INSTITUTO POLITÉCNICO DE VISEU

ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA

Vamos Aprender a Observar, Cultivar e a Isolar

Micróbios
MICROBIOLOGIA
Práticas Microbiológicas

Cursos de Licenciatura em Enfermagem Veterinária, Engenharia

Zootécnica, Engenharia Alimentar e Biotecnologia

António F. M. A. Pinto
Daniela Teixeira
(Edição ampliada e ilustrada)

Viseu, 2023/2024
ÍNDICE:

PRINCIPAIS NORMAIS A ATENDER NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA, PARA SEGURANÇA

INDIVIDUAL E COLETIVA. ................................................................................................................... 3
PROTOCOLO 1. – APRESENTAÇÃO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO OU FOTÓNICO, NOMENCLATURA E
CONCEITOS DE MICROSCOPIA. DEFINIÇÃO DE AMPLIAÇÃO; ÍNDICE DE CAMPO; ABERTURA NUMÉRICA;
COMPRIMENTO MECÂNICO E ÓPTICO DO TUBO; LIMITE DE RESOLUÇÃO DO MICROSCÓPIO; AMPLIAÇÃO
MÁXIMA ÚTIL; CONTRASTE. .............................................................................................................. 4
PROTOCOLO 2. – NATUREZA DA IMAGEM DADA PELO MICROSCÓPIO; CONSTRUÇÃO GEOMÉTRICA DA
IMAGEM ......................................................................................................................................... 12
PROTOCOLO 3. – UTILIZAÇÃO INTELIGENTE DO MICROSCÓPIO ÓPTICO ............................................. 14
PROTOCOLO 4. - PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA. ESTERILIZAÇÃO DOS MEIO DE CULTURA E DO
MATERIAL DE LABORATÓRIO........................................................................................................... 16
PROTOCOLO 5. – SEMENTEIRA/INOCULAÇÃO DE MICRORGANISMOS. UTILIZAÇÃO DE VÁRIAS TÉCNICAS
DE SEMENTEIRA INOCULAÇÃO. UBIQUIDADE E DIVERSIDADE DOS MICRORGANISMOS. ....................... 21

PROTOCOLO 6 - CARACTERIZAÇÃO DE COLÓNIAS............................................................................ 24

PROTOCOLO 7 - OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA A FRESCO DE MICRORGANISMOS. MORFOLOGIA
MICROBIANA .................................................................................................................................. 26
PROTOCOLO Nº 8. PREPARAÇÕES CORADAS OU COLORAÇÕES DE MICRORGANISMOS. OBSERVAÇÃO DE
MICRORGANISMOS COM COLORAÇÃO OU A SECO.............................................................................. 35

1 – Tipo de colorações ............................................................................................................................ 35

1.1- Colorações Simples......................................................................................................................... 35
1.2 - Colorações Diferenciais: Coloração de Gram ............................................................................ 35
1.3 - Colorações especiais ..................................................................................................................... 35
PROTOCOLO 9 – MICROMETRIA: MEDIÇÃO DE MICRORGANISMOS. CALIBRAÇÃO DO MICRÓMETRO
OCULAR OU OCULAR MICROMÉTRICA. DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE MICROMÉTRICO. ................... 41
PRINCIPAL BIBLIOGRAFIA CONSULTADA. ................................................................................................... 45

2
PRINCIPAIS NORMAIS A ATENDER NUM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA, PARA
SEGURANÇA INDIVIDUAL E COLETIVA.

1. O uso de máscara será obrigatório em função do ambiente COVID 19).

2 É obrigatório o uso de bata para proteger a roupa e o utilizador.
3 Antes de iniciar qualquer trabalho, bem como ao terminá-lo, lavar e desinfectar as
mãos.
4 Higienizar a superfície da bancada que irá utilizar, com desinfectante, antes e depois
da execução do trabalho.
5 Manter essa superfície livre de todo o material que não for utilizar.
6 Evitar que objetos ou produtos inflamáveis fiquem próximos da chama do bico de
Bunsen.
7 Todo o material usado (como pipetas, bisturis, etc…) deve ser imediatamente lavado e
as lâminas e as lâminas depois de observadas devem ser colocadas dentro do
recipiente apropriado.
8 Não deve fumar, comer ou beber dentro do laboratório.
9 Estudantes com cabelos longos devem apanhá-los, sobretudo quando o trabalho exige
a utilização do bico de Bunsen, de forma a evitar acidentes.
10 No caso de entornar qualquer cultura microbiana, comunicar imediatamente ao
docente, para que se proceda em conformidade.
11 Comunicar imediatamente qualquer acidente do género corte, queimadura, etc.
12 Nunca esquecer de flamejar as ansas e agulhas à chama antes e depois de as utilizar
na manipulação de microrganismos.
13 Quando necessitar do microscópio, deve:
a. Guardar a capa do microscópio na bancada, e voltar a colocá-la no final.
b. Colocar as lâminas já observadas dentro do recipiente com desinfectante.
c. Limpar sempre o óleo de imersão, após a utilização da lente da lente x100.
14 Não misturar material conspurcado com o material esterilizado.
15 Durante a execução dos trabalhos práticos assuma uma postura exigente e
responsável e evite deslocar-se desnecessariamente.
16 Identificar cuidadosamente as culturas microbianas, meios de cultura e reagentes
utilizados no laboratório.
17 Se zelar pela sua segurança está a contribuir para a segurança de todos.

3
PROTOCOLO 1. – APRESENTAÇÃO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO OU FOTÓNICO,
NOMENCLATURA E CONCEITOS DE MICROSCOPIA. DEFINIÇÃO DE AMPLIAÇÃO; ÍNDICE
DE CAMPO; ABERTURA NUMÉRICA; COMPRIMENTO MECÂNICO E ÓPTICO DO TUBO;
LIMITE DE RESOLUÇÃO DO MICROSCÓPIO; AMPLIAÇÃO MÁXIMA ÚTIL; CONTRASTE.
O Microscópio vem de duas palavras gregas mikrós e skop, de skopein e querem dizer
"pequeno" e "observar". É um instrumento óptico que fornece imagens ampliadas de objectos
muito pequenos, graças a um sistema de lentes e à luz. Não se sabe exactamente quem o
inventou. Dizem que o microscópio foi inventado por Zacarias Janssen, óptico holandês; é
certo porém que ele deu um ao arquiduque da Áustria de presente, em 1590.
A microbiologia começou quando se aprendeu a polir lentes, partindo de peças de vidro, e a
combiná-las até produzir aumentos suficientemente grandes que possibilitassem a visualização
dos micróbios. Em 1665, Robert Hooke viu e descreveu células num pedaço de cortiça.
Embora não tenha sido provavelmente, o primeiro a ver as bactérias e os protozoários, Antony
Van Leeuwenhoek, que viveu em Delft (Holanda) de 1632 a 1723, foi pioneiro em relatar as
suas observações, com descrições precisas e desenhos. Leeuwenhoek tinha os meios e a
oportunidade de desenvolver seu passatempo de polir lentes e fazer microscópios (Pelczar et
al., 1980).
Durante sua vida construiu mais de 250 microscópios, com lentes polidas em casa e montadas
em bronze e prata, o mais poderoso dos quais aumentava somente 200 a 300 vezes. Esses
microscópios, designados microscópios simples (uma única lente funcionava como ocular e
como objectiva) (Figura 1), tinham pouca semelhança com os microscópios ópticos compostos
de hoje (lente ocular e lente objectiva separadas), que são capazes de aumentos de 1.000 a
3.000 vezes. O microscópio de Galileu, de 1610 e o de Hooke, de 1665 (Figura 2), apresentam
maior semelhança com o instrumento moderno (Pelczar et al., 1980).

