Guia de Atividades

Práticas em

Biologia Celular

Larissa Fonseca Andrade Vieira

Milene Miranda Praça Fontes
Wellington Ronildo Clarindo

Universidade Federal do Espírito Santo

Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Biologia
 SUMÁRIO

Atividades Práticas Página

01 - Microscópio de luz............................................................................................... 1

02 - Óptica do microscópio e qualidade da observação..................................... 11

03 - Preparação de lâminas e Cortes Histológicos.............................................. 17

04 - Métodos Citoquímicos e Organização Molecular........................................ 25

05 - Células Procariotas e Eucariotas...................................................................... 31

06 - Parede Celular, Vacúolo e Plastídeos.............................................................. 36

07 – Permeabilidade Seletiva das Membranas........................................................ 43

08 – Movimentos Celulares....................................................................................... 49

09 – Núcleo................................................................................................................... 55

10 – Ciclo celular – Mitose........................................................................................ 59

11 – Meiose................................................................................................................... 64

12 –Microscopia eletrônica....................................................................................... 70
Normas de Conduta no Laboratório
Como se comportar no Laboratório de Biologia Celular

Alguns cuidados devem ser tomados por parte dos professores, técnicos, monitores e
estagiários durante a utilização do Laboratório de Biologia Celular:

1 – Não fumar.

2 – Não se alimentar ou conduzir alimentos para o interior do laboratório.

3 – Usar preferencialmente calça comprida.

4 – Usar sapatos fechados.

5 – Usar jaleco (preferencialmente com comprimento até o joelho).

6 – Manter cabelos compridos presos.

7 – Estar consciente do que estiver fazendo, ser disciplinado e responsável.

8 – Respeitar as advertências do professor, do monitor e do técnico sobre perigos e

riscos.

9 – Para utilizar os produtos químicos ou equipamentos, é necessário autorização de

professores, técnicos ou monitores.

10 – Manter hábitos de higiene.

11 – Não é permitido aplicar cosméticos dentro do laboratório.

12 – Guardar casacos, pastas e bolsas, nas áreas indicadas, e não na bancada onde
podem ser danificados pelos produtos químicos.

13 – Trabalhar em local livre de obstáculos ao redor dos equipamentos.

14 – Manusear as substâncias químicas com máximo cuidado.

15 – Não respirar vapores e gases.

16 – Não provar reagentes de qualquer natureza.

17 – Sempre usar material adequado e seguir o roteiro de aula prática fornecido pelo
professor, nunca fazer improvisações ou alterar a metodologia proposta.

18 – Ao derramar qualquer substância, providenciar a limpeza imediatamente,

utilizando material próprio para tal.
 19 – Não jogar nenhum material sólido ou líquido dentro da pia ou rede de esgoto
comum.

20 – Não trabalhar com produtos químicos sem identificação (sem rótulo).

21 – Ao aquecer qualquer substância em tubo de ensaio, segurá-lo com pinça

voltando a extremidade aberta do tubo para o local onde não haja pessoas.

22 – No local de trabalho e durante a execução de uma tarefa, falar apenas o

estritamente necessário.

23 – Nunca apanhar cacos de vidro com as mãos ou pano. Usar escova ou vassoura.

24 – Evitar contato dos produtos com pele, olhos e mucosas, utilizar sempre que
solicitado luvas e óculos de segurança.

25 – Não misturar substâncias químicas ao acaso.

26 – Não usar vidrarias trincadas ou quebradas.

27 – O laboratório deve ser mantido limpo e livre de todo e qualquer material não
relacionado às atividades nele executadas.

28 – É proibido o manuseio de maçanetas, telefones, puxadores de armários ou

outros objetos de uso comum, por pessoas usando luvas durante a execução de atividades em
que agentes infecciosos ou material corrosivo estejam sendo manipulados.

29 – Sempre após a manipulação de substâncias químicas e antes de deixar o

laboratório lavar as mãos.

30 – Cada equipe é responsável pelo material utilizado na aula prática, portanto ao

término do experimento limpar e guardar os materiais em seus devidos lugares.

31 – No caso de quebra ou dano de vidrarias, materiais ou equipamentos, comunicar

imediatamente ao professor ou ao técnico responsável.

32 – Ao término da aula, desligar todos os equipamentos, fechar pontos de água e

registro de gás.

33 – Em caso de acidentes, avisar imediatamente o professor ou técnico responsável.

TENHAM UMA EXCELENTE AULA!

 1 – Microscopia de Luz
Estrutura e Utilização do Microscópio de Luz

A Biologia Celular tem como objeto de estudo a Célula. As células são as menores
unidades morfológicas e fisiológicas de todos os seres vivos, sendo pequenas, complexas e
transparentes, portanto, difícil de estudar em termos de organização, composição e estrutura.
Mais difícil ainda é a elucidação do funcionamento dos diversos compartimentos sub-celulares
e o estabelecimento de como as moléculas atuam determinando a estrutura e função celular.
Neste sentido a Biologia Celular depende, mais do que qualquer outro campo da Biologia, do
desenvolvimento de novos instrumentos e tecnologias que permitem entender como funciona
o “Universo Celular”.

Há uma grande variedade de instrumentos e métodos disponíveis para o estudo dos

componentes celulares. Dentre eles, o microscópio óptico pode ser destacado como o mais
importante, pois permitiu aos biologistas descobrir a existência das células. As primeiras
observações das células no século XVII foram realizadas com técnicas bem simples. Com a
necessidade de se obter mais detalhes da estrutura das células, diversas metodologias foram
desenvolvidas a partir da aplicação de técnicas biofísicas e bioquímicas no contexto celular.
Nesta primeira aula iremos estudar os princípios gerais da Microscopia Óptica bem como a
estrutura e utilização do Microscópio de Luz, nosso instrumento de trabalho durante todo o
semestre letivo.

Princípios da Microscopia Óptica

A microscopia se desenvolveu desde o século XV com o advento dos microscópios

simples, ou seja, com uma única lente, que denominamos de lupa. A lupa é uma lente
convergente que possibilita uma maior aproximação do objeto ao olho e, por conseguinte, o
aumento da imagem que se formará na retina, quando comparada com o tamanho real do
objeto observado sem uso da lupa. O emprego da lupa é manual e a imagem formada
depende do posicionamento do olho próximo a uma das faces da lente da lupa e da
aproximação da mesma em relação ao objeto até que sua imagem fique nítida. Logo, a
imagem ampliada do objeto, formada na retina, dependerá da distância do objeto ao olho,
sendo denominada distância focal. O aumento (A) fornecido pela lupa é dado pela razão
entre a distância do objeto ao olho, convencionada em 25 cm (d) e a distância focal (f) da
lente:
A = d/f
Apesar de a lupa ser um instrumento muito utilizado até hoje, principalmente para
observações de organismos de maiores dimensões e em condições de campo, ela não produz
aumento suficiente para observações citológicas. As células, que em geral possuem de
diâmetro variando de 5 a 20 µm necessitam ser observadas a partir de instrumentos mais
complexos, que permitem além do aumento do objeto de estudo, a observação detalhada de

1
estruturas que são indistintos à vista humana. Analisando a fórmula do aumento apresentada
acima é possível concluir que para a obtenção de maior aumento do objeto, com mais nitidez,
a, distância focal (f) deve ser diminuída. Este fato implica na diminuição do diâmetro da lente
utilizada na observação e, conseqüentemente, na maior aproximação da lente com o olho.
Desta forma, entre os séculos XVI e XVII foram desenvolvidos os microscópios compostos que
apenas no século XIX atingiram padrão de qualidade adequado para os estudos citológicos.
Logo, o microscópio óptico, ou de luz, que conhecemos hoje é fruto de avanços no
conhecimento das propriedades da luz e das lentes. Consiste em um microscópio composto
com um conjunto de lentes que, combinadas com uma fonte de luz, são capazes de gerar
uma imagem ampliada do objeto de estudo.

A Estrutura do Microscópio de Luz

O microscópio de luz é composto, basicamente, por dois sistemas: o óptico (lentes) e

o mecânico (estruturas que sustentam as lentes) como será descrito e detalhado a seguir.

A) PARTE MECÂNICA:

1 – Pé ou Base: é o suporte do microscópio, peça que sustenta todas as outras.

2 – Estativo ou Braço: é a peça que liga a base à parte superior do microscópio.

3 – Platina ou Mesa: é uma peça de formato retangular disposta paralelamente a

base do microscópio. Esta peça destina-se à recepção da lâmina contendo o material para
estudo. No centro da platina existe uma abertura para passagem da luz. Associada a platina
encontra-se uma peça composta de dois controles cuja função é movimentar a lâmina nos
eixos X e Y.

4 – Cabeçote: é a parte superior do microscópio onde se localizam dois tubos,

sendo que em suas extremidades encaixam-se as lentes oculares. Entre os dois tubos localiza-
se a escala de ajuste de distância interpupilar. No tubo esquerdo encontra-se o anel de ajuste
de dioptrias. O cabeçote é uma peça frágil que não deve ser usada como apoio e em hipótese
alguma ser utilizado para transportar o microscópio.

5 – Revólver ou Porta-objetiva giratória: é uma peça circular que permite a

troca e a fixação das objetivas. O disco negro do revólver possui ranhuras para que o
observador possa girá-lo para mudança das objetivas. Não se deve tocar nas objetivas para
mudança das mesmas.

6 – Controles macrométrico e micrométrico: botões giratórios, encaixados um

ao outro, que permitem movimentos, mais amplos (macrométrico) ou mais delicados
(micrométrico), da platina em direção às objetivas ou vice-versa. Localizam-se lateralmente na
coluna do microscópio. O macrométrico é utilizado na focalização inicial do material em
estudo, enquanto o micrométrico atua no ajuste final da focalização do material em estudo.

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 7 – Alavanca de pré-focalização: na lateral esquerda do braço, entre o controle
macrométrico e o braço do microscópio, encontra-se uma alavanca que impede que a lente
frontal da objetiva toque a superfície da lâmina ou lamínula. Depois de focalizar a amostra
com a ajuda do macrométrico, esta alavanca deve ser girada no sentido horário para
estabelecer o limite superior do ajuste macrométrico. Essa peça é extremamente frágil e deve
ser movimentada com um toque leve, não sendo necessário o uso de força por parte do
usuário.

B) PARTE ÓPTICA:

8 – Oculares: sistema de lentes próximas ao olho do observador. As oculares

aumentam a imagem do objeto já aumentada pelas objetivas. As oculares são formadas por
duas lentes, a superior (ocular) e a inferior (lente de campo ou colérica). Nas oculares são
encontradas as seguintes informações: 10x – indica o aumento da lente ocular; 20x – número
de campo, este valor é utilizado para calcular o diâmetro do campo de visão e está associado
com o aumento de cada objetiva. Por exemplo, se a objetiva de 40x estiver encaixada, para
calcular o diâmetro do campo de visão basta dividir o número de campo da ocular (20) pelo
aumento da objetiva (40). O resultado é 0,5 mm que indica que o diâmetro do campo
explorado pela objetiva.

9 – Objetivas: são as lentes que se encontram encaixadas no revólver e são

responsáveis pelo aumento e pela resolução da imagem. São sistemas ópticos constituídos por
várias lentes superpostas que, além de fornecer uma imagem ampliada e invertida do objeto,
procuram corrigir os defeitos ou aberrações da luz que por ela passa.

Na Figura 1.1 estão destacadas as características das objetivas:

Figura 1.1 – Características de uma objetiva a seco (aumento de 10X) e de uma

objetiva de imersão (100X).

Portanto, cada objetiva possui gravados o aumento que proporciona, a existência de

correção para o comprimento do tubo e para a presença ou ausência da lamínula, bem como
a sua abertura numérica (AN). Este último item é uma função da capacidade da objetiva em
coletar luz e é um fator determinante do seu poder de resolução, sendo definido pela fórmula:

3
 sendo:
AN = n sen α
n = índice de refração do meio que separa a objetiva e a amostra; e
α = metade do ângulo do cone de luz que atinge a objetiva.

Figura 1.2 – Esquema representando a maior captação de luz pela objetiva. Presença
do óleo de imersão entre a lâmina de vidro e a lente objetiva, no lado direito do desenho.

Outra característica importante de uma objetiva é a sua distância de trabalho, ou

distância focal, que constitui a distância entre a lente frontal da objetiva e a lamínula quando
a amostra está focalizada. Quanto maior o aumento da objetiva, mais ela se aproxima da
preparação microscópica e menor a distância de trabalho, o que leva a maior perda na coleta
dos raios luminosos.

10 – Condensador: é um conjunto de lentes situado abaixo da platina, concentra e

torna paralelo o feixe luminoso, fornecendo a luz necessária à iluminação do objeto em
estudo. Ao concentrar os raios luminosos, aumenta a quantidade de luz que atravessa o
objeto. O controle de ajuste do condensador está localizado lateralmente, à esquerda e abaixo
da platina. Este controle permite a movimentação do condensador que deve ser mantido na
posição mais elevada para a obtenção de uma iluminação máxima.

11 – Diafragma de íris: peça localizada acima do condensador, que regula a

intensidade do feixe luminoso que chega ao objeto, possibilitando maior nitidez da imagem. A
regulagem do diafragma é feita por meio de uma alavanca e para tanto existe uma escala
numérica impressa em branco no diafragma. Os valores de abertura numérica devem
coincidir com os valores de abertura numérica das objetivas, ou seja, a cada mudança de
objetiva o usuário deve regular a abertura do diafragma.

12 – Filtro: disco de vidro azul (ou verde) fixado abaixo do diafragma e que permite
a conversão da iluminação de halogênio em luz branca, exibindo a amostra em suas cores
naturais.

13 – Fonte de luz: consiste de uma lâmpada halogênea embutida na base do

microscópio. O interruptor principal que liga a lâmpada localiza-se na lateral. Abaixo do
interruptor encontra-se o botão seletor de intensidade luminosa, que permite regular a
intensidade de luz.

4
 O funcionamento do Microscópio de Luz

Agora que você já está familiarizado com o microscópio de luz, é possível entender
como ocorre a formação da imagem produzida por este aparelho. Os efeitos de refração e
absorção da luz são fenômenos importantes a serem considerados na formação da imagem
ao microscópio. Esses fenômenos ocorrem em consequência da interação da luz com o meio
que ela percorre. Logo, a interação da luz com o espécime avaliado gera absorção e refração,
criando contrastes entre o objeto e o meio que o envolve, permitindo a distinção das
diferentes estruturas no material analisado.
Antes que a imagem gerada pelo microscópio chegue a retina do observador, a luz
responsável por sua formação passa por alguns componentes do aparelho: os feixes
luminosos que saem da fonte de luz atravessam as lentes do condensador, passam pela
preparação microscópica (o espécime), atingem as lentes objetivas e por fim atravessam as
lentes oculares chegando a retina onde são focalizados. Durante todo esse percurso a luz
passa por lentes e pelo ar, sofrendo desvios que geram os índices de refração e absorção
discutidos acima.
O princípio para a formação de imagens nos microscópios segue leis da Física que não
cabem serem discutidas com detalhes aqui. Vale ressaltar somente que as lentes dos
microscópios funcionam como sistemas convexos, ou seja, são lentes convergentes cuja
formação da imagem, como apresentado anteriormente, depende da posição do objeto em
relação ao plano focal (f) ou ao centro focal da lente. Neste sentido, a lente objetiva forma
uma imagem invertida e ampliada da preparação, enquanto a lente ocular funciona apenas
como uma lupa que amplia a imagem formada pela objetiva. Como resultado, a imagem final
captada na retina do observador é virtual, ampliada e invertida em relação à preparação.

Procedimento para a focalização

1 – Verifique se a objetiva de menor aumento (4x) está encaixada.

2 – Pegue a lâmina a ser observada, segurando-a apenas pelas bordas. Verifique se a
lamínula está voltada para cima.
3 – Abra a presilha e coloque a lâmina sobre a platina, encaixando-a perfeitamente.
Solte a presilha e verifique se a lâmina está bem encaixada. Centralize o material no orifício
da platina, utilizando os controles dos eixos X e Y, “Charriot”.
4 – Verifique se o controle de intensidade da luz encontra-se no mínimo.
5 – Certifique-se o condensador encontra-se em sua posição mais elevada.
6 – Acenda a lâmpada do microscópio e ajuste a intensidade de luz.
7 – Ajuste a abertura do diafragma de acordo com a abertura numérica da objetiva
de menor aumento.
8 – Levante a platina movimentando o controle macrométrico até o seu ponto
máximo.
9 – Ajuste a distância interpupilar movimentando com cuidado os tubos do cabeçote,
abrindo ou fechando conforme a necessidade.

