume and the carbon and nitrogen content of marine photosynthetic nanoplankton. Limnology and
Oceanography 37: 1434-1446.

RIOSBD 5