Figura 1. Microscópio óptico simples construído por Antony Van Leeuwenhoek (1632-1723)
http://www.nirgal.net/graphics/leeuwenhoek_mic.jpg

4
Figura 2. Microscópio óptico composto desenvolvido por Robert Hooke (1636-1703)
http://ce.ecn.purdue.edu/~piwc/w3-istory/hooke/hooke-microscope.gif

Os mesmos autores referem ainda que o microscópio é o instrumento mais característico do

laboratório de microbiologia, propicia o aumento que permite a visualização de organismos e
estruturas invisíveis a olho nu. Existem microscópios que possibilitam grande variedade de
ampliações, desde uma centena até centenas de milhares de vezes (microscópio electrónico
pode ampliar 200.000 vezes).

CONCEITOS FUNDAMENTAIS DE MICROSCOPIA ÓPTICA OU FOTÓNICA

AMPLIAÇÃO TOTAL:
Uma das principais funções do microscópio reside no aumento do tamanho do objecto e na
formação de uma imagem captada pelos nossos olhos, através das oculares. Como a se
demonstra na Figura 3, a Ampliação Total (AT) = Ampliação da objectiva X Ampliação da
ocular. As diferentes ampliações totais conseguidas pelo microscópio vão depender da
objectiva que estiver em serviço.

5
Figura 3. Demonstração da ampliação total.

AMPLIAÇÃO MÁXIMA ÚTIL:

O microscópio para além de ampliar deve fornecer imagens resolvidas, isto é revelando todos
os detalhes do objecto e, portanto, com grande resolução. Assim, só devemos observar
imagens microscópicas com uma ampliação, que ao mesmo tempo, seja acompanhada de
resolução. Ora, interessa saber qual a maior ampliação que é acompanhada de resolução. A
esta ampliação chama-se Ampliação Máxima Útil (AMU) = 1000 X AN, em que AN significa o
valor da Abertura Numérica de uma objectiva, valor este que está inscrito na blindagem de
cada objectiva, e que nas objectivas ditas a seco (4X, 10X e 40X) apresenta valores inferiores
a 1 e, que é crescente com a ampliação das objectivas. Repare que só na objectiva 100X (Oil),
é que o valor da sua abertura numérica é superior à unidade (1.25).
O conceito de ampliação máxima útil é fundamental, pois permite calcular qual a ampliação
total máxima, que devo utilizar no microscópio, para ter a garantia da obtenção de imagens
suficientemente ampliadas e igualmente resolvidas. Ou seja, não devemos observar imagens
com ampliações superiores à ampliação máxima útil, pois estas imagens não irão traduzir os
detalhes e os pormenores do objecto.

ABERTURA NUMÉRICA:
Trata-se de um conceito fundamental de microscopia óptica e é um parâmetro que traduz
capacidade de resolução das objectivas. Quanto maior for o valor das Aberturas Numéricas de
uma objectiva, maior é a sua capacidade de fornecer imagens resolvidas. A Abertura
Numérica (AN) = n x sen θ, em que n representa o índice de refracção do meio (meio que se
encontra entre a preparação e a lente da objectiva, que será o ar, para as objectivas a seco e o
óleo de imersão para a objectiva 100x) e θ o valor do semiângulo de abertura (em graus) da
lente da objectiva.

6
LIMITE DE RESOLUÇÃO:
O limite de resolução define-se como a distância mínima entre dois postos, abaixo da qual o
microscópio já não consegue resolver, ou seja se a distância entre esses dois pontos for
inferior ao limite de resolução do microscópio, a imagem fornecida representa apenas um
ponto. Isto é, o microscópio já não consegue resolver ou separar, dando imagem de um ponto
quando na realidade existem dois. Na prática, isto significa que microrganismos com
dimensões inferiores ao limite de resolução do microscópio, não conseguem ser visualizados
pelo instrumento. O conceito de poder de resolução ou de poder separador é uma
característica do microscópio, que resulta do valor do seu limite de resolução e que é fácil
concluir, que quanto menor for o limite de resolução maior será o poder de resolução do
microscópio. A expressão para o calculo do limite de resolução (d) = 0.5 x λ / AN, em que λ
representa o comprimento de onda da luz do espectro visível (400 a 700 nm) e NA o valor da
abertura numérica.
Na figura 4 estão representados a generalidade destes conceitos para uma melhor clarificação.

Figura 4. Representação dos diferentes conceitos de microscopia óptica ou fotónica.

Na figura 5 estão representados os trajectos dos raios luminosos, a profundidade de campo, e

a influência do óleo de imersão no trajecto dos raios luminosos que entram na objectiva.
Reparar que a maior resolução da objectiva 100x, resulta do facto do óleo ter um índice de
resolução de 1,52 e o semiângulo de abertura θ ser também maior, para além de não haver
reflexões de luz, quando comparada com a situação sem óleo. Assim, para se retirar o maior
rendimento e resolução da objetiva 100x, esta deve ser sempre utilizada com óleo de imersão.

7
Figura 5. Demonstração do efeito do óleo de imersão na resolução.

MATERIAL
Microscópio Óptico ou Fotónico

10 11 12

Figura 6 – Microscópio Ótico ou Fotónico.

8
METODOLOGIA
Faça a legenda do microscópio da figura 6.
1___________________________________________________________________________
2___________________________________________________________________________
3___________________________________________________________________________
4___________________________________________________________________________
5___________________________________________________________________________
6___________________________________________________________________________
7___________________________________________________________________________
8___________________________________________________________________________
9___________________________________________________________________________
10__________________________________________________________________________
11__________________________________________________________________________
12__________________________________________________________________________

1. Refira as principais funções de cada constituinte do microscópio óptico.

2. Faça a diferenciação entre o sistema mecânico e sistema óptico do microscópio.

SISTEMA
MECÂNICO
ESTATIVO

SISTEMA ÓPTICO

3. Nas oculares aparecem inscritos diferentes valores. Indique-os e diga ao que se

referem.