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 10 – Agora, observando através das oculares e utilizando o controle macrométrico,
abaixe lentamente a platina, até que o material a ser observado seja visto. Assim que isto
ocorrer, corrija a focalização utilizando o controle micrométrico.
11 – Caso seja necessário ajuste as diferenças que podem ocorrer entre o olho
esquerdo e direito (dioptrias) por meio do anel de correção de dioptrias no tubo esquerdo.
12 – Explore o material, movimentando os controles dos eixos X e Y com a mão
direita e o controle micrométrico com a mão esquerda. Coloque sempre o material a ser
analisado no centro do campo de observação, antes de passar para a objetiva de aumento
imediatamente superior.
13 – Após percorrer todo o campo, passe para a objetiva de aumento médio e corrija
a focalização utilizando somente o micrométrico. Observe o campo e passe para a objetiva
seguinte. A cada mudança de objetiva centralize, com o Charriot, o material que está sendo
observado. Lembre-se sempre que à medida que o aumento da objetiva é maior o diâmetro
da lente diminuiu, assim, a objetiva seguinte focaliza o centro do campo anterior, perdendo o
campo mais periférico. Se você não observar tal fato, poderá perder o objeto do foco, o que
lhe forçará a voltar na objetiva de menor aumento.
14 – Sempre ajustar a abertura do diafragma de acordo com a objetiva em uso.
15 – Verifique se a focalização melhora, se você manipular os pontos de controle de
luz: potenciômetro, diafragma e condensador.
16 – A atividade ao microscópio é estritamente dinâmica. A postura correta, além dos
dois olhos abertos, inclui o fato de uma das mãos ficarem nos parafusos Charriot, e a outra,
no parafuso micrométrico.
17 – Terminada a observação: (i) encaixe a objetiva de menor aumento; (ii) reduza
ao potenciômetro mínimo; (iii) desligue a luz; (iv) retire a lâmina; (v) limpe e cubra o
microscópio; (vi) deixe seu lugar no laboratório limpo e organizado.

Cuidados com o Microscópio

1 – Não arraste o microscópio sobre a mesa e nem faça movimentos bruscos com o
equipamento. Muitas peças são de plástico e podem quebrar quando forçadas, é o caso da
alavanca de pré-focalização e do controle de abertura e fechamento do diafragma.
2 – Caso necessite de mudar o microscópio de lugar, chame o professor ou o monitor.
3 – Não use a força ao movimentar os diferentes controles (macrométrico,
micrométrico, alavanca de pré-focalização e do controle de abertura e fechamento do
diafragma, etc). Quando perceber que algum controle não se movimenta por algum motivo,
não force! Chame o professor ou o monitor.
4 – Somente movimente o botão macrométrico na objetiva de menor aumento.
5 – Sempre ligue ou desligue com o controle da intensidade luminosa na menor
posição.
6 – Não limpe as lentes oculares e objetivas com pano, papel higiênico ou papel
toalha. Chame o professor ou o monitor toda vez que perceber que as lentes estão sujas.
7 – Não deixe cair nenhum líquido sobre a platina e não toque a objetiva com
nenhuma solução.

6
 Atividade 1

Objetivos:
1. Treinar o uso do microscópio de luz.
2. Compreender as etapas necessárias para a focalização do material de observação.

1 – Com base na Figura abaixo, escreva o nome e a função de cada componente do

microscópio de luz indicados pelos números de 01 a 19.

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1_______________________________________________________________

2_______________________________________________________________

3_______________________________________________________________

4_______________________________________________________________

5_______________________________________________________________

6_______________________________________________________________

7_______________________________________________________________

8_______________________________________________________________

9_______________________________________________________________

10______________________________________________________________

11______________________________________________________________

12______________________________________________________________

13______________________________________________________________

14______________________________________________________________

15______________________________________________________________

16______________________________________________________________

17______________________________________________________________

18______________________________________________________________

19______________________________________________________________

2 – Descreva todo o percurso da luz, desde a sua origem até a formação da imagem
no olho do observador.

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3 - Focalização de letras no microscópio.
Procedimento: (i) recorte as letra “H”, “A” e “E” de um jornal, revista, bula ou texto
qualquer; (ii) coloque uma gota de água sobre a lâmina, com o auxílio de um conta-
gotas ou pipeta; (iii) coloque as letras na posição de leitura sobre a gota; (iv) coloque a
lamínula em posição de 45o, com relação a lâmina, para evitar a formação de bolhas; (v)
caso haja excesso de líquido, retire com papel absorvente, para manter a lamínula fixa;
(vi) seguir as etapas de focalização do material.
a) Faça esquemas da posição e do tamanho das letras observadas à olho nu e ao
microscópio.
Olho nu Microscópio

Olho nu Microscópio

Olho nu Microscópio

b) Quais são as diferenças entre as imagens observadas da letra com a vista

desarmada e ao microscópio?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

c) Quais são as características da imagem formada pela lente objetiva em relação

ao objeto?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

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 d) Quais são as características da imagem formada pela lente ocular em relação à
imagem formada pela lente objetiva?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

e) Por que é recomendado centralizar o material no campo de observação antes

de cada mudança de objetiva?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

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 2 – Óptica do Microscópio e
Qualidade da Observação
Princípios do funcionamento do microscópio

Aumento e poder de resolução

Geralmente, relaciona-se a qualidade do microscópio à sua capacidade de ampliação

da imagem de um objeto. Entretanto, a qualidade dos microscópios está associada ao seu
poder de resolução. O poder de resolução indica a capacidade do microscópio de fornecer
imagens nítidas, com detalhes estruturais. O aumento refere-se ao tamanho aparente da
imagem em relação ao objeto e a resolução, à riqueza de detalhes da imagem obtida.
O aumento dado pela objetiva e ocular é obtido pelo produto dos aumentos conferido
por cada uma dessas lentes. Por exemplo, uma combinação de uma objetiva que proporciona
aumento de 20x com uma ocular de 10x, fornecerá um aumento total de 200x.
O poder de resolução pode ser inferido de uma maneira indireta. Para que isso seja
feito, é necessário que se conceitue limite de resolução. Limite de resolução é a menor
distância que deve existir entre dois pontos, de modo que ainda apareçam individualizados na
imagem formada pelo sistema de lentes. Logo, se esses pontos estiverem separados por uma
distância menor do que o limite de resolução, estes serão vistos como um único ponto,
independente da imagem. Portanto, quanto menor o limite de resolução, maior o poder de
resolução e melhor a qualidade da imagem.
O limite de resolução do olho humano normal é aproximadamente 0,1 mm; do
microscópio de luz, ao redor de 0,25 µm e do microscópio eletrônico, de 3 a 5 Å. O limite de
resolução (LR) é calculado pela seguinte fórmula:

LR = (k.ʎ)/(AN)

em que:
K = constante experimental estimada em 0,61;
ʎ = comprimento de onda da energia utilizada (luz branca = 550 nm ou feixe de elétrons);
AN = abertura numérica da lente objetiva. Esse valor é calculado por meio da fórmula:

AN = n sen α

em que:
n = índice de refração do material intercalado entre a lamínula e a lente objetiva (ar, óleo de
imersão, glicerina, água, etc, dependendo do tipo de objetiva utilizada).
senα = metade do ângulo de abertura da lente objetiva (ângulo formado entre o feixe óptico
da lente objetiva e o raio de luz mais externo utilizado na formação da imagem).

11
 Por meio dessa fórmula, verifica-se que o limite de resolução é diretamente
proporcional ao comprimento de onda da fonte de iluminação utilizada e inversamente
proporcional a abertura numérica. A diminuição do comprimento de onda (ʎ) pode ser feita
utilizando-se outras fontes de iluminação como a luz ultravioleta (400 nm) ou utilizando-se
um feixe de elétrons cujo ʎ = 0,005 nm (microscópio eletrônico). A média dos comprimentos
de onda da luz branca é de aproximadamente 550 nm ou 5,55 µm o qual representa a
média dos comprimentos de onda do espectro da luz visível. O quadro 2.1 mostra os
comprimentos de onda que compõe a luz branca.
Com relação à luz, quanto menor o comprimento de onda, menor o limite de
resolução. De fato, detalhes estruturais menores que cerca de metade do comprimento de
onda utilizado não podem ser observados. Assim, analisando a tabela abaixo, podemos
depreender que, considerando apenas a influência da luz, o limite de resolução de um
microscópio óptico pode variar entre 200 nm e 400 nm.

Quadro 2.1 – Espectro de decomposição da luz branca.

Cor ʎ (nm)
Violeta 400 424
Azul 424 491,2
Verde 491,2 575
Amarelo 575 585
Laranja 585 647
Vermelho 647 700

A diminuição do ʎ é acompanhada por uma diminuição proporcional no limite de

resolução e um conseqüente aumento no poder de resolução. Pode-se obter, também, um

12
menor limite de resolução, aumentando a abertura numérica. Isso pode ser feito por duas
maneiras: utilizando-se objetivas com diferentes aberturas angulares, isto é, diferentes valores
de α; ou variando-se o meio (índice de refração) que separa a objetiva da lâmina, utilizando-
se, por exemplo, óleo de imersão.
Quando o meio que separa a lâmina da objetiva é o ar, normalmente ocorrem desvios
do feixe luminoso em conseqüência da diferença de índice de refração (n) entre os dois meios
(vidro = 1,52 e ar = 1,00). Como resultado, uma menor quantidade de luz participa da
formação da imagem. O uso do óleo de imersão (n = 1,52) contorna o problema
mencionado, uma vez que a semelhança entre os índices de refração do óleo e do vidro
minimiza o desvio do feixe luminoso permitindo um maior aproveitamento da luz, o que
fornece, conseqüentemente, uma imagem com maior riqueza de detalhes (Figura 2.1).

Figura 2.1 – Princípio de funcionamento da objetiva de imersão.

O óleo de imersão é usado apenas com a lente objetiva de 100x, também chamada
de objetiva de imersão e caracterizada por um anel preto. Após o uso, o óleo é removido com
papel absorvente ou cotonete, embebidos em éter etílico.
Para cada objetiva do microscópio podemos calcular o limite de resolução, para que
possamos escolher a objetiva adequada para cada estudo. Para exemplificar, calcularemos o
LR de uma objetiva de 40x, cuja abertura numérica é 0,65:
LR = (0,61 x 0,55 µm)/0,65
LR = 0,51 µm

De acordo com os dados acima, somente pontos separados a uma distância igual ou
superior a 0,51 µm poderão ser observados com nitidez através dessa objetiva.
Para a mesma objetiva exemplificada anteriormente, teremos, com a utilização da luz
ultravioleta, um limite de resolução igual a:
LR = (0,61 x 0,20 µm)/ 0,65
LR = 0,19 µm

Como pode ser notado, com o emprego da luz ultravioleta poderemos distinguir
pontos muito próximos.

13
 Abaixo estão apresentados alguns exemplos de limite de resolução de sistemas
ópticos importantes para estudos citológicos:
LR do olho humano normal = 0,1 a 0,2 mm.
LR do microscópio óptico = 0,25 µm.
LR do microscópio eletrônico = 2 a 5 Å.

Se associarmos estes valores aos níveis de organização dos seres vivos, fica
evidenciada a importância do uso microscópio para o estudo das células e suas estruturas.

Relação entre aumento total e limite de resolução

Além de escolher a objetiva adequada, não é demais insistir na correta combinação

entre oculares e objetivas, principalmente porque muitos novatos costumam querer obter
amplificações muito grandes, p. ex., de 2.500 vezes, empregando uma objetiva de 100 vezes
e uma ocular de 25 vezes de aumento próprio. Entretanto, o poder de resolução, que oferece
nitidez aos pormenores mínimos da imagem, de maneira alguma é aumentado por uma
ocular muito forte. Pelo contrário, as oculares de grande aumento roubam muita luz; os
poderes resolutivos, definidores, que dão nitidez aos contornos, e penetradores, com imagens
sempre claras em planos diversos, ficam grandemente prejudicados.
A ampliação total nunca deveria ultrapassar a escala de 1.000 vezes a abertura
numérica da objetiva que usa no momento. Por exemplo, com uma objetiva de 100x, de
imersão, com abertura numérica de 1,3x pode combinar-se no máximo uma ocular com
aumento próprio de 13x, não mais. Toda ocular mais forte acarretaria o assim chamado
aumento vazio, admissível apenas quando se devem medir corpúsculos mínimos. Também a
ampliação mínima tem seus limites: não deveria estar abaixo de 500 vezes a abertura
numérica da objetiva, para aproveitar-se plenamente o poder resolutivo do instrumento.

Profundidade de campo

Freqüentemente, os aparelhos que são dotados de lentes (câmara de televisão,

maquina fotográfica, microscópios, etc) não conseguem focar o campo todo, apresentando,
com isto, uma parte embaraçada. Essa desuniformidade na focalização se deve à resolução
em profundidade, ou seja, no eixo z que corta o plano da lâmina. Uma das propriedades das
lentes ópticas é a profundidade de campo. Quando uma lente é ajustada de tal forma
amostrar um certo plano, com máxima nitidez, o olho pode observar partículas que, embora
estando acima ou pouco abaixo do plano focal, podem ser vistas nitidamente. À distância
compreendida entre as regiões imediatamente acima e abaixo do plano focal que
permanecem, simultaneamente, em foco chama-se profundidade de campo. Em microscopia
de luz, um dos fatores mais importantes na determinação da profundidade de campo é a
abertura numérica (dependente do ângulo α). Quanto maior a abertura numérica, menor a
profundidade de campo. Considerando que as objetivas de maior aumento apresentam
maiores aberturas numéricas, existe uma relação inversa entre o aumento e a profundidade
de campo, ou seja, quanto maior o aumento, menor a profundidade de campo. Isso pode ser

14
observado quando se movimenta o micrométrico com a objetiva de 40x encaixada. Devido à
pequena profundidade de campo dessa objetiva, um reduzido número de planos de um
objeto será focalizado simultaneamente. Pequenos movimentos do micrométrico permitem a
focalização de outros planos não observados anteriormente.
Na prática, pode-se obter uma maior profundidade de campo utilizando-se objetivas
com menores aberturas numéricas, ou diminuindo-se a abertura do diafragma, o que em
princípio envolve a redução do ângulo do cone de luz que atravessa o sistema.

15
 Atividade 2

Objetivos:
1. Compreender os princípios de funcionamento do microscópio de luz: aumento,
poder de resolução e profundidade de campo.
2. Relacionar a variação do limite de resolução com as diferentes objetivas.
3. Relacionar a variação da profundidade de campo com o uso das diferentes lentes
objetivas.

1 – Considere as duas combinações de lentes:

A: lente objetiva de 40x, AN = 0,75 e ocular de 8x.
B: lente objetiva de 16x, AN = 0,35 e ocular de 20x.
Considere que o K = 0,61 e ʎ = 0,55 µm e responda as seguintes questões:

a) Por que o comprimento de onda é estimado em 0,55 µm?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

b) Como é calculado o aumento final da imagem observada?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

c) Qual das combinações de lentes fornece o maior aumento?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) Qual das combinações de lentes fornece uma imagem com mais detalhes?
Justifique.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

e) O que ocorreria com o detalhamento da imagem se o aumento da ocular da

primeira combinação de lentes fosse de 40x? Justifique.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

2 – Observação de estrias de escamas de borboleta.

16
Procedimento: (i) passe o pincel seco sobre um pedaço de asa de borboleta e transfira as
esacamas que se soltarem para a lâmina; (ii) coloque uma gota de água com detergente sobre o
material e cubra-o com lamínula; (iii) observe o material ao microscópio e tente visualizar as
estrias longitudinais e transversais; (iv) após a observação complete os itens abaixo:

a) calcule o limite de resolução para as lentes objetivas de 4, 10,40 e 100x.

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

b) Desenhe as escamas conforme são vistas em cada aumento

40x 100x

400x 1000x

c) As estrias transversais são observadas a partir da utilização de qual lente

obejtiva?
________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) Baseando-se no cálculo da questão a, estime o intervalo para a distância entre

as estrias transversais das escamas.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

17
3 – Demonstração da profundidade de campo utilizando grãos de pólen de Hibiscus sp.
Procedimento: (i) passe o pincel no pistilo (parte amarela) da flor de hibisco que se encontra
na bancada; (ii) com um conta-gotas, coloque uma gota de solução salina sobre uma lâmina,
passe o pincel com os grãos-de-pólen na gota, cobrindo-a com uma lamínula; (iii) observe este
material ao microscópio, centralize um grão de pólen da cor amarelo brilhante e proceda a
observação utilizando as diferentes lentes objetivas; (iv) após a observação, responda as
questões.

a) Ao utilizar a lente objetiva de 40x, movimente lentamente o micrométrico e

observe as espículas do grão de pólen. Qual foi o resultado desse movimento?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
b) Retorne a objetiva de 10x e movimente ligeiramente o micrométrico, como na
situação anterior. Qual o resultado desse movimento?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

c) Compare os resultados das questões a e b e justifique a diferença entre eles.

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) Retorne à lente objetiva de 40x, fechando gradativamente o diafragma. Escolha

a abertura que lhe forneça a imagem com mais contraste e responda: houve
alteração na profundidade de campo? Por quê?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

18
 3 – Preparação de lâminas e
Cortes histológicos
Preparação de material biológico para observação no
microscópio de luz

A observação de materiais biológicos em microscopia implica em uma série de

procedimentos técnicos prévios que são designados técnicas histológicas. Essas técnicas visam
à preparação dos tecidos destinados ao estudo em microscopia de luz ou eletrônica. Aqui, nós
focaremos as técnicas destinadas ao estudo em microscopia de luz.
O exame ao microscópio é feito pela passagem da luz pelo objeto que está sendo
analisado, o que significa que a luz deve atravessar esse objeto. Assim, a obtenção de
fragmentos delgados de tecidos é imprescindível para uma boa preparação citológica. Os
fragmentos devem ser bem finos e colocados em lâminas também finas e transparentes.
Diferentes técnicas são utilizadas em preparações histológicas, com objetivos
específicos. Algumas técnicas são utilizadas freqüentemente em rotinas de laboratórios, pois
proporcionam a visualização da estrutura dos tecidos assim como os tipos celulares que os
compõem.

Obtenção do material biológico

O processo de preparo de uma lâmina consiste no isolamento do órgão ou um

fragmento do mesmo que se pretende estudar, podendo ser tanto de origem animal ou
vegetal. Esse material pode ser observado em preparações “frescas” ou fixado.

A) Fixação

Esta etapa consiste na utilização de procedimentos físicos ou químicos para imobilizar

as substâncias constituintes das células e dos tecidos, fornecendo maior resistência para
suportar as demais etapas. A fixação visa também evitar o processo de autólise ou
degradação bacteriana, o que poderia alterar drasticamente a estrutura celular.
A fixação que interfere o mínimo possível na estrutura celular, bem como na estrutura
e localização das diferentes macromoléculas presentes nas células é a ideal. Esta etapa é
importante para a microscopia de luz e microscopia eletrônica.
Agentes físicos como calor e microondas podem ser utilizados na fixação,
principalmente de bactérias. Entretanto, os agentes fixadores químicos são os mais utilizados,
pois reagem com determinados sítios específicos de diferentes biomacromoléculas
promovendo a sua estabilidade. Existem muitos compostos químicos que podem ser utilizados
como substâncias fixadoras. Dentre eles: a acetona (fixador de espalhamentos e esfregaços);
alcoóis etílicos, metílicos e terc-butílico (bons para estudos de ácidos nucléicos e

19
polissacarídeos); aldeídos (formaldeído, paraformaldeído e glutaraldeído), que são excelentes
fixadores de proteínas; ácido pícrico, ácido crômico e bicloreto de mercúrio (fixadores de
proteínas).

B) Desidratação

Após a fixação, o material deve ser lavado em água corrente para remoção do
excesso de fixador. Em seguida, realiza-se a desidratação utilizando-se uma solução
apropriada, como etanol ou acetona, em banhos sucessivos de concentrações crescentes. A
retirada de água é necessária para que o material utilizado na etapa de inclusão penetre nas
estruturas do corte, possibilitando maior consistência ao mesmo.

C) Diafanização ou clarificação

Etapa utilizada para promover a retirada do álcool e permitir que a parafina penetre
nos tecido. Além disso, remove gorduras dos tecidos, deixando-os translúcidos. São utilizadas
substâncias como o Xilol, benzeno ou tolueno, várias vezes.

D) Inclusão

Este procedimento consiste na impregnação do tecido com uma substância de

consistência firme que permita, posteriormente, seccioná-lo em camadas delgadas em um
aparelho chamado micrótomo. A parafina e a resina sintética são as mais utilizadas.

E) Microtomia

Esta etapa consiste, basicamente, em utilizar um micrótomo para obter cortes

sucessivos, delgados e uniformes, a partir dos tecidos inclusos em blocos de parafina ou
resina. A espessura e a uniformidade dos cortes dependem da firmeza com que a navalha
passa pelo material. Para tanto, aconselha-se o uso de micrótomos automáticos. O avanço da
navalha é regulável e pode fornecer corte com espessuras de 0,5 a 12µm.
Após a microtomia, os cortes são distendidos em água á temperatura
ambiente e coletados em lâminas histológicas. Estes cortes devem ser secos em estufas a
45ºC ou em chapa aquecida.

F) Coloração

A coloração consiste numa etapa muito importante para a visualização das estruturas
do tecido. Normalmente são utilizados corantes hidrossolúveis, sendo necessária a remoção
da parafina ou resina da peça que foi preparada nas etapas descritas anteriormente e que
permanece na lâmina de vidro.
Existem muitos tipos de corantes, mas de um modo geral eles diferenciam os
componentes ácidos e básicos das células e os componentes fibrosos da matriz extracelular.

20
 G) Montagem

Após a coloração do material na lâmina, torna-se necessário conservar esse material

corado. Recomenda-se cobrir o corte com lamínula, utilizando uma resina de montagem (ex:
entellan). A lamínula pode ser vedada com auxílio de esmalte incolor.

Outras formas de se obter camadas únicas de células

Esmagamento: Consiste em esmagar, entre lâmina e lamínula, o material a ser

analisado. Pode-se corar o material juntamente com o processo de esmagamento ou retirar a
lamínula com auxílio de nitrogênio líquido, e fazer a coloração logo após.
Decalque: consiste em comprimir suave e firmemente a superfície de um fragmento
do material freso sobre uma lâmina. As células superficiais se destacam e aderem à lâmina,
sendo em seguida fixadas e coradas. Esses preparados são úteis para a obtenção de núcleos
livres de citoplasma.
Esfregaço: células livres presente em líquidos corpóreos, como sangue, linfa, sêmem,
líquor, podem ser dispostas sobre lâmina em fina camada de maneira que possam ser
observadas em microscópio de luz. Coloca-se uma gota do liquido sobre a extremidade de
uma lâmina e espalha-se o material uniformemente sobre a mesma com a o auxílio de outra
lâmina inclinada em um ângulo de cerca de 45 graus.

Tipos de cortes histológicos

Os cortes podem ser de 4 tipos: transversal (quando feito paralelamente ao menor

comprimento do material); longitudinal (quando feito paralelamente ao maior comprimento
do material; paradérmico (para obtenção de epidermes) e oblíquo.
Para observação in vivo, principalmente de material vegetal, os cortes são feitos à mão
livre, os quais podem ser realizados de 2 maneiras:
1. Sem meio de inclusão: Utiliza-se de uma lâmina cortante para a obtenção de
cortes finos do material.
2. Com meio de inclusão: Muitas vezes a textura do material a ser cortado não
permite a obtenção de cortes delgados sem o uso de meios de inclusão, os quais envolvem o
material auxiliando desse modo a obtenção de cortes finos.
Como exemplo de meios de inclusão para cortes à mão livre tem a medula de
imbaúba, isopor, cortiça, medula de girassol, etc.

Interpretação dos cortes

Deve-se ter em mente que a figura que se vê representa apenas uma secção do
objeto. Essa figura é bidimensional, e as células têm três dimensões. Por esse motivo, deve-se
fazer uma série de cortes sequenciais e a partir deles, faz-se a reconstrução mental, por
superposição, da forma em 3 dimensões.

21
Figura 3.1 – Interpretação de cortes.

22
 Atividade 3

Objetivos:
1. Mostrar como se faz coleta e fixação de material
2.Treinar a obtenção de cortes delgados à mão livre.
3.Distinguir os três tipos de cortes.
4.Observar células vegetais e diferenciá-las das células animais.

1 – Coleta e fixação de material (raiz de cebola)

Procedimento: 1) Retirar as raízes velhas da parte inferior do bulbo de uma cebola com uma
lâmina de barbear. 2) Colocar os bulbos previamente (três dias antes) sobre um recipiente
com água, de maneira que apenas a parte inferior do bulbo toque a água. Esperar emitirem
raízes. 3) Preparar fixador Carnoy, composto de metanol e ácido acético, nas proporções de 3
partes de metanol para 1 parte de ácido acético. 4) Quando as raízes tiverem entre 0,5 cm e
1cm, seccionar a extremidade com o auxílio de uma lâmina de barbear ou de pinça de ponta
fina. 5) Imediatamente após a retirada as raízes devem ser mergulhadas no fixador Carnoy. 6)
Após coletadas e fixadas, as raízes poderão ser armazenadas em freezer a -20ºC. Essas raízes
poderão ser guardadas e utilizadas em outras aulas práticas.

2 – Cortes à mão livre (folhas de Sansevieria sp.)

Procedimento:
- Corte paradérmico (camada fina, transparente, paralelo a superfície do órgão) de folhas de
Sansevieria sp.
Com o auxílio de uma lâmina de barbear, prepare cortes paradérmicos da folha da espada de
São Jorge. Verifique se a espessura dos cortes está adequada e coloque-os na placa de Petri
com água. Os cortes devem ser pequenos e transparentes.
- Corte transversal (perpendicular ao eixo principal do órgão) de folhas de Sansevieria sp.
Com o auxílio da lâmina de barbear, prepare um corte transversal da folha de espada de São
Jorge. Coloque o melhor corte ao lado do corte paradérmico.
- Corte longitudinal (paralelo ao eixo principal do órgão) de folha de Sansevieria sp.
Com o auxílio da lâmina de barbear, prepare um corte longitudinal da folha de espada de São
Jorge, procedendo da mesma maneira que no item anterior.

Faça um esquema de cada um dos cortes, utilizando a segunda objetiva a seco:

1) Paradérmico 2) Transversal 3) Longitudinal

23
Esquematize agora um grupo de células epidérmicas nos cortes paramétrico, transversal e
longitudinal, utilizando as objetivas 10 e 40 x.

1) Paradérmico 2) Transversal 3) Longitudinal

3 – Qual a importância da fixação para as preparações citológicas?

4 – As células epidérmicas têm a mesma forma nos 3 tipos de cortes? Por quê?

5 – Baseado em seus esquemas, indique como você poderia distinguir os cortes paradérmicos,
transversal e longitudinal, em uma observação microscópica.

24
 4 – Métodos Citoquímicos e
Organização Molecular
Importância da coloração e identificação dos
componentes químicos da célula

As diferentes estruturas celulares interagem praticamente da mesma forma com a

luz, sendo que a velocidade com que a luz atravessa os diferentes compartimentos celulares é
muito próxima. Isto é conseqüência da constituição química e da densidade dos diferentes
componentes celulares, ou seja, dos seus índices de refração. As pequenas diferenças nos
índices de refração não são suficientes para dar contraste às diversas estruturas celulares.
Logo, o que podemos aprender sobre as células depende dos instrumentos que dispomos e
dos enormes avanços na biologia celular surgidos, devido à introdução de novas técnicas.
Entre essas, incluem-se as diversas técnicas de citoquímica, histoquímica, imunocitoquímica,
auto-radiografia, hibridação in situ, entre outras, que permitem a localização ao microscópio
de luz ou eletrônico, de componentes químicos específicos que compõe as células e tecidos.
Essas técnicas baseiam-se em reações químicas desenvolvidas entre a substância pesquisada
e o reagente utilizado, que resulta numa resposta colorida.
O uso de corantes é o método mais comumente utilizado no preparo de lâminas para
estudos de Biologia Celular. As substâncias denominadas corantes são aquelas que
apresentam capacidade de ligação diferencial a componentes químicos específicos da célula,
permitindo sua identificação e localização. Para ser utilizada como corante, uma substância
deve possuir cor e capacidade de ligação a grupos químicos específicos das células ou de seus
produtos.
A cor apresentada pela molécula de um corante é atribuída à presença de grupos
cromofóricos (ou cromóforos). Estes grupos apresentam uma região da molécula capaz de
absorver os raios luminosos de determinados comprimentos de onda e refletir as radiações
complementares não absorvidas. Corantes vermelhos, por exemplo, apresentam intensa
absorção de luz de comprimentos de onda correspondentes a outras corres, em especial o
verde, deixando passar aqueles referentes ao vermelho.
Nesta aula veremos os princípios dos métodos citoquímicos e como eles podem ser
usados para detectar os diferentes componentes químicos das células.

Citoquímica

A citoquímica é uma área da biologia celular e estrutural dedicada aos estudos dos
métodos de coloração dos tecidos e dos constituintes celulares ou subcelulares, preocupando-
se não somente com os princípios químicos das reações de coloração, mas também com os
procedimentos protocolares para obtenção de preparados a serem avaliados ao microscópio.
Muitos são os elementos que podem ser estudados citoquimicamente, tanto para a pesquisa
25
científica como para fins de diagnóstico patológico. Dentre eles, podemos citar, os ácidos
nucléicos, os polissacarídeos, os lipídios, as proteínas, alguns íons e enzimas.
Para que essa técnica tenha sucesso são necessários que sejam cumpridos alguns
princípios básicos: a) o produto a ser pesquisado deve ser insolúvel, o que evita a sua difusão
para outras regiões das células e dos tecidos; b) é indispensável que o produto da reação
apresente cor ou, pelo menos, apresente-se na forma de um precipitado insolúvel no local da
reação; c) a reação colorida desenvolvida deve ser específica, isto é, só deve ocorrer com o
composto pesquisado; d) a reação também deve ser sensível para detectar quantidades muito
pequenas do produto colorido formado.
As reações citoquímicas podem ser divididas em 3 tipos diferentes, dependendo da
natureza da reação química envolvida: (a) por ligações eletrostáticas; (b) por ligações
covalentes; (c) por interações hidrofóbicas.

A) Ligações Eletrostáticas

Neste caso, um corante ionizado em uma solução reage com um substrato de carga
iônica oposta. Assim, podemos enumerar dois fenômenos citoquímicos: acidofilia e basofilia.
Entende-se por acidofilia como o fenômeno citoquímico no qual um substrato carregado
positivamente, chamado de substrato catiônico, reage eletrostaticamente com um corante
carregado negativamente, dito aniônico. Por ligação iônica, esses dois elementos reagem e
formam um composto colorido, evidenciado ao microscópio de luz. Como exemplos de
corantes aniônicos têm-se o xylidine ponceau, o Sirius Red, o Fast Green e a eosina.
Já no fenômeno da basofilia, o substrato carregado negativamente chamado de
substrato aniônico, reage eletrostaticamente com um corante carregado positivamente, dito
catiônico. Como exemplo de corantes catiônicos pode-se citar os corantes Azul de Toluidina,
Azul de metileno e o Azul de Alcien. A hematoxilina, embora não seja um corante, pode ser
considerada um complexo de corantes que comportam-se como corante catiônico. Esses
corantes reagem com os elementos ionizáveis nos tecidos que apresentam cargas negativas,
os grupamentos aniônicos.
Uma das técnicas de coloração, muito utilizada na citologia e na histologia animal, é a
coloração pela hematoxilina e eosina (HE). A hematoxilina, por ser um corante básico, cora o
núcleo (cor azul), devido aos ácidos nucléicos presentes. A eosina por ser um corante ácido
cora o citoplasma (cor rosa) dada a predominância de proteínas básicas nesta região celular.
Este tipo de coloração, envolvendo a afinidade ácido-base, embora facilite o estudo da
morfologia celular, não possibilita maiores informações a respeito da composição química das
estruturas coradas.