9
4. Nas objectivas aparecem inscritos diferentes valores. Indique-os e diga ao que se
referem.

5. Defina Abertura Numérica. Explique porque é que nas objectivas a seco este valor é
inferior a 1.

6. Defina Comprimento Mecânico e Comprimento Óptico do Tubo.

10
7. Defina Limite de Resolução e Poder de Resolução. Relacione estes dois conceitos.

8. Tendo em atenção a definição de limite de resolução:

9.1.Explique a vantagem da utilização de filtros e respectivas cores no microscópio.

9.2. Explique como é que a Abertura Numérica influência o limite de resolução.

9. Defina Ampliação Total e Ampliação Máxima Útil.

11
PROTOCOLO 2. – NATUREZA DA IMAGEM DADA PELO MICROSCÓPIO; CONSTRUÇÃO
GEOMÉTRICA DA IMAGEM

Quando desejamos observar objectos muito pequenos, necessitando de um aumento maior do

que o fornecido por lupas, usamos um microscópio. Apesar de serem aparelhos complexos,
podem ser considerados como constituídos por dois sistemas de lentes que funcionam como
duas lentes convergentes. A lente que fica mais próxima do objecto é denominada objectiva e
aquela através da qual a pessoa observa a imagem ampliada é denominada ocular.
O objecto é colocado próximo do foco da objectiva, que forma uma imagem real invertida e
ampliada. Esta imagem forma-se entre a ocular e o seu foco e funciona como um objecto para
esta lente ocular. Então, a ocular fornece uma imagem final virtual, direita e ainda mais
ampliada. Em resumo, a ocular actua como uma lupa, ampliando a imagem fornecida pela
objectiva, que já era ampliada em relação ao objecto. Então, se, por exemplo, a objectiva
ampliar 40 vezes o objecto e a ocular provocar uma ampliação de 10 vezes, a ampliação total
fornecida pelo microscópio será de 40 x 10 = 400 vezes (Figura 7) (Christian, s.d.).
1. Caracterize a imagem de um objecto que está muito distante da lente.

2. Caracterize a imagem de um objecto que está antes da dupla distância focal.

3. Caracterize a imagem de um objecto que está na dupla distância focal.

12
 4. Caracterize a imagem de um objecto que está entre a dupla distância focal e o foco.

5. Caracterize a imagem de um objecto que está no foco.

6. Caracterize a imagem de um objecto que está entre o foco e a lente.

7. Observe a imagem obtida através do microscópio e caracterize-a.

Figura 7 – Imagem de um objecto visto ao microscópio.

13
PROTOCOLO 3. – UTILIZAÇÃO INTELIGENTE DO MICROSCÓPIO ÓPTICO
MATERIAL
1 - Microscópio
METODOLOGIA
1. Dirija-se para o microscópio, retire-lhe cuidadosamente a capa de protecção, ligue-o à
corrente, acenda a luz no interruptor, fixe o reóstato a meio do seu curso.
2. Rodando o revólver, coloque a objectiva x10 em posição de utilização. Aproxime tanto
quanto possível a platina da objectiva, actuando no parafuso macrométrico. Abra
completamente o diafragma de campo e o de abertura, apenas a mais ou menos 1/3.
Espreitando pelas oculares, ajuste-as, alargando-as ou fechando-as, de forma a ver
com nitidez um só campo microscópio: ajustamento da distância inter-pupilar.
Mantendo-se a espreitar pelas oculares, feche o diafragma de campo, quase
completamente, e verifique se o círculo de luz ocupa uma posição concêntrica
relativamente ao resto do campo. Se isso não acontecer actue, simultaneamente, nos
dois parafusos de centragem e ajuste o círculo luminoso numa posição concêntrica:
CENTRAGEM DA LUZ. Torne a abrir o diafragma de campo até iluminar todo o campo do
microscópio.
3. Continuando a espreitar pelas oculares, afaste lentamente a platina da objectiva
actuando no parafuso macrométrico, até ver com nitidez os objectos. Neste momento
possui o OBJECTO FOCADO.
4. Actuando no parafuso do sistema pjnhão-cremalheira, aproxime o condensador, tanto
quanto possível, da platina. Feche um pouco o diafragma de campo. Espreite pelas
oculares. O que vê? A focagem feita anteriormente foi alterada ou não? Abra
novamente o diafragma de campo até ver todo o campo iluminado.
5. Continuando a espreitar pelas oculares, actue na alavanca respectiva e feche o
diafragma de abertura o que aconteceu? Tente explicar. Agora abra completamente o
diafragma de abertura. O que aconteceu? Tente explicar.
6. Deixando novamente a alavanca do diafragma de abertura a 1/3, e fechando quase
totalmente o diafragma de campo, actue muito lentamente sobre o parafuso do
condensador, enquanto se mantém espreitando pelas oculares, até ver, nitidamente
focadas as palhetas do diafragma de campo FOCAGEM DA LUZ SOBRE O OBJECTO.
Quando isto acontecer, abra novamente este diafragma, até ajustar as palhetas à
periferia do campo. Que diferenças nota na imagem relativamente à posição inicial?
Relacione com a teoria de Abbé da resolução e da iluminação
7. Continuando a espreitar pelas oculares, actue no reóstato, aumentando e diminuindo a
intensidade da luz. O que acontece? Coloque o reóstato numa posição correspondente
a uma intensidade cómoda de modo a permitir observações por períodos mais ou
menos longos sem cansar a vista.
8. Retire cuidadosamente uma ocular. Espreitando pelo tubo, abra e feche o diafragma de
abertura. O que vê?

14
 9. Na execução da experiência anterior, deixe ficar o diafragma de abertura numa posição
em que seja preenchida totalmente de luz, a lente da objectiva que está a ver:
ajustamento das aberturas numéricas. Volte a colocar a ocular. NESTE MOMENTO TEM O
OBJECTO FOCADO, CORRECTAMENTE ILUMINADO E UMA IMAGEM PERFEITAMENTE RESOLVIDA.