B) Ligações Covalentes

Nessas técnicas, a interação entre os corantes e as substâncias pesquisadas é feita

por ligações covalentes. Embora, não se tenha ainda descrito o princípio exato dessas reações,
essas técnicas são muito difundidas e utilizadas na histopatologia e na pesquisa científica na
área de biologia celular e tecidual. Os exemplos mais clássicos das reações citoquímicas

26
mediadas por ligações covalentes são a reação de Feulgen, para DNA e o teste do Ácido
Periódico Schiff (PAS), para polissacarídeos neutros. Ambas as reações são obtidas a partir de
um mesmo reagente chamado de Reativo de Schiff, que consiste num leucoderivado do
corante Fucsina Básica.
A reação de Feulgen utiliza como pré-tratamento do material uma hidrólise ácida com
ácido clorídrico (HCl). Essa hidrólise remove da molécula de DNA as bases púricas, adenina e
guanina, processo chamado de depurinação do DNA, que consequentemente abre o anel
liberando grupos aldeídos. No tratamento com o reativo de Schiff ocorre a reação radicais
aldeídos-reativo de Schiff promovendo uma coloração rósea ou magenta ou bonina.
O teste de PAS é muito utilizado para avaliações citoquímica de polissacarídeos
neutros, como o glicogênio, o amido e a celulose. Ele utiliza como pré-tratamento do material
o ácido periódico (HIO4). Esse ácido oxida os grupos hidroxila livres em dois átomos de
carbono adjacentes (grupos glicólicos, chamados de vic-glicol ou amino glicol, dependendo do
tipo de carboidrato), produzindo radicais aldeídos, ou seja, há quebra da ligação entre os
carbonos e conversão à aldeído. Os radicais aldeídos reagem com o reativo de Schiff
promovendo uma coloração rósea ou magenta ou bonina.
Na técnica de PAS, como vários carboidratos respondem positivamente à reação de
PAS, pode utilizar reações complementares para se fazer a distinção entre eles. A distinção
entre glicoproteínas neutras e glicoproteínas ácidas e de outros glicoconjugados, por exemplo,
é feita associando-se à técnica PAS com a técnica de Alcien Blue (azul de Alcien). A
positividade ao Alcien Blue é indicada pelo aparecimento de componente corado de cor azul
celeste. O Alcien Blue, quando preparado em diferentes pHs, marca componentes celulares
ditintos: no pH 0,5 evidencia glicoconjugados ácidos sulfatados e no pH 2,5 glicoconjugados
ácidos sulfatados, glicoconjugados ácidos carboxilados e glicoproteínas ácidas.
Vale ressaltar que a técnica de Feulgen é semelhante à do PAS, ou seja, ambas
utilizam o reativo de Schiff, após exposição dos radicais adeídos. A diferença é que na técnica
do PAS usa-se o ácido periódico enquanto na de Feulgen usa-se o ácido clorídrico para
quebrar as moléculas pesquisadas.

C) Interações Hidrofóbicas

Essas reações são específicas para lipídios não polares, como, por exemplo, os
triglicerídeos e derivados de colesterol. Essas colorações partem do princípio que os lipídios
não polares são altamente hidrofóbicos, portanto esses corantes interagem com os lipídios
hidrofobicamente. Dentre os corantes específicos para os lipídios, podemos citar o Sudan
Black, o Sudan III, e o Azul de Nilo. Os métodos para evidenciar lipídios requerem fixação em
formol ou cortes por congelamento. Apenas os fosfolipídios podem ser evidenciados em cortes
de parafina, pois resistem ao tratamento com álcool, xilol e a própria inclusão em parafina.

27
 Atividade 4

Objetivos:
1. Conhecer os diferentes tipos de corantes.
2. Observar o material biológico antes e após a coloração.
3. Relacionar a constituição química da célula e a utilização de corantes ácidos e
básicos.
4. Justificar a importância dos corantes na microscopia de luz.

1 – Importância da coloração na microscopia de luz: preparo de lâminas de células da

mucosa bucal.
Procedimento 1: Coloque uma gota de solução salina sobre uma lâmina. Com um palito de
fósforo faça uma leve raspagem na mucosa bucal. Transfira o material para a gota de solução
salina. Cubra o material com a lamínula e observe ao microscópio, utilizando as lentes
objetivas de 4X, 10X e 40X. Após a observação com a lente objetiva de 40X, volte à lente
objetiva de 4X e retire a lâmina do microscópio.
Procedimento 2: Coloque uma gota do corante azul de metileno em uma das bordas da
lamínula da lâmina preparada no procedimento 1. Encoste um pedaço de papel de filtro no
lado oposto ao da gota de corante. O papel absorverá a solução salina, permitindo que o
corante passe por capilaridade para o espaço entre a lâmina e a lamínula. Aguarde alguns
minutos e observe o material ao microscópio as lentes objetivas de 4X, 10X e 40X.
Represente o material observado no aumento de 400x.

a) Nesta lâmina podemos observar alguns detalhes das células da mucosa. Por que
nem todas as estruturas citológicas puderam ser vistas?
________________________________________________________________
______________________________________________________________

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b) Houve dificuldade na observação das células antes da coloração? Justifique.
________________________________________________________________
________________________________________________________________

c) Qual foi o efeito do corante sobre as células?

________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) O que se entende por substância corante?

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________________________________________________________________

2 – Sobre a sua bancada encontram-se raízes de cebola coradas com reativo de Schiff
(Reação de Feulgen). O que é evidenciado pelo reativo de Schiff nas células dessas
raízes? Qual o princípio dessa reação? Compare a reação de Feulgen com o teste de
PAS.
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________________________________________________________________

3 – Focalize uma lâmina de fígado corada pelo método hematoxilina-eosina (HE),

esquematize um hepatócito observado com a lente objetiva de 40X indicando o
núcleo, o citoplasma e o nucléolo e responda às questões abaixo.

29
a) Qual é a cor predominante no citoplasma das células coradas e qual é o corante
responsável?

_______________________________________________________________

b) Cite alguns exemplos de corantes ácidos e corantes básicos.

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c) O que caracteriza quimicamente os corantes ácidos e básicos?

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________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) O que são estruturas acidófilas e basófilas?

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________________________________________________________________

e) A que se deve a basofilia apresentada pelo núcleo e a acidofilia apresentada pelo

citoplasma?
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________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

f) Quais são as limitações apresentadas pelas técnicas de coloração que envolvem

interações eletrostáticas?
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________________________________________________________________

30
 5 – Células Procariotas e
Eucariotas
Diferenciação das células procariotas e eucariotas sob o
microscópio de luz

A célula é a unidade estrutural e funcional de todo ser vivo. Sabemos que o universo
biológico é constituído por diferentes grupos de organismos que são classificados e ordenados
em gêneros, família, ordem e reinos. Encontramos, portanto, uma diversidade de tipos
celulares nesses organismos. A Biologia Celular atua identificando tipos celulares e seus
componentes, compreendendo a organização estrutural desses elementos e de suas
respectivas funções. Apesar dessa diversidade, apenas duas categorias celulares podem ser
reconhecidas: células procariotas e células eucariotas. Estas classes de células são
diferenciadas por seu tamanho e pelos tipos de estrutura interna e organelas que as
compõem.
As células procariotas são estruturalmente mais simples e são representadas por
todos os tipos de bactérias e algas azuis que constituem o Reino Monera. Todos os outros
tipos de organismos – protistas, fungos, plantas e animais – são constituídos por células
eucariotas, mais complexas.
Ao microscópio óptico, o que mais chama a atenção é a grande diferença de tamanho
entre as células eucarióticas e procarióticas típicas. Por vezes pode-se observar células
procarióticas, como as cianofíceas, cujo tamanho está próximo ou mesmo é maior que
algumas células eucarióticas. Entretanto, a regra é que os procariontes geralmente têm
células muito menores que os eucariontes.
Outra diferença bem marcante é a presença do núcleo nos eucariontes e sua
ausência nos procariontes. Internamente, não só a presença do núcleo difere os dois tipos de
células, mas também a intensa compartimentalização das diversas funções celulares em
organelas envoltas por membranas – o sistema de endomembranas – característico das
células eucariontes. O sistema de endomembranas é de difícil visualização ao microscópio
óptico, sendo observado somente ao microscópio eletrônico. Logo, utilizando microscópios
comuns, a característica mais notável para diferenciar os dois tipos de organização celular é a
observação de presença/ausência de núcleo.
Nesta aula iremos ver as características gerais dos dois tipos celulares, observando as
semelhanças e divergências referentes à sua organização. Posteriormente iremos observar
células eucariotas e procariotas no microscópio de luz a fim de diferenciá-las.

Organização Celular em Procariotos

As células procariotas são assim denominadas, pois não possuem um núcleo envolto
por membrana (carioteca). A palavra procarioto é constituída do prefixo pro que significa

31
“antes” e do sufixo karyon que significa “parte central” ou núcleo, portanto tem o significado
de “anterior ao núcleo”. Sem o envoltório nuclear, o material genético dessas células ocupa
um espaço denominado nucleóide e está em contato direto com o citoplasma ao seu redor. O
DNA das células procariotas pode atingir comprimento entre 0,25mm a 3mm sendo
suficiente para codificar centenas e milhares de proteínas necessárias para seu
desenvolvimento. Além disso, o DNA é organizado como um simples cromossomo circular,
constituindo um DNA “nu”, sem associação com proteínas.
A organização do citoplasma das células procariotas é bastante simples: ele é
desprovido de estruturas membranosas, as organelas. No citoplasma estão presentes apenas
os ribossomos, estruturas supramoleculares constituídos de proteínas e RNA, que constituem
as bancadas para a síntese protéica, e o nucleóide.
As células procariotas são envoltas por membranas biológicas, tridimensionais e por
paredes celulares rígidas, as quais protegem a delicada forma de vida presente em seu
interior. Em relação à divisão celular, os procariotos têm um mecanismo simples: o DNA do
nucleóide é duplicado pela maquinaria protéica, as duas cópias são separadas unicamente e
de forma precisa através do crescimento de uma membrana celular divisória.
Os procariotos são seres assexuados, possuem uma única cópia de seu único
cromossomo e não produzem gametas. Logo, eles não têm fertilização verdadeira. No
entanto, alguns são capazes de trocar fragmentos de DNA entre cromossomos de células
diferentes, processo este denominado conjugação.
No que diz respeito à motilidade, os procariotos possuem flagelos, um filamento
protéicos fino que se projeta para fora da célula sendo capaz de girar. A rotação do flagelo
exerce pressão no fluido circundante e força a célula a propulsionar-se através do meio,
locomovendo o organismo.
Do ponto de vista evolutivo os procariotos são os seres mais antigos do planeta.
Acredita-se que durante 2 bilhões de anos eles foram os únicos residentes vivos da Terra. Os
primeiros eucariotos teriam surgido de procariotos, daí as semelhanças encontradas entre
esses dois tipos de células, as quais serão descritas a seguir.

Organização Celular em Eucariotos

Como foi visto as células eucariotas certamente evoluíram a partir de células

procariotas ancestrais. Em função da existência de um ancestral comum as células eucariotas
compartilham semelhanças com células procariotas: apresentam uma linhagem genética
idêntica codificada no DNA; possuem mecanismos de transcrição e tradução da informação
genética e ribossomos similares; possuem maquinaria de conservação de energia química
(ATP) em membranas biológicas; compartilham passos metabólicos como glicólise, ciclo do
ácido tricarboxílico e fotossíntese similares; possuem um membrana plasmática com mesma
constituição molecular, a qual delimita a célula constituindo uma barreira seletiva e permeável
entre o mundo vivo e o inanimado.
A diferença básica existente entre uma célula procariota e uma célula eucariota está
na organização do material genético. O DNA das células procariotas está disperso no
citoplasma em uma região denominada nucleóide, enquanto nos eucariotos o material

32
genético está associado a proteínas e envolto por uma estrutura membranosa complexa
constituindo o núcleo da célula. A palavra eucarioto, portanto, tem significado de “núcleo
verdadeiro” em função do prepfixo eu que significa verdadeiro, seguido do sufixo karyon. O
DNA de uma célula eucariota é muito mais complexo e extenso do que de uma célula
procariota, podendo atingir metros de comprimento além de ser distribuído em numerosos
cromossomos.
Analisando superficialmente uma micrografia eletrônica de uma célula eucariota
observa-se que seu citoplasma é preenchido por uma diversidade de estruturas que
constituem as organelas membranosas. As mitocôndrias são as organelas mais notáveis no
citoplasma e estão presentes essencialmente em todas as células realizando a respiração
celular, onde energia química na forma de ATP é produzida a partir da oxidação de moléculas
orgânicas. Os plastídeos constituem outro grupo de organelas membranosas que estão
presentes apenas em cianobactérias e células vegetais. É nos cloroplastos que ocorre a
fotossíntese processo no qual a energia solar é transformada em energia química através da
fixação de carbono e liberação de oxigênio. Além dessas duas organelas membranosas o
citoplasma de uma célula eucariota é constituído por uma rede de endomembranas da qual
fazem parte o retículo endoplasmático (liso e rugoso), o complexo de Golgi, endossomos e
lisossomos. Juntas, essas organelas são responsáveis pela produção, ordenação, modificação e
transporte de moléculas biológicas a partir de em produto bruto. O destino final dessas
moléculas pode ser organelas celulares, membrana plasmática, meio extracelular ou
lisossomos. Os lisossomos constituem organelas amorfas cuja função é a digestão intracelular.
Além das organelas citadas até então uma célula eucariota possui em seu citoplasma
inúmeras vesículas membranosas simples que possuem formas, tamanhos e funções variadas.
Entre elas citam-se vesículas envolvidas no transporte de material de uma organela a outra e
vesículas enzimáticas, como os peroxissomos, responsáveis pela degradação do peróxido de
hidrogênio. Neste sentido as membranas presentes nas organelas das células eucariotas
funcionam como divisórias no citoplasma permitindo a compartimentalização e especialização
de atividades celulares.
O citoplasma da célula eucariota se comporta como um gel aquoso onde está contido
um gama de moléculas sendo o local de ocorrência de muitas reações químicas fundamentais
a existência da célula. Ele contém ainda túbulos e filamentos que são ancorados em uma das
extremidades das membranas que se irradiam por toda a célula, constituindo o citoesqueleto.
A rede interna de filamentos do citoesqueleto é constituída por proteínas e auxiliam na
estruturação e manutenção da forma da célula.

33
 Atividade 5

Objetivos:
1. Diferenciar células procariotas e eucariotas.
2. Diferenciar células eucariotas animais de células eucariotas vegetais.

1 – Observação de células procariotas (bactéria de iogurte).

Procedimento: Sob uma lâmina coletar uma pequena porção de coalhada. Pingar uma gota de
água e dissolver bem. Fazer um esfregaço, tomando-se o cuidado de identificar o lado da
lâmina no qual encontra-se o esfregaço. Secar bem a lâmina, podendo utilizar chapa aquecida.
Pingar 3-4 gotas da mistura álcool-clorofórmio. Secar o preparado movimentando a lâmina no
ar. Em seguida, pingar 2 gotas de azul de metileno, espalhando-o pela lâmina. Aguardar 5
minutos, lavando com água destilada. Limpar o excesso de água e levar ao microscópio para
observação em objetiva de 10x e 40x. Fechar um pouco o diafragma após a localização do
material. Represente o material observado no aumento de 400x.

2 – Observação de células eucariotas unicelulares (levedo de pão).

Procedimento: Tome uma porção de fermento de pão, dissolvendo-o em água morna. Junte
açúcar, deixando descansar por 15 a 20 minutos. Pingue uma gota da suspensão sobre uma
lâmina, adicione uma gota do corante azul de metileno, cubra com lamínula e observe ao
microscópio com as objetivas de 10x e 40x. Esquematize no aumento de 400x.

3 – Observação de células eucariotas vegetais (catafilo de cebola).

Procedimento: Retirar delicadamente um pedaço da epiderme do catafilo da cebola com
auxílio de uma pinça; Distender suavemente o material coletado sobre a lâmina, com auxílio de
um pincel molhado em água; Pingar sobre o material distendido uma gota de água; Cobrir com
a lamínula; pingar em uma das extremidades da lamínula uma gota de azul de metileno e com
auxílio de papel filtro, aspirar na margem oposta até a infiltração do corante; Analisar em
aumentos crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x. Esquematizar no aumento de
400x.

1) bactéria de iogurte 2) levedo de pão 3) catafilo de cebola

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4 – Quais as características observadas nas células das bactérias, do levedo de pão e
do catafilo? Como você diferenciaria estas células através de suas observações?
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5 – Compare as células da bactéria e da cebola com as células da mucosa bucal

observada na aula anterior.
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6 - Quais as principais diferenças internas que não puderam ser observadas ao

microscópio de luz?
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35
 6 – A Célula Vegetal
Parede Celular, Vacúolo e Plastídios

A biologia celular das plantas é essencialmente similar à dos animais, ou seja, a célula
é a unidade estrutural do vegetal. No entanto, a célula vegetal apresenta alguns aspectos
especiais, como parede celular, mais ou menos rígida, envolvendo o protoplasto; um ou mais
vacúolos, que são cavidades cheias de líquido que se encontram no citoplasma; e organelas
exclusivas, os plastídios, relacionados com os processos de armazenamento e fotossíntese.
Nesta aula iremos ver os aspectos gerais destes três constituintes particulares da célula
vegetal.

Parede Celular

A parede celular primária, formada por um esqueleto de celulose e uma matriz de

natureza glicídica (hemicelulose e pectina) e protéica (extensina), é uma estrutura típica de
células vegetais. Os polímeros de celulose, principal componente da parede, são agrupados
em microfibrilas formando um arcabouço preenchido por uma matriz de moléculas, dentre
elas destacam-se: as hemiceluloses (variam entre diferentes tipos celulares e entre os
diferentes grupos de plantas), as pectinas (comuns nas primeiras camadas formadas na
parede celular e na lamela mediana), glicoproteínas, enzimas, lignina (confere resistência) e
substâncias graxas (cutina, suberina e ceras).
A parede celular primária limita a expansão do protoplasto, evitando a ruptura da
membrana plasmática quando o protoplasto aumenta de volume em decorrência da entrada
de água. A parede celular também determina, em grande parte, o tamanho e a forma da
célula vegetal e a textura do tecido, contribuindo para a forma final do órgão vegetal. Além
dessas funções, a parede celular pode apresentar papel na defesa ativo contra fitopatógenos
(bactérias e fungos).
Quando inicia-se o processo de diferenciação celular, dependendo da função que
célula vegetal irá desempenhar, ocorre deposição de grande quantidade de celulose, formando
a parede secundária internamente à parede primária. A matriz da parede secundária é
constituída de hemicelulose. A parede secundária aumenta a resistência, especialmente nas
células do xilema.
Uma característica importante da parede é a presença poros que interligam células
vizinhas e por onde passam os plasmodesmos (canais citoplasmáticos que permitem trocas
entre as células). Estes poros originam-se em decorrência da não deposição de componentes
químicos em alguns locais da parede.

36
 Vacúolo

O vacúolo, assim como os plastídios e a parede celular, separam as células vegetais

das animais. Essa organela é delimitada por uma membrana denominada tonoplasto e
origina-se diretamente do retículo endoplasmático ou, mais comumente, do complexo de
Golgi.
Os vacúolos são preenchidos pelo suco vacuolar, contendo, especialmente, água, íons
inorgânicos (Ca2+, K+, Cl-, Na+, HPO42-), açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, e cristais de
oxalato de cálcio. Esses últimos podem apresentar diferentes formas.
A célula vegetal imatura tipicamente apresenta numerosos pequenos vacúolos. Ao
longo do desenvolvimento celular, os vacúolos aumentam de tamanho e se fundem formando
uma única organela que ocupa cerca de 90% do volume celular. Esse fato promove o
desenvolvimento de uma pressão interna e a manutenção da rigidez do tecido.
Além dessa funções, os vacúolos:
a) são compartimentos de armazenamento de metabólitos primários (açúcares,
ácidos orgânicos e proteínas de reserva nas sementes) e secundários (nicotina e taninos).
b) são sítios de acúmulo de antocianinas, que conferem coloração a alguns tecidos e
órgãos dos vegetais.
c) estão envolvidos na quebra de macromoléculas e na reciclagem de componentes
celulares. Nesse caso, os vacúolos são comparáveis aos lisossomos das células animais.

Plastídios

Em células vegetais ocorrem organelas típicas denominadas plastídios. Estas organelas

estão presentes em todas as células vegetais e compartilham características comuns, tais
como:
a) são circundadas por duas membranas concêntricas,
b) possuem um genoma próprio (nucleóide), bem como uma maquinaria para
biossíntese protéica, por isso denominadas organelas semi-autônomas.
Os plastídios se desenvolvem a partir de proplastídios, pequenas organelas presentes
em células meristemáticas que se diferenciam em um determinado tipo de plastídio, em
função da célula em que se encontra e dos estímulos ambientais. A figura 6.1 representa o
ciclo de desenvolvimento e conversão do proplastídio.
Os plastídios diferem entre si em virtude das suas características estruturais e dos
compostos químicos que armazenam. Desta forma, os plastídios podem ser assim
classificados em:

A) LEUCOPLASTOS

Plastídios maduros menos diferenciados estruturalmente em virtude da perda de

pigmentos e por não apresentarem um sistema interno de membranas elaborado. Esses
plastídios armazenam substâncias de reserva e estão presentes principalmente em células de
raízes, caules, frutos e sementes. Dentre os leucoplastos listam-se:

37
 1 – amiloplastos, armazenamento de amido, presentes em grande quantidade em
caules e raízes, além de serem encontrados em folhas, armazenando o excedente de
carboidrato oriundo da fotossíntese;
2 – proteoplastos, armazenamento de proteína, e
3 – elaioplastos, armazenamento de lipídios, encontrados em células de frutos e
sementes;

B) CROMOPLASTOS

Plastídios que contêm em seu interior pigmentos coloridos. Essas organelas

apresentam formas variadas, sintetizam e retêm pigmentos do grupo dos carotenóides. Esses
compostos conferem coloração a muitas flores e alguns frutos e raízes. Os cromoplastos
podem se originar a partir de cloroplastos preexistentes, por uma conversão na qual a
clorofila e a estrutura interna de membrana dos cloroplastos desaparecem e uma grande
quantidade de carotenóides se acumula. Dentre os cromoplastos listam-se:
1 – xantoplastos, possuem pigmentos que conferem cor amarela (xantofilas), e
2 – eritroplastos, possuem pigmentos que conferem cor vermelha.
Esses plastídios possuem importância adaptativa, uma vez que atuam como atrativo
para organismos dispersores de pólen (cor da flor) e de sementes (cor do fruto).

Cloroplasto

Estioplasto

Cromoplasto
Proplastídio

Elaioplasto
Amiloplasto
oooo
C) CLOROPLASTOS

São plastídios que contêm pigmentos (clorofilas e carotenóides) relacionados com a

ocorrência da fotossíntese. As clorofilas são os pigmentos responsáveis pela coloração verde
dessas organelas. Os cloroplastos geralmente apresentam forma discóide, medindo cerca de 4
a 6 micrômetros. Uma célula vegetal pode possuir de 40 a 50 cloroplastos, os quais se

38
dispõem paralelamente à parede celular, podendo reorientar-se na célula sob influencia da
luz.
A estrutura interna dos cloroplastos é caracterizada pela ocorrência do estroma, o
qual é atravessado por um sistema de membranas na forma de sacos achatados denotados
tilacóides. Acredita-se que os tilacóides constituam um único sistema interconectado. O
conjunto de tilacóides empilhados é denominado grana, sendo que os diferentes granum
(plural de grana) são interligados pelos tilacóides que atravessam o estroma. Os carotenóides
e as clorofilas estão inseridos na membrana do tilacóide.
Os cloroplastos não são apenas o sítio da fotossíntese, mas também estão envolvidos
na biossíntese de aminoácidos e ácidos graxos, e no armazenamento temporário de
carboidratos como o amido.

39
 Atividade 6

Objetivos:
1 . Diferenciar células de diferentes tecidos com base em suas paredes celulares.
2 .Observar a presença de substâncias no vacúolo.
3 . Observar inclusões sólidas no vacúolo.
4 . Observar os cloroplastos.

1 – Observação de clorosplastos, vacúolo e parede celular de folhas de Tradescantia sp.

Procedimento: a) Retirar uma película da epiderme inferior da folha de Tradescantia,
com o auxílio de uma lâmina de barbear; b) Colocar este material sobre a lâmina com
uma gota de água e cobrir com lamínula iniciando sua colocação em posição de 45°
com relação à lâmina e ir abaixando lentamente até que a mesma fique totalmente
sobre a lâmina, evitando a formação de bolhas; c) Caso haja excesso de líquido, retirar
com papel absorvente, para manter a lamínula fixa; d) Analisar em aumentos
crescentes, utilizando as objetivas de 4x, 10x e 40x; e) Esquematizar em aumento de
400x.
Observar: 1 – Estômatos, constituídos pelas células-guarda, células subsidiárias ou
acessórias na epiderme da folha; 2 – Parede celular, citoplasma, cloroplastos e núcleo.

2 – Observação de diferentes plastídios presentes em raízes, folhas e frutos.

Procedimento: a) Faça cortes finos de frutos imaturos e maduros de Solanum
lycopersicum Mill. (tomate). Coloque-os em placas de Petri com água. Escolha os mais
finos e coloque-os na lâmina que já deverá estar com uma gota de água. Reserve. b)
Faça cortes finos de raiz tuberosa de Daucus carota L. (cenoura) e coloque-os em placa
de Petri com água. Escolha o mais fino e coloque-o ao lado dos outros 2 cortes de
tomate. Reserve. c) Faça cortes finos transversais de Sanservieria sp.. Coloque-os na
placa de Petri com água. Escolha o mais fino e coloque-o junto aos outros 3 cortes. d)
Cubra os 4 cortes com uma lamínula.

40
3 – Observação de amiloplastos evidenciados com lugol.
Procedimento: a) Faça cortes finos no tubérculo de Solanum tuberosum L. (batata); b)
Coloque os cortes em placa de Petri com água e retire o excesso de plastídios com o
auxílio do pincel; d) Coloque o corte lavado sobre uma gota de lugol e cubra-o com
uma lamínula; e) Observe ao microscópio utilizando a segunda objetiva a seco.

Preencha o quadro abaixo de acordo com suas observações:

Plastídio (s)
Classificação Esquema
presente (s)

Batata

Tomate
Imaturo
Corte Obsevado

Tomate
Maduro

Cenoura

Espada de
São Jorge

4 – O que você observou nos cortes onde se utilizou o lugol? (Espada de São Jorge,
batata e tomate verde).
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______________________________________________________________

5 – Como você explica a ocorrência de 3 tipos de plastídios no tomate? Dê suas

funções, justificando suas presenças em relação à fase em que se encontra o fruto.

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________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
______________________________________________________________

6 – Observação de parede primária e secundária em caule de caruru.

Procedimento: a)Com o auxílio da lâmina de barbear faça cortes transversais no
material colocado sobre o balcão (caule) e coloque-os na água na placa de Petri; b)
Coloque uma gota do corante Verde Iodo Acético em uma das extremidades da
lâmina juntamente com 2 cortes delgados e deixe que o corante atue por 5 minutos; c)
Retire os cortes do corante com o auxílio do pincel e lave-os na água da placa de Petri.
d) Coloque uma gota do corante Vermelho Congo na outra extremidade da lâmina
utilizada na coloração acima e transfira os 2 cortes, já lavados, para esse corante e
deixe atuar por 2 minutos; e) Retire os cortes do corante e lave-os na placa de Petri; f)
Transfira os cortes corados e lavados para outra lâmina limpa, com uma gota d’água,
cubra com a lamínula; g) Observe ao microscópio, utilizando a segunda objetiva a seco.

Esquematize uma porção do campo observado, desde a epiderme até a medula.

42
 7 – Permeabilidade Seletiva das
membranas
Introdução

As células de qualquer organismo estão envoltas pela membrana celular. A

constituição dessa membrana promove a passagem controlada de substâncias e o
conseqüente equilíbrio dinâmico no interior do organismo.
Permeabilidade seletiva é um processo fundamental para a manutenção de condições
intracelulares adequadas para o funcionamento e vida da célula. A seletividade determina
quais as substancias devem entrar e sair da célula. A membrana deve permitir a entrada de
substancias responsável pelo crescimento, regeneração e atividades vitais da célula, além de
regular a saída de substancias através da secreção e da excreção. Enfim, a membrana
permite que a célula mantenha equilibrada o seu meio interno independentemente das
condições do meio extracelular. O meio interno deve ser adequado ao metabolismo normal de
cada tipo de célula.
A composição química e a organização molecular da membrana plasmática é que
embasam os estudos de permeabilidade. Esses constituintes estabelecem uma clara
diferenciação entre o líquido intracelular e o extracelular, no qual a célula está imersa.
A membrana plasmática, e de uma maneira geral todas as membranas celulares, são
constituídas por uma bicamada lipídica e por proteínas que apresentam uma organização
vetorial (Figura 7.1). Os lipídios das membranas são moléculas anfipáticas com as regiões
polares ou hidrófilas orientadas para as superfícies interna e externa, enquanto que as regiões
apolares ou hidrófobas se localizam no interior das membranas. As membranas apresentam
natureza fluída gozando as moléculas protéicas de mobilidade lateral, no plano da
membrana. As proteínas são os principais componentes funcionais das membranas celulares.
Como a seletividade das membranas é reflexo de sua estrutura e composição
química, moléculas apolares de pequeno porte tais como oxigênio (O2) e dióxido de carbono
(CO2) e moléculas não carregadas (água, etanol e glicerol) podem mover a favor de um
gradiente de concentração através da própria bicamada por simples difusão. Em contraste as
bicamadas lipídicas são altamente impermeáveis a todos os íons e moléculas carregadas,
independente de seu tamanho. Neste caso proteínas transportadoras são necessárias para
transferir tais substâncias através das membranas celulares. Por exemplo, se um soluto está
presente em maior concentração fora da célula do que em seu interior e uma proteína
transportadora está presente na membrana celular, o soluto mover-se-á espontaneamente,
através da membrana pela proteína transportadora para dentro da célula por transporte
passivo, sem gasto energético. Por outro lado, transporte de solutos contra o gradiente de
concentração demandam gasto de energia, este mecanismo é denominado transporte ativo.

43
Figura 7.1 – Representação esquemática da estrutura em mosaico fluido da membrana
celular.

A manutenção de determinadas substâncias dentro ou fora da célula, contra um

gradiente de concentração, só poderá ser mantida caso a membrana celular esteja íntegra.
Exposição a solventes orgânicos que dissolvem lipídeos alteram a permeabilidade da
membrana por desnaturarem a bicamada lipídica. Temperaturas elevadas também atuam
alterando a integridade e a seletividade da membrana, uma vez que o calor desnatura a
maioria das proteínas envolvidas no transporte de substâncias.
A membrana plasmática é geralmente mais permeável a água do que aos solutos
nela dissolvidos. Quando duas soluções de diferentes concentrações estão separadas pela
membrana, ocorre um deslocamento da água para o meio de maior concentração. Esta
passagem da água através da membrana é um tipo de transporte passivo denominado
osmose. Desta forma uma célula colocada em um meio hipotônico tende a intumescer devido
a absorção de água por osmose, enquanto que em meio hipertônico a célula tende a perder
volume devido ao movimento de saída de água. As células vegetais, por apresentarem a
parede celulósica que cria resistência contra a entrada excessiva de água, são impedidas de
intumescer até a lise celular. Em meio hipertônico, células vegetais perdem água e sofrem
retração do citosol em relação à parede celular, uma condição denominada plasmólise. A
plasmólise temporária não é destrutiva para a célula. Esta pode recuperar rapidamente sua
condição de turgidez normal, se a colocarmos em um meio isotônico em relação ao citosol de
uma célula normal. Tal mecanismo é denominado desplasmólise.

44
 Atividade 7

Objetivos
1. Descrever o efeito e o mecanismo de ação da acetona e da temperatura elevada
sobre a permeabilidade das membranas celulares.
2. Relacionar as alterações de formatos das células com a concentração do meio
extracelular e o fenômeno de osmose.
3. Observar e justificar a resistência de células vegetais em meios hipotônicos.

1 – Efeito do solvente orgânico sobre a permeabilidade das membranas celulares:

Procedimento: Identifique dois tubos de ensaio com os números 1 e 2. Coloque 4 mL
de água no tubo número 1 e 2 mL no tubo número 2. Acrescente 2 mL de acetona no
tubo número 2. Adicione a cada um dos tubos um cubo de beterraba cortada. Aguarde
cerca de uma hora e verifique o que ocorreu em cada um dos tubos.

Após a observação do resultado responda:

a) O que se pode concluir quando se compara os resultados dos tubos 1 e 2?

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_____________________________________________________________

b) Como a acetona atuou sobre as células?

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2 – Efeito do aquecimento sobre a permeabilidade das membranas celulares

Procedimento 1: Enumere três tubos de ensaio. Faça as adições descritas no quadro
seguinte, na seqüência indicada, agitando após cada adição.
Tubo Suspensão de levedo Vermelho congo Água
1 2 mL - 3 mL
2 2 mL 3 mL -
3 2 mL 3 mL -

- Em seguida coloque o tubo número 3 em banho Maria a 100oC por 10 minutos.

Procedimento 2: Coloque, com auxilio de uma pipeta, uma gota da suspensão de

levedo, do tubo 1, sobre uma lâmina e cubra o material com uma lamínula. Observe ao
microscópio tendo, o diafragma inicialmente fechado, mas regule sua abertura quando
utilizar diferentes objetivas.

45
- As células de levedo são esféricas ou ovaladas e podem apresentar brotamentos
(uma célula pequena unida a outra maior) característicos de seu processo de
reprodução. Atente para a coloração destas células.

Procedimento 3: Monte outra lâmina colocando, com auxilio de pipetas uma gota da
suspensão de levedo do tubo número 2 em uma das extremidades da lâmina, uma gota
da suspensão de levedo do tubo número 3 na outra extremidade. Ao utilizar as pipetas
cuidado para que não as misture. Cubra cada gota com uma lamínula. Observe ao
microscópio com a lente objetiva de 40X, regulando a abertura do diafragma. Após a
observação responda as questões a, b, c e d.

a) Como se apresentam as células no tubo 2, em relação ao corante?