10. Das experiências realizadas e dos seus resultados procure deduzir quatro regras
básicas que permitem a utilização inteligente do microscópio fotónico em diascopia de
fundo claro ou microscopia de campo luminoso.
11. Coloque a objectiva x40 em posição de utilização rodando o revólver até ouvir um
clique. Observe pelas oculares. O que vê? Repare que o objecto continua focado.
Apenas é necessário corrigir a focagem, actuando lentamente no parafuso,
micrométrico. As objectivas são parafocais.
12. Observe o efeito da mudança para a objectiva x40 sobre:
12.1. Ampliação do objecto. O que aconteceu?
12.2. Diâmetro do campo. O que aconteceu?
12.3. Luminosidade. O que aconteceu?
12.4. Contraste. O que aconteceu?
12.5. Resolução. O que aconteceu?
13. Corrija as condições de luminosidade, ajustando a abertura numérica do condensador
à da objectiva. Para isso execute as operações referidas nos pontos 8 e 9. Observe
agora pelas oculares, Qual o efeito desta correcção em relação às condições de
iluminação e de resolução?
14. Coloque a objectiva x100 em serviço. Corrija com muito cuidado a focagem. Quais
foram as alterações de mudança?
15. Retire novamente a objectiva x100. Coloque sobre a lamela uma gota de óleo de
imersão (Figura 5). Torne a colocar a objectiva. Corrija os ajustamentos das aberturas
numéricas do condensador à da objectiva. Corrija a intensidade da luz se necessário.
Qual foi o efeito do óleo na resolução? Tente explicar.

Figura 8 – Metodologia de colocação do óleo na objectiva de x100.

http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab1.html

15
PROTOCOLO 4. - PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA. ESTERILIZAÇÃO DOS MEIO DE
CULTURA E DO MATERIAL DE LABORATÓRIO.
O conhecimento das exigências nutricionais dos microrganismos permite elaborar substratos
que promovam o seu crescimento, multiplicação e isolamento em laboratório. Estes substratos
que fornecem aos microrganismos os nutrientes em quantidade e qualidade adequados para o
seu crescimento, designam-se de Meios de Cultura. Na sua composição, os meios de cultura
deverão incluir os nutrientes indispensáveis ao organismo em causa, sob forma assimilável.
Quantitativamente, os nutrientes deverão estar presentes em concentrações adequadas e não
tóxicas.
Para além dos nutrientes requeridos às exigências dos microrganismos, o meio de cultura tem
que estar estéril, isto é, não deve conter quaisquer organismos vivos. Os micróbios têm uma
distribuição ubíqua e, devido às suas reduzidas dimensões, dispersam-se facilmente. Devemos
esterilizar o meio de cultura após a sua preparação, para eliminar os microrganismos
contaminantes. É, também, necessário ter precauções durante o seu subsequente
manuseamento, a fim de evitar posteriores contaminações. As técnicas usadas para a
prevenção de contaminações durante a manipulação de culturas e meios de cultura estéreis,
são designadas técnicas de assepsia.
Os meios de cultura, depois de inoculados, devem ser incubados a temperaturas adequadas.
Outras exigências essenciais ao crescimento dos microrganismos deverão, também, ser
contempladas, tais como pH, tensão de oxigénio, actividade da água (aw), valores que deverão
situar-se dentro da gama tolerada pelos diferentes microrganismos.
Em termos gerais, os meios de cultura podem ser classificados de acordo com 4 aspectos
principais: Natureza; Consistência; composição química e objectivos funcionais. Quando se
torne desejável utilizar meios sólidos em vez de meios líquidos (designados por caldos), um
agente solidificante, tal como o Agar - Agar, deverá ser incorporado no meio de cultura. O Agar
– Agar é um polissacárideo complexo, extraído de algas vermelhas. Tem a propriedade de, na
concentração de 1,5% a 2 %, fundir à temperatura de 100°C, permanecendo líquido até que
esta desça a 40 - 42°C. Quando a temperatura desce abaixo dos 40-42°C, o meio de cultura
solidifica, assim permanecendo até que seja submetido novamente a temperaturas de 100°C.
O Agar - Agar, ao contrário de outras substâncias (gelatina), não é biodegradado pelos
microrganismos, e portanto, nunca poderá ser considerado como fonte de nutrientes. Esta
característica torna-o de grande utilidade em Microbiologia. Os meios sólidos fornecem, assim,
uma superfície firme, na qual o crescimento das células vai dar origem a colónias. Os meios
semi-sólidos têm uma consistência pouco firme, pois contêm menores quantidades de agente
solidificante. Para a obtenção de meios de cultura semi-sólidos deve-se incorporar o Agar -
Agar em quantidades de cerca de metade da utilizada para os meios sólidos. São usados, por
exemplo, para permitir a visualização da mobilidade ou não mobilidade de microrganismos. Os
meios de cultura líquidos pura e simplesmente não levam Agar – Agar.

16
Um meio de cultura diz-se quimicamente definido quando a sua composição química é
rigorosamente conhecida, em termos dos compostos químicos que fornecem os nutrientes.
Para os microrganismos quimiorganotróficos, os meios de cultura devem conter pelo menos um
composto de carbono orgânico, que servirá como fonte de carbono e energia e todos os
restantes nutrientes, de acordo com as suas exigências nutricionais, o que poderá incluir uma,
de azoto orgânico e factores de crescimento (aminoácidos, vitaminas, ou bases azotadas). Nos
meios quimicamente complexos não se conhece a composição química exacta. São
constituídos por substâncias complexas, que fornecem os nutrientes, tais como extracto de
levedura, extracto de carne, extractos de plantas e peptonas (proteínas parcialmente
hidrolisadas por proteases). Todos estes preparados são substâncias químicas complexas,
contendo açúcares, aminoácidos, vitaminas e sais. São usados em rotina laboratorial,
permitindo o crescimento de uma larga gama de microrganismos, incluindo aqueles cujos
factores de crescimento não são perfeitamente conhecidos.

Material
- Provetas
- Tubos de ensaio
- Placas de Petri
- Balança
- Autoclave
- Funil
- Vidro de relógio
- Balão erlenmeyer
- Espátula
- Placa de aquecimento com agitação
- Agitador magnético
- Meio de cultura desidratado
- H2O destilada
- Potenciómetro.

Metodologia
1. Pesar a quantidade necessária do meio desidratado de acordo com a quantidade que
se deseja preparar (indicações constantes no rótulo).
2. Deitar cerca de metade da H2O destilada no balão erlenmeyer.
3. Colocar o agitador magnético no balão erlenmeyer.
4. Colocar o balão erlenmeyer na placa de aquecimento.
5. Deitar o meio de cultura pesado.
6. Deitar a restante H2O destilada e lavar a espátula e vidro de relógio.
7. Deixar aquecer até ficar transparente/ translúcido, se contiver Agar - Agar.
8. Verificar o pH, se necessário, antes de aquecer.

17
 9. Distribuir em tubos ou não conforme a finalidade.
10. Levar à autoclave esterilizar a 121°C, durante 15 minutos. Estes são as temperaturas e
os tempos mais utilizados para a esterilização da generalidade dos meios de cultura.
No entanto, existem outros meios de cultura, que pelas suas características exigem
outras condições de esterilização. A leitura do rótulo do fabricante é imprescindível.

Nas (Figuras 9 e 10) estão representados os procedimentos para a dissolução dos ingredientes
dos meios de cultura, por aquecimento com agitação, em placa de aquecimento magnética.

Figura 9 – Aspecto turvo antes do aquecimento Figura 10 – Aspecto transparente depois do

aquecimento.

Após o início da entrada em ebulição, deverá retirar-se o balão, com uma luva de protecção e
colocar-se em cima de uma toalha ou pano. Nunca colocar, directamente, em cima da banca
para evitar a quebra do balão, devido à diferença de temperaturas. Notar o aspecto
transparente do meio de cultura após o aquecimento como resultado da completa dissolução
dos ingredientes e do Agar – Agar.
Na (Figura 11) mostra-se um pormenor dos meios de cultura, distribuídos em tubos,
devidamente rolhados com cápsulas metálicas ou com rolhas de algodão, no cesto adequado
para esterilização em autoclave. O meio também pode ir a esterilizar directamente no balão,
devidamente rolhado, onde foi feita a dissolução.

Figura 11. Cesto com meio de cultura distribuído em tubos e no balão para esterilização.

18
No final da esterilização, se o objectivo for preparar placas de petri, a distribuição deverá ser
feita em quente, antes da temperatura baixar dos 42 ºC, em condições de assépsia, junto da
influência do bico de Bunsen, como se mostra na (Figura 12).

Figura 12. Cesto com meio de cultura distribuído em tubos e no balão para esterilização.

1. Complete o seguinte quadro com a classificação dos meios de cultura.

Natureza

Consistência

Composição química

Objectivos funcionais

19
2. Complete o seguinte quadro com os diferentes métodos de esterilização.

Método Uso Preferencial Comentários

Calor Seco

Calor Húmido

20
PROTOCOLO 5. – SEMENTEIRA/INOCULAÇÃO DE MICRORGANISMOS. UTILIZAÇÃO DE

VÁRIAS TÉCNICAS DE SEMENTEIRA INOCULAÇÃO. UBIQUIDADE E DIVERSIDADE DOS

MICRORGANISMOS.

Para caracterizar individualmente um microrganismo é necessário obtê-lo em cultura pura. Por

definição uma cultura pura é aquela que é obtida a partir do crescimento e da multiplicação de
uma única célula original.
As culturas puras (para ser mais rigoroso culturas axénicas) podem ser obtidas pelos métodos
de riscado em superfície (Figura 13) ou de espalhamento em placa (Figura 14), obtendo-se
colónias (crescimento macroscopicamente visível proveniente da multiplicação celular),
perfeitamente individualizadas e espacialmente separadas que, em princípio, serão originadas
a partir de uma única célula (culturas puras). Como estes métodos não permitem garantir, que
as colónias assim formadas sejam originadas a partir de uma única célula, não poderemos em
rigor afirmar que a população de uma colónia seja uma cultura pura. Diremos então que são
populações praticamente puras ou culturas axénicas.
Também usado na obtenção de culturas axénicas, é o método por incorporação (Figura 8) do
meio de cultura na amostra a analisar. Em qualquer destes métodos, far-se-ão subculturas a
partir de uma (colónia isolada, para certificação da pureza das culturas).

Material
-Placas de Petri estéreis
-Placas de Petri com meio de cultura
-Ansa
-Caneta de acetato
-Pipeta
-Tubos de ensaio com meio de cultura

Metodologia
Sementeira/Inoculação por Riscado à Superfície
1. Marcar a parte marginal da tampa de uma placa de Petri com as seguintes indicações:
meio de cultura, data, identificação do grupo de trabalho, material inoculado.
2. Esterilizar uma ansa à chama e retirar uma ansada da cultura a isolar, fazendo deslizar a
ansa sem danificar a superfície do meio.
3. Espalhar a porção de cultura, riscando a superfície da placa e seguindo as setas como se
indica na Figura 10; entre cada novo riscado, passar a ansa na chama, realizar esta
operação fazendo deslizar a ansa sem danificar a superfície do meio.
4. Incubar as placas em posição invertida, durante 2 a 3 dias à temperatura ambiente ou na
estufa. Observar as placas e registar a existência de colónias isoladas.

21
Figura 13 – Método de Riscado em Superfície (Ferreira e Sousa; 1998).

Sementeira / Inoculação por Espalhamento

1. Marcar a parte marginal da base de uma placa de Petri com as seguintes indicações: meio
de cultura, data, identificação do grupo de trabalho, material inoculado.
2. Pipetar a amostra sobre a superfície do meio de cultura sólido e espalhar com a ajuda de
uma vareta de vidro estéril dobrada e L (espalhador) (Figura 14).
3. Incubar as placas em posição invertida, durante 2 a 3 dias à temperatura ambiente ou na
estufa. Observar as placas e registar a existência de colónias isoladas.

Figura 14 – Método por espalhamento (Ferreira e Sousa; 1998)

Sementeira / Inoculação por Incorporação

1. Marcar a parte marginal da base de uma placa de Petri com as seguintes indicações: meio
de cultura, data, identificação do grupo de trabalho, material inoculado.
2. Pipetar a amostra para uma placa de Petri estéril (Figura 15).
3. Adicionar o meio de cultura com Agar – Agar, previamente liquefeito e arrefecido a cerca de
50 ºC. Misturar cuidadosamente, com 5 movimentos de rotação para a direita, cinco para a
esquerda, cinco na vertical e cinco na horizontal, sem molhar a tampa.

22
4. Deixar solidificar.
5. Incubar as placas em posição invertida, durante 2 a 3 dias à temperatura ambiente ou em
estufa. Observar as placas e registar a existência de colónias isoladas.

Figura 15 – Método por incorporação (Ferreira e Sousa; 1998)

Ubiquidade e Diversidade dos Microrganismos

1. Microrganismos da água;
- Sementeira por incorporação
- Colocar na estufa a 30 ºC

2. Microrganismos de superfícies (Bancada, telemóveis, etc)

- Sementeira com zaragatoas.
- Colocar na estufa a 30 ºC

3. Microrganismos do meio ambiente.

- Exposição ao ar das placas de Petri sem tampa durante 30 minutos a uma
hora, em diferentes locais.
-Semear placas de Petri com uma amostra de solo em suspensão por
incorporação e por espalhamento à superfície.
- Colocar na estufa a 30 ºC.

4. Microflora natural dos animais

- Semear placas de Petri (espirro, toque de dedos, boca,)
-Colocar na estufa a 30 ºC.

23
PROTOCOLO 6 - CARACTERIZAÇÃO DE COLÓNIAS

Material
- Placas de Petri já inoculadas na aula anterior.