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b) O que isto indica quanto à permeabilidade da membrana plasmática do levedo ao

vermelho Congo?
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c) Qual é a cor apresentada pelas células do levedo no tubo número 3?

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d) Houve penetração do corante? Por quê?

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3 – Osmose em células animais.

As células sanguíneas em suspensão correspondem, na sua maioria, em glóbulos
vermelhos (hemácias). Com a lente objetiva de 4X, o conjunto destas células mostra-
se com aspecto granular. A partir da lente objetiva de 10X e com a lente objetiva de
40X, percebe-se que as hemácias no caso de mamíferos, têm formato de disco
bicôncavo e são anucleadas.

Procedimento 1: Coloque sobre uma lâmina, com auxílio de uma pipeta de Pasteur,
uma gota de suspensão de sangue em solução isotônica (NaCl 0,9%) e cubra o material
com uma lamínula. Observe ao microscópio tendo o diafragma inicialmente fechado.
Ao utilizar a objetiva de 40X, regule a abertura do diafragma de modo a obter uma
imagem nítida. Observe a forma das hemácias.

Procedimento 2: Monte outra lâmina colocando, com auxilio de pipetas uma gota da
suspensão de sangue em solução hipertônica (NaCl 1,5%) em uma das extremidades da

46
lâmina e uma gota de sangue em solução hipotônica (NaCl 0,6%) na outra
extremidade. Ao utilizar as pipetas, cuidado para que não as misture. Cubra cada gota
com uma lamínula. Observe ao microscópio com a lente objetiva de 40X, regulando a
abertura do diafragma. Após a observação responda as questões a, b e c.

a) Desenhe as células conforme se apresentem em cada meio.

1) Isotônico 2) Hipotônico 3) Hipertônico

b) Qual a forma das hemácias na solução de NaCl a 0,9%?

________________________________________________________________
_____________________________________________________________

c) Quais foram as modificações observadas das hemácias quando colocadas nas

soluções de NaCl 1,5% e 0,6%? Como estas modificações podem ser explicadas?
________________________________________________________________
_____________________________________________________________

4 – Osmose em células vegetais

A epiderme da folha de Tradescantia apresenta células prismáticas aclorofiladas, sendo

que muitas delas apresentam coloração rosada de aspecto homogêneo. Esta coloração
deve-se ao pigmento antocianina, presente no vacúolo destas células, cujo citoplasma é
restrito a uma faixa justaposta a parede celular. Desta forma o conjunto apresenta-se
com uma coloração uniforme, não sendo possível distinguir o citoplasma do vacúolo.
As únicas células epidérmicas clorofiladas (apresentando tonalidade esverdeada) são as
células-guarda estomáticas, em forma de cunha e aos pares. Os cloroplastos
observados sob as células epidêmicas comuns são provenientes das células do
parênquima clorofiliano, as quais se romperam no processo de retirada da epiderme.

47
Procedimento 1: Monte uma lâmina colocando uma gota de água em uma extremidade
e uma gota de solução salina (NaCl 2%) na outra extremidade. Retire com auxílio de
uma pinça alguns fragmentos da epiderme inferior de uma folha de Tradescantia.
Coloque os fragmentos retirados em cada uma das gotas sobre a lâmina e cubra o
material com a lamínula. Observe ao microscópio, utilizando a lente objetiva de 10X.
Inicie a observação com o material montado em água.

Procedimento 2: Substitua a solução salina por água destilada, procedendo da seguinte

maneira: coloque uma gota de água destilada em uma das extremidades da lamínula,
encoste um pedaço de papel de filtro na outra extremidade, de forma a absorver a
solução existente entre a lâmina e a lamínula. Observe ao microscópio, utilizando a
lente objetiva de 10X e responda as questões de a até f.

a) Qual foi a modificação observada na forma das células, quando montadas em

solução salina 2%?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

b) Que nome se da a este fenômeno em células vegetais?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

c) O que ocorreu com as células após a substituição da solução salina por água
destilada? Explique.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) Que nome se da esta modificação?

________________________________________________________________

e) Porque as células observadas não de rompem com a exposição excessiva a água?

________________________________________________________________
________________________________________________________________

f) O que você esperaria que ocorresse com células animais, como as hemácias, caso
fossem colocadas em água destiladas?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

48
 8 – Movimentos Celulares
Princípios e exemplos de movimentos celulares

As células não são estáticas, e pelo contrário, elas possuem movimentos que
permitem a locomoção, a contração muscular, a circulação do meio extracelular, a
movimentação das estruturas intracelulares e as atividades de endocitose e/ou de exocitose.
As alterações no conjunto de microtúbulos e/ou de filamentos de actina presentes no
citoplasma, que constituem o citoesqueleto, é que possibilitam os diversos tipos de
movimentos. Além de atuar na mobilidade da célula, o citoesqueleto está diretamente
relacionado às alterações coloidais citoplasmáticas, à sustentação de proteínas solúveis e
ribossomos e à manutenção do formato celular.
Os filamentos de actina ou microfilamentos são compostos pela proteína actina. Eles
apresentam espessura de aproximadamente 5 a 9 nm e formam uma gama bastante ampla
de estruturas diferentes, estando distribuídos por todo o citoplasma e aparecendo, algumas
vezes, também no núcleo. Entretanto, há uma concentração maior dos filamentos de actina
abaixo da membrana plasmática. Eles são responsáveis por diversos tipos de movimentos
celulares, como, por exemplo, a contração muscular, quando associados a proteínas motoras
de miosina.
O músculo estriado esquelético é formado por células alongadas, com numerosos
núcleos ovalados, dispostos na periferia, ao longo da célula. Cada célula multinucleada, ou
fibra muscular, apresentam muitas fibrilas, ao longo das quais as unidades contráteis
(sarcômeros) se repetem linearmente. A seqüência de sarcômeros é formada por grupos de
filamentos de actina associados à miosina, conforme pode ser visto na figura seguinte (Figura
8.1).
As regiões de acúmulo de actina formam faixas claras (bandas-I), enquanto que nas
faixas escuras há superposição parcial de filamentos de actina e da miosina (bandas-A). Em
uma banda-A, a região central, ocupada apenas por miosina, forma a banda-H. No centro da
banda-H observa-se uma faixa mais densa (linha-M), resultante da interconexão da miosina.
A interconexão entre os filamentos de actina forma a linha-Z, que dividi a banda-I ao meio e
representa o limite de cada sarcômero (Figura 8.1).
Ao microscópio de luz o alinhamento dos sarcômeros resulta numa alternância de
faixas claras e escuras, formando estriações transversais. O movimento de contração
muscular ocorre devido ao deslizamento dos filamentos de actina sobre os de miosina,
resultando na diminuição do comprimento de cada sarcômero e na contração da fibra como
um todo.
Os movimentos citoplasmáticos, como a ciclose em células vegetais e o movimento
amebóide em, por exemplo, amebas e leucócitos são também realizados pelos filamentos de
actina e de miosina. Nesses casos, eles não estariam organizados em sarcômeros, mas
dispostos em outros arranjos no citoplasma. No movimento amebóide estão envolvidas três
etapas principais: polimerização dos filamentos de actina empurrando a membrana

49
plasmática para frente, formando pseudópodes, a adesão dos pseudópodes ao substrato por
proteínas transmembrana e, por último, a retração do citoplasma, pela interação da actina
com a miosina, deslocando-se como um todo. O movimento amebóide tem como
conseqüência o deslocamento da célula e também possibilita a fagocitose.

Figura 8.1 – Esquema de um sarcômero

Para facilitar a difusão de solutos entre diferentes pontos do citoplasma, células

animais e vegetais possuem correntes citoplasmáticas, organizadas pelos componentes do
citoesqueleto. Como o citoplasma das células vegetais constitui normalmente apenas uma
estreita lâmina entre o grande vacúolo central e a membrana plasmática, o seu movimento,
acompanhado das organelas, é bastante ordenado, por isso recebendo a denominação de
ciclose. Esta pode ser facilmente observada em citoplasmas de Elodea, onde os cloroplastos
circulam nas estreitas faixas de citoplasma que contornam o vacúolo central.
Os microtúbulos são estruturas cilíndricas e bastante longas, com cerca de 25 nm de
diâmetro. Eles são relativamente flexíveis. Sua distribuição na célula é variável, em função da
situação fisiológica, mas geralmente irradiam de um dos centros de organização dos
microtúbulos, como o centrossomo. Suas cujas paredes são compostas por dímeros da
proteína tubulina. Eles são os principais componentes do aparelho mitótico, dos centríolos, dos
cílios e dos flagelos.
Cílios e flagelos são projeções da membrana plasmática, responsáveis pela
movimentação. Nas células do epitélio da traquéia, os cílios têm função de circular o meio
adjacente a elas, formando uma corrente contínua e unidirecional do muco e partículas
aderidas. Em alguns protistas, como a Vorticella, o Stentor e o Paramecium, os cílios ajudam
na condução de partículas alimentares para o cistóstoma, uma região especializada da
membrana, responsável pela ingestão de alimentos. Ainda no Paramecium, o batimento
coordenado dos cílios permite o movimento da célula, tão importante para a exploração do
meio a procura de alimento, como para fuga de possíveis predadores. Enquanto os cílios são
numerosos e curtos, os flagelos são longos e ocorrem em pequeno número por célula.
A estrutura fundamental responsável pelos movimentos dos cílios e flagelos é o
axonema. Este é formado por um feixe de microtúbulos, com suas extremidades positivas
voltadas para a extremidade distal, e proteínas associadas. Na grande maioria dos cílios e

50
flagelos de eucariotos, os microtúbulos são arranjados em um padrão característico de “9 +
2”, no qual um par central de microtúbulos simples é circundado por nove duplas periféricas
de microtúbulos. Os cílios e flagelos originam-se a partir de corpúsculos basais, constituídos
por microtúbulos dispostos em um arranjo idêntico ao dos centríolos (9 trincas periféricas,
sem microtúbulos centrais).
Enquanto os microtúbulos e os filamentos de actina ocorrem em todas as células
eucarióticas, no citoesqueleto de metazoários ocorre um terceiro tipo de filamentos, os
filamentos intermediários. Mesmo nestes organismos, há tipos celulares que também não
possuem filamentos intermediários. Estes filamentos são compactos, com espessura por volta
de 10 nm e formados por uma variedade de proteínas fibrosas como, por exemplo, a
queratina. Entretanto, os filamentos intermediários, aparentemente, não participam de
movimentos celulares, eles são particularmente abundantes no citoplasma de células que
estão sujeitas ao estresse mecânico e sua principal função parece ser conferir resistência às
células e tecidos.

51
 Atividade 8

Objetivos
1. Identificar as estruturas responsáveis pelo movimento de diferentes tipos celulares
na microscopia de luz
2. Relacionar as estruturas responsáveis pelos movimentos com as funções que
desempenham em diferentes tipos celulares.

1 – Observação de fibras musculares estriadas em língua de rato (cortes corados pelo

tricômio de Mallory).
Procedimento: Com a lente objetiva de 10x, escolha um campo mais ao centro do
corte, onde existam células musculares cortadas longitudinalmente e, portanto, com
forma alongada. Observe algumas dessas células com a lente objetiva de 40x e
responda a próxima questão.

Esquematize uma região de uma célula muscular, identificando os núcleos e as bandas

A e I.

2 – Observação de cílios em células fixas de traquéia e esôfago de rato (corte

transversal corado pela hematoxilina férrica e eosina).
Procedimento: Com a lente objetiva de 10x, tente distinguir no corte a traquéia e o
esôfago. Focalize o epitélio voltado para a luz da traquéia, escolha uma região bem
preservada e observe-a com a lente objetiva de 40x.

a) Qual é a função dos cílios nessas células?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

52
3 – Observação do movimento de flagelo em células de espermatozóides de mamífero.
Procedimento: Coloque sobre a lâmina uma gota de sêmen e cubra com lamínula.
Comece a focalizar com a lente objetiva de 10x, vá até a de 40x e responda a próxima
questão. Esquematize um espermatozóide, indicando a cabeça e a cauda (flagelo)

4 – Observação de movimento de protistas.

Procedimento: Coloque sobre uma lâmina, uma gota de água coletada previamente
(pode ser coletada em bromélias, aquários, etc). Observe ao microscópio, inicialmente
com a objetiva de menor aumento e o diafragma fechado. Observando o material com
a lente objetiva de 40x, esquematize o protozoário encontrado.

Após observação responda:

a) Qual é a estrutura responsável pelo movimento do Paramecium?

________________________________________________________________
________________________________________________________________

53
b) Qual é a importância da mobilidade para os organismos unicelulares?
________________________________________________________________
________________________________________________________________

c) Cite as semelhanças e diferenças entre cílios e flagelos.

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

5 – Observação de movimentos citoplasmáticos em Elodea.

Procedimento: Coloque uma gota de água sobre uma lâmina, retire com uma pinça, um
pedaço da planta Elodea e deposite-o sobre a gota. Cubra o material com uma lamínula
e observe-o ao microscópio. Inicie pela objetiva de 10x e passe para a de 40x.
Controle a abertura e fechamento do diafragma e movimente o parafuso
micrométrico, de modo a visualizar nitidamente, o conteúdo celular. Observe o
movimento dos cloroplastos, ao longo das faixas estreitas de citoplasma ao redor do
vacúolo. Após observação, faça as questões a e b.

a) utilizando a lente objetiva de 40x, esquematize uma célula de Elodea indicando o

núcleo, o citoplasma e os leucoplastos.

b) Qual é a importância das correntes citoplasmáticas, incluindo a ciclose, para as

células?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

54
 9 – Núcleo
Principais aspectos estruturais do núcleo

Em uma célula eucariota o núcleo corresponde a uma região delimitada por um

sistema de duas membranas apresentando em seu interior DNA, RNA e proteínas. Na
seqüência de bases nitrogenadas do DNA está a informação necessária para o controle
metabólico e a diferenciação celular.

Estrutura e composição química nuclear

O núcleo é composto de um envoltório que separa seu conteúdo (cromatina, nucléolo

e nucleoplasma) do restante do citoplasma. Ao microscópio eletrônico o envoltório nuclear se
aprese ta constituído por duas membranas concêntricas. A membrana externa apresenta
ribossomos aderidos a face citoplasmática enquanto a membrana interna encontra-se
associada à cromatina em sua face nuclear. Este envoltório não é contínuo, apresentando
poros que possibilitam a passagem de macromoléculas como RNAs sintetizados no interior do
núcleo e carreados para atuar no citoplasma.
No núcleo interfásico, a cromatina é constituída de DNA associado a proteínas
básicas denominadas histonas, podendo esta ser encontrada nas formas condensada e
descondensada. A eucromatina se apresenta descondensada na maioria das células, podendo
aparecer condensada em certos tipos celulares ou fase do ciclo celular. A cromatina sexual ou
“corpúsculo de Barr”, encontrada em certas células de fêmeas de mamíferos, é um exemplo
de eucromatina condensada. Neste caso uma das cópias do cromossomo X torna-se
altamente condensado e inativado. A heterocromatina por sua vez, apresenta-se condensada
em todas as células do organismo, independente da fase do ciclo celular.
Existem evidências entre o grau de condensação da cromatina e sua atividade gênica.
Células com intensa atividade de síntese protéica apresentam a cromatina descondensada
devido a atividade de transcrição, que resulta na formação de diferentes tipos de RNAs.
Situação oposta é observada em células com baixa atividade de síntese protéica. Isto pode ser
observado em microscopia de luz pela intensidade de coloração do núcleo.
Os nucléolos são regiões de intensa basofilia ocasionada pelo grande acúmulo de
RNAr nesta região da cromatina. O tamanho e quantidade de nucléolos variam de acordo
com o tipo celular e com o estado funcional da célula. Geralmente os nucléolos são mais
evidentes e/ou numerosos em células com alta atividade de síntese protéica.
A substância de que preenche os espaços no interior do núcleo é denominada
nucleoplasma, constituído de água, proteínas, íons e metabólitos. Acredita-se que no
nucleoplasma exista uma rede de filamentos similar ao citoesqueleto que ajudaria na
organização e manutenção da forma do núcleo.