Metodologia
1. Observar as placas de Petri inoculadas na aula anterior.
2. Verificar a existência de diferentes microrganismos através da presença de diferentes
colónias.
3. Verificar a ubiquidade dos microrganismos.
4. Caracterizar as colónias de microrganismos na forma, elevação e na margem (preencher os
quadros que estão nas páginas seguintes), utilizando a Figura 16.

Figura 16 – Caracterização das colónias de microrganismos na forma, elevação e na margem

http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab4.html
Elevação: raised (elevada); convex (convexa); flat (plana); umbonate (umbiculada); crateriforme
(cratera). Margem: entire (inteira); ondulate (ondulada); curled (enrolada); lobate (lobada).
Brilho: brilhante; cerosa, cremosa, opaca, etc. Cor: branca; preta, vermelha amarela, etc.
Aspecto: algodonoso, mucilaginoso, etc. Dimensão: determinação do diâmetro em (mm).
Colónias com dimensão inferior ou igual a 1mm, designam-se de puntiformes.

24
Observação das Colónias após Incubação
Fonte de N° de Desenho Cor Forma Dimensão Elevação Margem Observação ao
microrganismos Colónias da colónia microscópio

25
Na Figura 17 encontra-se o aspecto, forma e dimensões que as colónias de microrganismos
podem apresentar, quando crescem em meios de cultura sólidos. No caso da Figura 17 estão
representadas colónias de microrganismos isolados do ar.
Na caracterização de colónias torna-se indispensável, que no final se refira de forma expressa,
qual o meio de cultura onde se realizou aquela caracterização. Isto porque existem
microrganismos que podem apresentar colónias com características diferentes conforme o
meio de cultura onde crescem. Na (Figura 18) apresenta-se um exemplo paradigmático desta
situação. Isto é, um mesmo microrganismo, no caso, um isolamento da levedura de espécie
Saccharomyces cerevisiae, que apresenta colónias com pigmentação diferente consoante o
meio de cultura onde cresce. Ou seja, a espécies Saccharomyces cerevisiae desenvolve
colónias de cor branca amarelada quando cresce no meio de cultura Sabouraud (à esquerda) e
a mesma espécie desenvolve colónias pigmentadas de vermelho -rosa quando cresce em meio
de cultura Rose - Bengala (à direita), Figura 18. Este comportamento acontece também em
outras espécies microbianas.

Figura 17. Aspecto morfológico de algumas colónias de microrganismos.

26
Figura 18. Importância do meio de cultura, para a caracterização de colónias.

27
PROTOCOLO 7 - OBSERVAÇÃO MICROSCÓPICA A FRESCO DE MICRORGANISMOS.
MORFOLOGIA MICROBIANA

Material
-Lâminas
-Pinça
-Água Esterilizada
-Pipeta de Pasteur
-Ansa
-Bico de Bunsen
-Lamela
-Placas de Petri com Colónias

Metodologia

Microrganismos em Meio Sólido

1. Tirar com uma pinça a lâmina do recipiente.
2. Passar a lâmina pela chama.
3. Colocar uma gota de água esterilizada na lâmina, com o conta-gotas ou com uma
pipeta de Pasteur.
4. Levar a ansa ao rubro.
5. Retirar com a ansa arrefecida um pouco de crescimento de uma colónia da placa de
Petri.
6. Colocar o crescimento na gota de água, fazendo ligeiros movimentos de rotação, sem
danificar a gota, até obter uma turvação.
7. Levar novamente a ansa ao rubro.
8. Colocar a lamela. Ver figura 19.
9. Observar ao microscópio começar com a objetiva de menor ampliação (objetiva x10) e
depois de focar aumente a ampliação.

28
Figura 19. Execução de uma preparação a fresco.
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab3.html,http://www.bio-
rad.com,http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab3.html

Microrganismos em Meio Líquido

1. Tirar com uma pinça a lâmina do recipiente.
2. Passar a lâmina pela chama.
3. Retirar uma gota de líquido com os microrganismos em suspensão, com uma pipeta de
Pasteur.
4. Colocar a gota na lâmina.
5. Colocar a lamela. Ver figura 19.
6. Observar ao microscópio começar com a objetiva de menor ampliação (objetiva x10) e
depois de focar, aumente a ampliação.

29
Figura 20. Execução de uma preparação a fresco a partir de micróbios crescendo em meio
líquido.
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab2.html

Principais características distintivas para classificar os microrganismos nos grandes

grupos, através do microscópio fotónico.

30
Nas próximas (Figuras 21, 22, 23, 24, 25 e 26) irão apresentar-se algumas células microbianas
representativas dos grandes grupos de microrganismos, em preparações a fresco, para facilitar
a sua caracterização e identificação, em microscopia óptica.

Figura 21. Bactérias (células procarióticas) em forma de bastonetes. Ampliadas 1000x.

Figura 22. Fungos filamentosos (Bolores). Células eucarióticas. Ampliados 400x.

31
 Grampo de conexão

Septo

Hifas

Figura 23. Fungos filamentosos (Bolores). Células eucarióticas. Ampliados 1000x. (Algumas
classes de fungos exibem estruturas características, como os grampos de conexão nos
Basidiomicetas).

Célula mãe
Gémulas

32
Figura 24. Fungos unicelulares (Leveduras). Células eucarióticas. Ampliados 400x.

Algas

Figura 25. Algas. Células eucarióticas. Ampliados 400x.

33
Figura 26. Protozoários (Paramécias). Células eucarióticas. Ampliados 400x

Morfologia Microbiana
1. Observação microscópica a fresco de microrganismos. Desenhe nos diferentes campos o
que observa. Faça a respectiva legenda.

34
PROTOCOLO Nº 8. PREPARAÇÕES CORADAS OU COLORAÇÕES DE MICRORGANISMOS.
OBSERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS COM COLORAÇÃO OU A SECO