55
 Número tamanho, forma e posição dos núcleos

Em geral o número tamanho, forma e posição dos núcleos variam entre os tipos
celulares, estando relacionados à atividade metabólica da célula. Células que apresentem
intensa atividade de síntese protéica e/ou grandes volumes podem possuir mais de um ou
núcleos maiores. A diferença de tamanho do núcleo pode ser devido à duplicação ou
descondensação da cromatina durante o ciclo celular.
Algumas células altamente especializadas, como as hemácias de mamíferos são
anucleadas quando em seu estágio final de maturação. Por este motivo estas células são
incapazes de se reproduzir, o que determina sua curta vida média (em torno de 120 dias).
Nos diferentes tipos celulares normalmente o núcleo ocupa posição central no
citoplasma, entretanto em certos casos ele pode ser deslocado do centro, em decorrência do
acumulo de materiais no citoplasma ou ao grande tamanho de certas organelas como o
vacúolo em células vegetais.
Normalmente a forma do núcleo acompanha a forma da célula, esférico em células
cúbicas e alongado em células cilíndricas. Em leucócitos observamos núcleos multiformes e
irregulares. Por exemplo, os neutrófilos apresentam núcleos polimórficos com dois a cinco
lóbulos ligados por finas pontes cromatídicas. Em monócitos os núcleos variam de ovóide a
reniforme de acordo com o estágio de maturação da célula.

56
 Atividade 9

Objetivos
1. Observar ao microscópio de luz, a forma, o tamanho, a posição e o número de
núcleos em diferentes tipos celulares.
2. Observar ao microscópio de luz, nucléolos em diferentes tipos celulares.
3. Relacionar o grau de condensação da cromatina com a atividade metabólica das
células observadas.
4. Observar a estrutura do núcleo e do nucléolo em eletromicrografias.

1 - Observe ao microscópio os diferentes tipos celulares e faça desenhos e esquemas

evidenciando citoplasma núcleo e nucléolo.

A) Sangue Humano (hemácias e leucócitos);

Procedimento: Focalize a lâmina com a lente objetiva de 10X e escolha um campo
onde as células sanguíneas estejam bem separadas. Esquematize uma hemácia
(eritrócito) e os diferentes leucócitos.
Tipos de leucócitos:
 Monócitos e linfócitos – a forma do núcleo varia de arredondado a reiniforme.
 Neutrófilos, eosinófilos e basófilos – apresentam núcleos segmentados (lobulados).

Características: Características: Características:

Características: Características: Características:

57
B) Fígado de Rato (hepatócitos)
Esquematize um hepatócito em um aumento final de 400X.

Após observar as lâminas e fazer os esquemas, responda as questões seguintes:

a) Tomando como referência as células observadas, é correta a afirmação de que o

formato dos núcleos acompanha sempre o formato das células? Justifique.
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

b) Em que implica para os hepatócitos, a presença de núcleos volumosos ou de dois

núcleos por célula?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

c) Que relação existe entre o grau de condensação da cromatina e a atividade

metabólica das células?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) Enumerar os nucléolos que ocorrem no interior dos núcleos observados. Porque as

células com intensa atividade de síntese protéica geralmente apresentam nucléolos
evidentes?
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

58
 10 – Ciclo Celular - Mitose
Movimentos dos cromossomos durante a mitose

O núcleo organizado é observado no citoplasma de células eucariotas durante um

período do ciclo celular denominado interfase. No decorrer deste a célula pode apresentar
intensa atividade metabólica e ter seu DNA replicado. A replicação é um pré-requisito para a
mitose. A mitose garante a manutenção da bagagem genética ao longo do processo
proliferativo celular. Nas células eucariotas diplóides (2x), a mitose é um processo divisional,
por meio do qual os cromossomos da célula mãe são igualmente distribuídos entre as células
filhas.

Mitose

O crescimento e desenvolvimento dos organismos vivos dependem do crescimento e

da divisão de suas células. Em seres unicelulares a divisão celular representa a própria
reprodução. Ao contrário nos organismos pluricelulares que provêm de um zigoto, repetidas
divisões a partir da célula inicial levam ao desenvolvimento e crescimento do indivíduo.
A gênese de novas células faz parte de um processo cíclico denominado ciclo celular,
o qual compreende dois períodos; Interfase e Divisão.
Na Interfase, período entre o final de uma divisão e o início da seguinte, o material
genético nuclear encontra-se disperso e ativo, constituindo a cromatina. Este período pode se
dividido em três fases, G1, S e G2. A fase G1 caracteriza-se por uma intensa síntese de RNA
e de proteínas. Nesta fase ocorre o crescimento geral e reconstituição do citoplasma das
células filhas recém originadas. Na fase S, que se segue, ocorre a duplicação no conteúdo de
DNA, paralelamente à síntese das histonas, com as quais o DNA se complexa. Os eventos
ocorridos em G2 não estão bem esclarecidos, entretanto sabe-se que nesta etapa ocorre
síntese de proteínas indispensáveis para o início da mitose.
A Divisão, período entre o final de uma mitose e o início da seguinte, compreende a
fase M, composta por dois processos, Mitose (divisão nuclear) e Citocinese (divisão
citoplasmática).
Uma série de eventos permite, para fins de estudo, identificar e caracterizar uma
seqüência de cinco fases no processo mitótico, apesar de não existirem limites precisos entre
elas. Estas fases são denominadas prófase, metáfase, anáfase e telófase e encontram-se
descritas a seguir:
Prófase: os cromossomos duplicados se condensam progressivamente, o nucléolo se
desorganiza enquanto o fuso mitótico é progressivamente organizado.
Prometáfase: término da desorganização do nucléolo. O envelope nuclear se rompe
e os microtúbulos do fuso se ligam aos centrômeros cromossômicos.
Metáfase: caracteriza-se pela reunião dos cromossomos no plano equatorial da
célula.

59
 Anáfase: ocorre rompimento de centrômeros e separação de cromossomos em dois
conjuntos idênticos, e a posterior migração destes para os pólos opostos da célula.
Telófase: inicia quando cada um dos conjuntos cromossômicos chega aos pólos do
fuso. Esta fase caracteriza-se pela reconstituição dos dois núcleos filhos, que assumem aos
poucos um aspecto interfásico.
Concomitante às duas últimas etapas inicias-se a citocinese, divisão do citoplasma.
Esta fase difere de maneira acentuada entre células animais e vegetais. Nas células animais a
separação das células filhas ocorre por um mecanismo contrátil, no qual participam
microfilamentos de actina e miosina. Nas células vegetais a citocinese começa com o
aparecimento do fragmoplasto, que é formado por componentes do fuso de divisão e por
vesículas oriundas do complexo de Golgi. A fusão destas vesículas determina a formação da
placa celular, que separa as células filhas, com a liberação de seu conteúdo para a formação
da matriz péctica.

Cromossomos mitóticos metafásicos

Do início da mitose, os cromossomos se condensam e se tornam visíveis

individualmente. Como resultado da replicação ocorrida durante a fase S do ciclo celular, os
cromossomos apresentam-se constituídos por duas moléculas dupla fita de DNA, associadas
uma a outra, denominadas cromátides irmãs.
Os cromossomos apresentam um estrangulamento, constrição primária ou região
centromérica, cuja posição possibilita sua identificação. Um cromossomo é dito metacêntrico
quando tem centrômero mediano que o divide em dois braços iguais. É submetacêntrico
quando tem centrômero submediano, que o divide em dois braços desiguais e acrocêntrico
quando tem centrômero subterminal. O cromossomo telocêntrico tem o centrômero na
posição terminal, confundindo-se com sua extremidade.
A fase mais adequada para o estudo dos cromossomos é a metáfase, quando estes
atingem o máximo de sua condensação e podem portanto serem vistos de forma
individualizada.
Cada uma das espécies animais e vegetais apresenta número cromossômico que lhe é
constante. Denomina-se cariótipo ao conjunto de características (número, tamanho,
morfologia) dos cromossomos de uma espécie. O estudo do cariótipo dentre outras aplicações
é importante em estudos evolutivos, identificação de espécies, entre outros modelos de
análises.
Na obtenção de cromossomos metafásicos, para análise de cariótipos, são utilizados
agentes físicos e químicos que atuam como inibidores da divisão celular. Entre eles a
colchicina é um dos mais utilizados, trata-se de um alcalóide extraído da planta asiática do
gênero Colchicum. Quando adicionada às células em divisão, a colchicina impede a formação
do fuso, impossibilitando a separação e a migração das cromátide e interrompendo, portanto,
o processo de divisão.

60
 Atividade 10

Objetivos:
1. Caracterizar as fases da mitose em raiz de cebola;
2. Identificar os diferentes tipos de cromossomos metafásicos;

1 – Mitose em raiz de cebola através da técnica de esmagamento.

Material: A duração do ciclo celular em células de meristema de ponta de raiz de
cebola (Aliun cepa) à temperatura de 20ºC é a seguinte: intérfase – 16 horas
aproximadamente; mitose 2 horas aproximadamente (prófase – 60 min; metáfase – 18
min; anáfase – 12 min; telófase – 42 min). Células somáticas de cebola apresentam 2n =
16 cromossomos.
Procedimento: Transferir as pontas de raiz de cebola para uma solução de HCl 5N a
60 graus, durante 20 min. lavar com água destilada por 10 min. Coras as raízes com
orceína acética 2% durante 15 a 20 minutos. Cortar o meristema apical da raiz e
transferi-lo para uma pequena gota de acido acético 45% depositada em uma lâmina
bem limpa. Cobrir o material com uma lamínula e colocar a preparação entre papel de
filtro. Bater levemente com a extremidade de uma caneta ou lápis. Retirar o papel de
filtro e observar na objetiva de 40x.

a) Observe ao microscópio as diferentes etapas da divisão mitótica e faça desenhos e

esquemas evidenciando a organização dos cromossomos no citoplasma.

Prófase: Metáfase: Anáfase:

Telófase: Citocinese: Intérfase

61
b) Em que fase do ciclo celular ocorre a replicação do DNA?
________________________________________________________________

c) Como na prática é possível diferenciar a interfase da prófase?

________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) Como na prática é possível diferenciar a metáfase da anáfase?

________________________________________________________________
________________________________________________________________

e) Por que se diz que a mitose é um processo conservativo, sob o ponto de vista
genético?
________________________________________________________________
________________________________________________________________

Considerando que uma célula diplóide em G1 apresenta número cromossômico = 2x,

conteúdo de DNA = 2C e 1 cromátide por cromossomo, de o número de cromátides
por cromossomo, o conteúdo de DNA e o número de cromossomos das células nas
seguintes fases do ciclo celular:

NO de cromátides por Conteúdo de DNA NO de cromossomos

ETAPAS
cromossomo (C, 2C, OU 4C) (X, 2X)
G1
G2
Prófase
Metáfase
Anáfase
Telófase

f) O que é o centrômero?
________________________________________________________________
________________________________________________________________

g) Classifique os cromossomos de acordo com a posição do centrômero.

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

h) O que é cariótipo?
________________________________________________________________
________________________________________________________________

62
i) Qual é a importância do estudo do cariótipo?
________________________________________________________________
_______________________________________________________________

j) Porque a melhor fase para o estudo do cariótipo é a metáfase.

________________________________________________________________
________________________________________________________________

h) Porque se utiliza a colchicina no estudo do cariótipo?

________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________

63
 11 – Meiose
Movimentos dos cromossomos durante a meiose

A meiose é um tipo especial de divisão celular, exclusiva dos indivíduos que se

reproduzem de forma sexuada. Em organismos que se reproduzem assexuadamente a
divisão celular é simples ou ocorre mitose. Em animais e vegetais, a reprodução é realizada
por meio de gametas ou células sexuais geradas por meiose. Esses gametas se unem por um
processo denominado fecundação. A meiose permite que o número diplóide (2n) de
cromossomos, característico de uma espécie, seja reduzido a um número haplóide (n) por
meio de duas divisões sucessivas com uma única fase de replicação do DNA. A produção de
células reprodutivas haplóides é essencial para restabelecer o número de cromossomos de
uma espécie.
A meiose é tratada como um tipo especial de divisão por que: o número de
cromossomos é reduzido à metade; há recombinação genética, ou seja, o intercâmbio de
segmentos cromossômicos e os cromossomos homólogos paternos e maternos segregam-se
aleatoriamente.
À semelhança da mitose, a meiose é um processo contínuo, dividido em uma série de
etapas apenas com propósito didático. Estas etapas apresentam características próprias que
permitem seu reconhecimento e diferenciação.
A meiose compreende duas divisões celulares. A meiose I se distingue da meiose II (e
da mitose) porque sua prófase é muito longa e em seu transcurso os cromossomos homólogos
se pareiam e se recombinam para intercambiar material genético.

As fases da Meiose

A Primeira divisão meiótica:

Prófase I – Começa quando a cromatina interfásica inicia a condensação. Durante a

prófase o envoltório nuclear se mantém íntegro, os cromossomos se condensam
gradualmente, o nucléolo vai desorganizando e o fuso de divisão organiza-se no citoplasma. A
prófase I, é uma fase longa e complexa e, por isso, foi subdividida em leptóteno, zigóteno,
paquíteno, diplóteno e diacinese:
A) Leptóteno – os cromossomos, já duplicados, aparecem como filamentos longos,
finos e individualizados, apresentando regiões mais compactadas intercaladas com
outras ainda pouco condensadas, dando um aspecto granular ao filamento. Esses
grânulos são denominados cromômeros.
B) Zigóteno – os cromossomos homólogos emparelham-se longitudinalmente, ponto
a ponto, ao longo de todo o seu comprimento (sinapse) e, entre eles, aparece
uma estrutura protéica denominada complexo sinaptonêmico (CS). Este
pareamento é importante, pois vai permitir a ocorrência do crossing-over, na fase

64
 seguinte, além de resultar na segregação dos homólogos, na anáfase. Ao
microscópio de luz não é possível ver as quatro cromátides dos homólogos
emparelhadas, uma vez que estão intimamente associadas e pouco condensadas.
C) Paquíteno – os cromossomos encontram-se mais condensados e totalmente
emparelhados e o evento mais importante dessa fase é a permuta ou crossing-
over, no qual cromátides homólogas trocam pedaços equivalentes, resultando em
uma nova combinação de genes dos pais.
D) Diplóteno – a separação dos cromossomos homólogos, iniciada no final do
paquíteno, continua neste estágio, quando podem ser observados os quiasmas,
ponto nos quais cromátides de cromossomos homólogos se entrelaçam. Os
quiasmas correspondem à evidência citológica do crossing-over ocorrido na fase
anterior.
E) Diacinese – os cromossomos homólogos, ainda unidos, continuam se condensando
e os quiasmas deslocam-se para as extremidades dos cromossomos, podendo
diminuir em número.

Prometáfase I – término da desorganização do nucléolo. O envoltório nuclear se

desorganiza e os microtúbulos do fuso se ligam aos cromossomos conduzindo-os em direção à
região equatorial do fuso.
Metáfase I – é a fase em que os cromossomos atingem o seu grau máximo de
condensação e ainda permanecem unidos em suas extremidades pelos quiasmas. Eles se
posicionam no plano equatorial da célula. Cada cromossomo homólogo encontra-se orientado,
por meio do fuso de divisão, para um dos pólos. As duas cromátides de cada cromossomo
comportam-se como uma unidade funcional.
Anáfase I – ocorre a separação dos cromossomos homólogos (cada um com duas
cromátides), que migram para pólos opostos, reduzindo à metade o número de cromossomos
em cada célula formada. Os cromossomos homólogos se separam pelo tracionamento do fuso
meiótico para pólos opostos da célula. Esta segregação ocorre independente da sua origem
paterna ou materna (segregação independente dos cromossomos homólogos).
Telófase I – os cromossomos descondensam, o envoltório nuclear é reconstituído e
ocorre a citocinese. Essas duas células formadas ao final da meiose I são haplóides (n),
embora ainda tenham a quantidade de DNA duplicada (2C), já que cada cromossomo do par
é constituído de duas cromátides (a duplicação ocorreu na fase S da interfase, tornando a
célula 4C).
Intercinese – É um período, em geral curto ou inexistente, entre as duas divisões da
meiose. Neste período não ocorre duplicação do material genético.

Portanto, ao final da primeira divisão, as células filhas possuem metade do número de

cromossomos da célula parental o que caracteriza uma divisão reducional.

65
 Segunda divisão meiótica

Prófase II – Caracteriza-se pela condensação progressiva dos cromossomos,

desorganização do envoltório nuclear e do nucléolo e organização de dois novos fusos.
Prometáfase II – Ocorre o término da desorganização do nucléolo e a
desorganização do envoltório nuclear.
Metáfase II – Os cromossomos, com suas duas cromátides-irmãs ligadas pelo
cinetócoro às fibras de fusos opostos, alinham-se no plano equatorial da célula.
Anáfase II – Caracteriza-se pela separação das cromátides-irmãs e tração dos
cromossomos filhos para os pólos opostos da célula.
Telófase II – os cromossomos descondensam-se, organizam-se novos núcleos e o
nucléolo reaparece. Uma nova citocinese dará origem a quatro células haplóides (n), que
ficarão também com a metade da quantidade de DNA (C) de uma célula diplóide.