1 – Tipo de colorações
1.1- Colorações Simples
1.2 - Colorações Diferenciais: Coloração de Gram
1.3 - Colorações especiais
Para além da observação microscópica de bactérias e outros microrganismos através
das preparações a fresco, ente lâmina e lamela ou em gota pendente, já suas conhecidas,
existem situações que tornam conveniente o recurso às preparações coradas de
microrganismos, também conhecidas simplesmente por colorações.
O recurso às preparações coradas visa, essencialmente, os seguintes objectivos:
a) Melhorar a observação microscópica dos microrganismos através do aumento do contraste;
b) Permitir distinguir microrganismos diferentes;
c) Permitir visualizar determinadas estruturas da célula microbiana, que não se conseguem
observar devidamente através das preparações a fresco.
Em bactérias utilizam-se fundamentalmente três tipos de colorações ou de preparações
coradas, cada uma, dependendo do tipo de objectivos a atingir e que estão referidas no início
deste protocolo:
- As colorações, ditas simples, são aquelas em que normalmente se usa um só tipo de corante
(exp: azul de metileno, cristal, violeta, fucsina, eritrosina, safranina, etç), em que as células
bacterianas tomam, de uma forma uniforme a cor do corante utilizado.
- As colorações diferenciais são aquelas que permitem que as bactérias tomem cor diferente,
consoante o tipo de bactéria em causa. A mais comum e importante destas colorações, é a
chamada coloração de Gram. A coloração de Gram é, assim denominada, por reconhecimento
a um microbiologista dinamarquês, chamado Gram, que apresentou esta coloração, pela
primeira vez, em 1884. Assim, quando sujeitas a esta coloração, umas bactérias coram de roxo
- violeta (Gram positivas) e outras coram de vermelho (Gram negativas). Sabe-se hoje, que
esta dicotomia no mundo das bactérias resulta da diferença de composição química e estrutura
das suas paredes celulares. Bactérias que contêm altos teores de ácidos teicoicos e de
peptidoglicano nas suas paredes coram, pela coloração de Gram, de roxo – violeta ou azul e
são designadas de Gram positivo. Bactérias em que a sua parede celular possui uma
membrana exterior rica em lipopolissacarídeos e baixo teor de peptidoglicano coram de
vermelho e são designadas de Gram negativo.
Embora o carácter Gram, assuma especial relevo nas bactérias, não significa que outros
grupos de microrganismos não possam ser corados por este método (embora usualmente não
se aplique, por não tem nenhum atributo diferencial). A título de curiosidade, poderemos
avançar que o carácter Gram positivo está associado às leveduras, aos bolores e, obviamente
a certas bactérias, sendo as outras células são Gram negativas.

35
- As colorações especiais, são aquelas que utilizam corantes especiais e com afinidade para
determinadas estruturas específicas da célula bacteriana. São exemplos deste tipo de
coloração, a coloração de flagelos, de cápsulas, de endósporos, grânulos de gordura, etc.
Para a obtenção de uma boa preparação corada de bactérias é conveniente utilizar:
a) Culturas bacterianas jovens;
b) Culturas crescendo em meios de cultura solidificados;
c) Lâminas de vidro devidamente limpas e desengorduradas.
Para a generalidade das preparações coradas que se pretendam realizar, a técnica
geral da sua execução abrange a realização de três operações preliminares a saber:
- Esfregaço;
- Secagem do esfregaço;
- Fixação do esfregaço
O esfregaço obtém-se colocando uma gota de água destilada e esterilizada numa lâmina de
vidro, onde se faz uma suspensão, se as bactérias estiverem a crescer em meio sólido, ou
colocar uma gota de cultura se as bactérias estiverem a crescer em meios líquidos.
Com o auxílio de uma ansa espalhar uniformemente a gota, numa área de 2 a 3 centímetros
quadrados, sobre a lâmina.
A secagem do esfregaço efectua-se à chama do bico de Bunsen, colocando a lâmina com o
esfregaço para cima, numa altura em que se suporte perfeitamente o calor com a mão.
Considera-se que o esfregaço está seco quando toda a água se tiver evaporado.
A fixação do esfregaço realiza-se posteriormente à secagem e tem por objectivo fixar, ou seja
tornar aderentes, à superfície da lâmina as células bacterianas, e pode efectuar-se por
processos químicos ou físicos.
No primeiro caso usa-se o álcool como agente fixador (fixação química) e executa-se a fixação,
cobrindo o esfregaço seco com álcool, considerando-se que a fixação está terminada quando
todo o álcool se evaporar. Por vezes a fixação química processa-se simultaneamente com a
coloração e, nestas condições, o corante tem que possuir já, o agente fixador.
No segundo caso, a fixação realiza-se à chama do bico de Bunsen (fixação física) e realiza-se
fazendo passar três vezes seguidas a lâmina, com o esfregaço voltado para cima, de alto
abaixo e lentamente, pelo interior da chama. A fixação física é a mais geralmente utilizada e,
portanto, será aquela que os alunos deverão adoptar. Durante a sua execução deve-se ter o
cuidado de não deixar aquecer demasiado a lâmina para não alterar a estrutura e a forma das
bactérias.

2 - Material
- Lâminas
- Cristal Violeta
- Lugol
- Álcool iodado
- Safranina

36
- Bico de Bunsen
- Azul-de-metileno
- Crescimento bacteriano.

3 - Metodologia
Coloração Simples
1. Inundar o esfregaço seco e fixado pelo calor com o corante (Azul de Metileno a 1% ou Cristal
violeta) durante 1 minuto;
2. Escorrer e lavar cuidadosamente à torneira;
3. Secar ao ar (para uma secagem mais rápida utilizar a chama do bico de Bunsen)
4. Observar por objectiva de imersão. As células bacterianas coram tomando a cor do corante
utilizado e são mais nitidamente observáveis do que nas preparações a fresco (Figura 27).

Figura 27. Bactérias coradas pelo azul-de-metileno. Ampliadas 1000x.

37
Coloração de Gram (Coloração Diferencial)
1 - Inundar o esfregaço seco e fixado pelo calor com cristal violeta (sol. alc. fraca e oxalato de
amónio), durante 1 minuto;
2 – Escorrer o excesso de cristal violeta e lavar suavemente com água da torneira
3 - Inundar com lugol (iodeto de potássio e iodo em sol. alc. fraca), escorrer, voltar a inundar
com lugol e deixar actuar durante 1 minuto;
4 - Escorrer o lugol e lavar suavemente com água da torneira;
5 - Descorar com álcool iodado (álcool etílico com 5 % de lugol), até que deixe de sair corante,
procedimento que poderá prolongar-se por algum tempo;
5 - Lavar e escorrer o excesso;
6- Corar com safranina para contraste durante 30 segundos a 1 minuto;
7 - Lavar e escorrer o excesso;
8 – Secar o esfregaço corado ao ar ou à chama do bico de Bunsen, numa posição em que
suporte o calor com a mão e observar em objectiva de imersão em óleo.
Para obter rapidamente a focagem, foque primeiro com a objectiva 10x o esfregaço da lâmina.
Rode a objectiva e coloque uma gota de óleo sobre o esfregaço. Coloque a objectiva 100x em
posição, rectifique a focagem, faça as correcções da luminosidade adequadas e observe.
Como está recordado as bactérias (Figura 28):
- Gram Positivas coram de roxo - violeta;
- Gram Negativas coram de vermelho.

Figura 28. Execução da coloração de Gram

http://faculty.mc3.edu/jearl/ML/ml-5.htm

38
Na (Figura 29) está representado o aspecto apresentado pelas bactérias Gram positivas.

Figura 29. Bactérias coradas pela coloração de Gram. Gram positivas. Ampliadas 1000x.