66
 Atividade 11

Objetivos:
1. Preparar lâminas a partir de anteras de Lírio (Lilium sp.) e identificar as diferentes
fases da meiose em células mãe do grão de pólen
2. Relacionar o processo meiótico com a reprodução sexuada.

1 – Meiose em anteras de lírio (Lilium sp.).

Material: O Lírio apresenta 2n= 24 cromossomos. A meiose masculina ocorre nas
células-mãe do grão de pólen das anteras imaturas presentes nas flores, sendo este
processo denominado de microsporogênese. Nas anteras de uma determinada flor de
Lírio, a meiose é sincronizada e, por isso, para se observar as diferentes fases da
divisão são necessárias selecionar anteras em diferentes estádios de desenvolvimento.
Observe, também, o nucléolo, o qual está presente e bastante desenvolvido até o final
da prófase da primeira divisão meiótica.
Obtenção do material: O material deverá ser colhido na fase de botão novo e fixado
em Carnoy por 12 a 24 horas, seguido de duas trocas de álcool 70%. Após a última
troca, guardar no congelador ou no freezer.
Procedimento: Para se obter as diferentes fases da meiose: a) Retirar o material da
geladeira, deixando que alcance a temperatura ambiente; b) Separar botões florais em
diferentes estádios para se obter células em diferentes fases da meiose e, com o auxílio
de uma lupa e estiletes, retirar suas anteras. Este procedimento deverá ser feito com o
material mergulhado em álcool 70%; c) Transferir as anteras para uma lâmina limpa.
Colocar sobre as anteras 1 ou 2 gotas de carmin acético; d) Cortar as anteras e
esmagá-las levemente com um estilete para que as células se soltem; e) Cobrir com
uma lamínula, retirar o excesso de corante com papel filtro e aquecê-la levemente;
f) Esmagar fazendo pressão com o polegar; g) Vedar a lamínula com o esmalte incolor,
esperar que este seque; h) Observar ao microscópio.

a) Examinar as diversas fases da meiose, procurando caracterizar cada uma delas.

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67
b) Desenhar as diferentes fases da meiose, destacando as alterações celulares mais
relevantes.

c) Enumerar 5 diferenças existentes entre a mitose e a meiose.

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________________________________________________________________
________________________________________________________________

d) Por que a primeira divisão meiótica é chamada reducional e a segunda divisão

equacional?
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________________________________________________________________
________________________________________________________________

e) Por que a meiose é um pré-requisito para a reprodução sexuada?

________________________________________________________________
________________________________________________________________

f) Analise as frases abaixo e identifique as que se referem à mitose ou à meiose:

1. Ocorre exclusivamente em células germinativas ________________________
2. Ocorre em células somáticas ______________________________________
3. Pareamento dos cromossomos homólogos ____________________________
4. Troca de material genético _________________________________________
5. Segregação de cromossomos homólogos _____________________________
6. Células filhas resultantes com n cromossomos __________________________
7. Células filhas resultantes com 2n cromossomos __________________________

68
g) Considerando uma célula diplóide em G1 apresenta número de cromossomos 2n =
2x, conteúdo de DNA = 2C e 1 cromátide por cromossomo, dê o número de
cromátides por cromossomo, o conteúdo de DNA e o número de cromossomos por
célula em G1, G2 e nas diferentes fases da meiose.

Nº de cromátides por Conteúdo de DNA Nº de cromossomos

Etapas
cromossomo (C, 2C ou 4C) (x ou 2x)
G1
G2
Prófase I
Metáfase I
Anáfase I
Telófase I
Prófase II
Metáfase II
Anáfase II
Telófase II

69
 12 – Microscopia Eletrônica
Princípios e Funcionamento do Microscópio Eletrônico

A Microscopia Eletrônica diferencia da Microscopia de Luz, dentre outras

características, na fonte que alimenta o sistema óptico para a geração da imagem. Enquanto
na microscopia de luz a fonte de iluminação são lâmpadas incandescentes, na microscopia
eletrônica a imagem gerada é decorrente de uma fonte de elétrons. Como sabemos que o
limite de resolução de um microscópio está intimamente relacionado ao comprimento de onda
da fonte de iluminação, o microscópio eletrônico proporciona menor limite de resolução e
maior poder de resolução do que o microscópio de luz.
Como foi visto até o momento o microscópio de luz nos permite observar estruturas
de no mínimo 200nm. No entanto as células possuem estruturas abaixo deste limite que só
puderam ser observadas a partir da década de 40 com o advento do primeiro microscópio
eletrônico. A introdução da microscopia eletrônica, portanto, trouxe contribuição marcante
para a Biologia Celular revelando a ultra-estrutura celular em toda sua exuberância,
mostrando não só detalhes das organelas até então conhecidas (membrana plasmática,
núcleo, nucléolo, cromossomos, cloroplastos, mitocôndrias, entre outras), como também
permitindo a descoberta de outros componentes celulares como retículo endoplasmático,
ribossomos, filamentos do citoesqueleto, lisossomos, junções celulares, glicocálix, etc. Nesta
aula iremos estudar os princípios gerais das duas principais formas de Microscopia Eletrônica
existente, Microscopia Eletrônica de Transmissão e de Varredura, bem como as principais
diferenças existentes entre as Microscopias de Luz e Eletrônica, o procedimento básico para
preparação de espécimes para Microscópio Eletrônico e a diferenciação de estruturas
celulares em micrografias eletrônicas.

Microscopia Eletrônica de Transmissão

O Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) foi o primeiro microscópio eletrônico

a ser construído, na década de 30, sob liderança do pesquisador Ruska. As considerações e
princípios da Microscopia de Luz (ML) são perfeitamente aplicáveis à MET salvo as
diferenças existentes entre eles.
O desenvolvimento do MET foi possível a partir de demonstrações do comportamento
de fótons num sistema a vácuo seguido da possibilidade de condução de elétrons através do
uso de lentes eletromagnéticas. Logo, o funcionamento do MET está relacionado à natureza
dos feixes de elétrons utilizados na formação da imagem. A fonte geradora de feixes de
elétrons fica localizada na parte superior do aparelho de forma que o aspecto global do MET
é semelhante ao do ML, invertido e em proporções maiores (figura 12.1).

70
 Figura 12.1 – Representação da estrutura de um MET.

O feixe de elétrons é emitido por um filamento, ou por um emissor que age como
cátodo, situado no topo de uma coluna cilíndrica com cerca de 2m de altura. Quando
submetida à alta voltagem, a fonte de elétrons é aquecida emitindo os elétrons que são
acelerados por meio de diferença de potencial elétrico. Dentro da coluna é criado um sistema
de alto vácuo evitando a colisão entre elétrons e as moléculas de ar e, consequentemente, a
dispersão dos elétrons. Além disso, um sistema de lentes eletromagnéticas está disposto no
interior da coluna funcionando lente condensadora dos feixes, concentrando-os e
direcionando-os para o plano onde se localiza o material. A imagem ampliada do espécime
em observação é gerada pelas lentes intermediárias que funcionam como uma lente objetiva;
posteriormente um terceiro conjunto de lentes eletromagnéticas, denominadas projetoras,
atua como lentes oculares ampliando mais uma vez a imagem. Por fim, a imagem final é
projetada em anteparo fluorescente, uma placa fotográfica ou em um monitor.
A imagem gerada no MET depende na dispersão diferencial de elétrons que, ao se
chocar com os núcleos dos átomos do espécime, se dispersam para fora da abertura das
lentes objetivas. A conseqüência da dispersão é a formação de uma imagem com pontos
eletrodensos e eletrolúcidos. Os pontos eletrodensos são observados em função de elementos
como ferro, ósmio, chumbo e ouro, enquanto pontos eletrolúcidos são observados quando os
elétrons encontram elementos como hidrogênio, carbono, nitrogênio ou oxigênio. Os materiais
biológicos são ricos nesses últimos elementos, portanto geram imagem eletrolúcidas, sendo
necessário contrastar o material com metais pesados, antes da sua observação no MET, a fim
de conseguir um bom contraste na imagem final observada.

71
 Diante dessas informações é possível montar um quadro comparativo abordando as
principais diferenças entre as microscopias ML e MET quanto aos aspectos de funcionamento
e formação da imagem como mostrado a seguir:

Microscopia Eletrônica
Aspectos Microscopia de luz
de Transmissão
Fonte Luz visível Feixe de elétrons
Lentes Vidro Eletromagnéticas
Limite de Resolução 200 nm 0,2 nm
Formação da Imagem Absorção Elétron-opacidade

Uma comparação entre os sistemas de lentes de um ML e de um MET é mostrada

na figura 12.2:

Microscopia Eletrônica de Varredura

Como vimos o MET é empregado na análise da estrutura interna da célula. As

informações da ultra-estrutura celular são obtidas a partir de cortes ultrafinos de células ou
tecidos. A imagem bidimensional do material de estudo é gerada através dos elétrons que
atravessam o objeto interagindo com seus componentes. Na Microscopia Eletrônica de
Varredura (MEV) os elétrons saltam à superfície do material revelando a topografia da

72
superfície do mesmo com grande nitidez de detalhes. Logo, a MEV é amplamente utilizada
para examinar superfícies de objetos quaisquer, seja biológico ou não, fornecendo imagens
tridimensionais dos mesmos. Além disso, MEV pode ser aplicado em estudos de objetos
grandes, inteiros, como vermes, insetos ou cabeça de um animal; em células livres como grão
de pólen, bactérias, vírus; em tecidos animais e vegetais; em fragmentos geológicos para
estudos de granulometria e textura de solos, ou objetos inanimados como prego, fibras, etc..
A estrutura de um MEV é bem diferente de um MET como pode ser observado na
figura 12.3:

Figura 12.3 – Representação da estrutura de um MEV.

O MEV é constituído de um sistema de geração de elétrons que está localizado na

parte superior do aparelho. Os elétrons gerados são acelerados atingindo o espécime. A
imagem tridimensional formada e observada é decorrente de elétrons secundários emitidos
pelo espécime, depois deste ser atingido por elétrons primários, ou por elétrons que são
refletidos da superfície da amostra. A formação da imagem é, portanto, indireta. Os elétrons
secundários ou refletidos são captados por um sistema de captação, coletados, e o sinal
emitido é amplificado, gerando em uma tela de computador a topologia da superfície do
espécime. O resultado da imagem depende da quantidade de elétrons coletado; quanto mais
elétrons coletados a partir do espécime, mais forte o sinal para o tubo e maior a intensidade
do raio na tela. As diferenças topológicas observadas (fendas, elevações, cavidades) são,
portanto, conseqüências dessas diferentes intensidades.
As imagens geradas no MEV podem chegar à ampliação de 15 até 150.000 vezes.
Este poder de resolução está relacionado com o diâmetro dos raios de elétrons que incidem
na amostra de forma que alguns modelos mais recentes fornecem resolução inferior a 5 nm.
O foco de profundidade de um MEV também é considerável: 500 vezes o obtido com o
microscópio óptico utilizando a ampliação correspondente. Este fator contribui para uma
maior qualidade tridimensional das imagens geradas no MEV. Ao nível celular o MEV permite
visualizar a superfície externa da célula e todos os processos, extensões e matérias
extracelulares que interagem com o ambiente.

73
 A MEV difere em vários aspectos da MET apesar de em ambos os casos a imagem
ser formada a partir da interação de elétrons com lentes eletromagnéticas. As principais
diferenças estão relacionadas com a formação da imagem, como pode ser observado na
figura 12.4.

Preparo de amostras para Microscopia Eletrônica

Assim como a ML a MET e MEV requerem que as amostras sejam preparadas

previamente e adequadamente antes da observação ao microscópio. Os procedimentos de
preparo de amostra para os dois tipos de ME estão relacionados com as características na
geração da imagem de cada um. Por exemplo, a amostra a ser observada no MET deve ser
uma seção. A seguir iremos destacar as principais etapas do preparo de amostra para cada
um dos ME.

A) PREPARO DE AMOSTRAS PARA MET:

A preparação de amostras para o MET obedece a etapas semelhantes aquelas

estudas para a ML na aula 3 desta apostila sendo que algumas etapas são mais críticas. O

74
tecido ou material a ser analisado dever ser cortado de modo que tenha no máximo 1mm de
espessura, facilitando a etapa de fixação (o ideal são amostras com 1mm³).
Após a coleta o material deve ser imediatamente fixado. Esta etapa é critica para a
MET, pois uma má fixação pode danificar organelas celulares e prejudicar as análises. Os
fixadores que são utilizados na ME são os aldeídos (gluteraldeído, para-formaldeído,
gliceraldeído, etc.) e o tetróxido de ósmio. É comum realizar duas fixações, a primeira com
uma combinação de aldeídos (para-formaldeído e glutaraldeído), combinando a rapidez de
penetração do formol nas células com a capacidade de preservação das proteínas e estrutura
celular do gluteraldéido; e a segunda com tetróxido de ósmio, este penetra na célula
lentamente, reage com os carboidratos e lipídeos preservando a membrana plasmática. Além
disso, o ósmio é um metal pesado sendo capaz de dispersar os elétrons aumentando o
contraste da amostra na ocasião da observação no MEV.
Uma vez o material fixado deve-se realizar a desidratação no mesmo já que o
funcionamento do ME (vácuo, elétrons, etc) requer amostras sem umidade. A desidratação é
realizada através de séries alcoólicas ou acetônicas onde a água das células e tecidos é
lentamente substituída por um solvente.
Como a MET requer amostras extremamente finas o material deve ser incluso em
resinas para permitir os cortes ultrafinos sem danificar a amostra. As principais resinas
utilizadas neste processo são as plásticas, de epóxi (Epon ou araladite) ou Spurr e as acrílicas
(LRWhite). Durante a inclusão o liquido utilizado na desidratação é substituído pela resina, de
forma que a resina ocupe todos os espaços vazios da célula, proporcionando um corte
perfeito.
Após o emblocamento na resina, realizado em formas de silicone ou suportes de
plástico, o material deve ser cortado em um ultra-micrótomo. As seções obtidas com a ultra-
microtomia são realizadas com lâminas de vidro ou diamante de forma que sua espessura
não ultrapasse 100µm. Os cortes obtidos são posteriormente coletados com telinhas de liga
metálica que fazem a função da lâmina na ML. Em geral as telinhas são confeccionadas com
cobre, ouro ou níquel e possuem 3 mm de diâmetro.
Uma vez que a amostra está na telinha é necessário realizar a contrastação, etapa
que pode ser relaciona com a coloração na ML. A contrastação da amostra permite melhor
distinção dos componentes celulares em função da diferenciação de elementos eletrodensos e
eletrolúcidos gerando grande riqueza de detalhes na imagem. Nesta etapa utiliza-se acetato
de uranila ou citrato de chumbo, metais pesados que se ligam as macromoléculas fornecendo
densidade atômica necessária para dispersar os raios de elétrons.

B) PREPARO DE AMOSTRAS PARA MEV:

A preparação de amostras para o MEV é um pouco mais simples que para MET já
que não é necessário fazer cortes no material. O material a ser fixado pode ter mais que
1mm de espessura recomendando-se no máximo 3 cm em função da distância de trabalho
do MEV. A fixação é realizada à semelhança do MET com uma fixação primária em aldeídos
e secundária no tetróxido de ósmio. Neste caso o ósmio é usado apenas para aumentar a
condutividade dos elétrons na superfície das amostras.

75
 Após a fixação faz-se o processo de desidratação do material com séries de álcool ou
acetona. Posteriormente o material é levado a um aparelho de ponto crítico onde todo o
solvente é retirado, deixando o material totalmente seco, sem umidade, semelhante a uma
esponja. O material seco é montado em suporte especial para o MEV denominado “stub”.
Segue a impregnação da superfície do material com banho de ouro, facilitando a condução de
elétrons e a amostra está pronta para ser visualizada no MEV.

O quadro abaixo apresenta uma comparação entre as MET e MEV quanto a

preparação das amostras.

Microscopia Eletrônica de
Microscopia Eletrônica de Varredura
Transmissão
Fixação com aldeído
Pós-fixação com tetróxido de ósmio
Desidratação em série alcoólica ou acetônica
Inclusão do material em resinas Secagem especial em “ponto crítico”
Ultra-microtomia para obtenção de cortes Banho de ouro na superfície do material a
ultrafinos (< 100µm de espessura) ser analisado
Contrastação com metal pesado Sem contrastação

76
 Atividade 12

1 – Compare os microscópios de luz e eletrônico.

2 – Quais as principais diferenças entre MET e MEV?

3 – Descreva as etapas envolvidas na preparação de amostras no MET e no MEV.

4 – Observe as fotomicrografias (A, B e C) e indique em que tipo de microscópio elas

foram obtidas.

5 – Indique todas as estruturas celulares que você conseguir diferenciar na

fotomicrografia D apresentada a seguir.
77
 (C)

(D)

78