Na (Figura 30) está representado o aspecto apresentado pelas bactérias Gram negativas após
coloração de Gram.

Figura 30. Bactérias coradas pela coloração de Gram. Gram negativas. Ampliadas 1000x

39
Coloração de Flagelos

Como é do seu conhecimento os flagelos bacterianos são as estruturas responsáveis pela

mobilidade bacteriana, sendo constituídos por proteínas denominadas de flagelinas. Os
flagelos são estruturas muito frágeis podendo destacar-se ou destruir-se com muita facilidade,
sobretudo quando sujeitos a manipulações bruscas (pipetagens ou homogeneizações muito
vigorosas). Para que sejam visualizados é necessário corá-los e ao mesmo tempo aumentar o
seu diâmetro, de forma a atingirem uma espessura superior ao limite de resolução do
microscópio fotónico. O ácido tânico que faz parte do corante dos flagelos é que tem a função
de se ligar ao flagelo, engrossando-o.

Metodologia
1 – Transferir com uma ansa um pouco de crescimento de colónias jovens de bactérias móveis,
para um tubo de ensaio com um pouco de solução de Ringer estéril. Inverter o tubo uma vez,
cuidadosamente, para homogeneizar;
2- Com uma pipeta de pipeta de Pasteur, transferir uma gota desta suspensão para uma
lâmina de vidro seca e desengordurada;
3 – Deixar secar ao ar;
4 – Cobrir a lâmina com o corante para flagelos e deixar actuar por 5 minutos, até que surja um
brilho verde metálico, em cerca de metade da lâmina. Não deixar secar a totalidade do corante
na lâmina;
5 – Retirar o corante, cuidadosamente, enxaguando em água;
6 – Secar ao ar.
7 - Observar ao microscópio com objectiva de imersão.

40
PROTOCOLO 9 – MICROMETRIA: MEDIÇÃO DE MICRORGANISMOS. CALIBRAÇÃO DO

MICRÓMETRO OCULAR OU OCULAR MICROMÉTRICA. DETERMINAÇÃO DO

COEFICIENTE MICROMÉTRICO.

Introdução
O conhecimento das dimensões das células microbianas, bem como de algumas
estruturas características dos microrganismos, nomeadamente, o tamanho dos endósporos
bacterianos, o tamanho das estruturas de frutificação dos fungos filamentosos e dos
respectivos esporos, constitui um instrumento importante e necessário para a classificação e
identificação dos micróbios.
Curiosamente, os Artigos que descrevem as características dos Géneros, incluídos em
cada uma das Secções, no Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, iniciam-se
apresentando, as dimensões das células bacterianas, logo a seguir à morfologia típica das
bactérias incluídas em cada género.
Medir uma célula microbiana, ou outra estrutura microscópica, significa, tal como nas
medições de objectos macroscópicos, comparar o comprimento ou a largura da célula
microbiana com uma escala calibrada e graduada, em unidades de comprimento, adequadas
às dimensões próprias dos microrganismos. Sendo os microrganismos de reduzidíssimos
tamanhos, utiliza-se o micrómetro (1 micrómetro = 10-3 mm) como a unidade comprimento
adoptada e adequada para exprimir as suas dimensões.
Os instrumentos de medição utilizados, terão que ser escalas ou réguas próprias para
a função, inseridas em dispositivos ópticos especiais.

Material
- Microscópio fotónico
- Micrómetro objectivo
- Micrómetro ocular
- Microrganismos

Relativamente ao microscópio fotónico, os alunos possuem já, informação e formação

suficientemente relevante, para a sua correcta utilização.
O micrómetro objectivo, que dispomos, é constituído por uma lâmina de vidro, com
cerca de 75 mm x 25 mm, na qual está gravada uma escala micrométrica, com um
comprimento de 1 milímetro e dividida em 100 partes rigorosamente iguais, medindo cada
parte ou divisão 1 centésimo de milímetro ou seja 10 micrómetros. Existem outras escalas com
2 milímetros de comprimento, encontrando-se estas, divididas em 200 partes iguais, medindo
consequentemente cada parte também 10 micrómetros.

O micrómetro ocular ou também designado ocular micrométrica é uma ocular normal

(x10), em cujo diafragma está gravado um retículo com um determinado comprimento e que

41
está dividido em 100 partes ou intervalos rigorosamente iguais, em que a medida de cada
intervalo, será determinada a partir do micrómetro objectivo e variará de acordo com a
ampliação da objectiva que for utilizada.

Metodologia
- Observe com atenção e com muito cuidado o material fornecido. Pegue no
micrómetro ocular, espreite pela lente frontal e rode a sua parte superior até focar com nitidez a
escala micrométrica. Tente memorizar o aspecto da escala e verifique se as suas
características estão de acordo com a descrição feita anteriormente.
- Observe o micrómetro objectivo, com muito cuidado, pois trata-se de uma lâmina de
vidro extremamente cara, e verifique as inscrições que contém.

Calibração do micrómetro ocular

Como já se apercebeu, a medição dos microrganismos é realizada com o micrómetro
ocular, utilizando uma objectiva de ampliação adequada, ao tamanho do microrganismo, mas
depois de se ter realizado a calibração do micrómetro ocular em função do micrómetro
objectivo, isto é, determinar para cada objectiva, qual o valor de cada divisão do micrómetro
ocular.

Metodologia
Objectiva x 4
1 - Sente-se correctamente ao microscópio, coloque cuidadosamente o micrómetro objectivo
na platina, ligue o microscópio, coloque a objectiva x4 em serviço e foque correctamente a
escala do micrómetro objectivo. Verifique se as características estão de acordo com o que já foi
referido.

2 - Substituir uma ocular do microscópio pelo micrómetro ocular e foque a escala do

micrómetro ocular, rodando a parte superior da ocular. Espreitando só pelo micrómetro ocular
procure rectificar as focagens de forma a ver com nitidez as duas escalas.

3 - Rodando a ocular micrométrica convenientemente e actuando no parafuso da sobre -

platina móvel, coloque as duas escalas em posição paralela, ou sobreponha-as, fazendo
coincidir, à esquerda, um traço do micrómetro ocular com um outro do micrómetro objectivo.
4 - Procurar à direita destes dois traços coincidentes, outro par de traços igualmente
coincidentes, e tão afastados dos primeiros quanto possível.
5 - Contar, no intervalo assim definido, o número de divisões do micrómetro ocular e o número
de divisões do micrómetro objectivo.
6 - Calcular, mediante uma proporção, o valor (em micrómetros) de cada divisão do micrómetro
ocular - Coeficiente micrométrico.

42
Para as objectivas x10; x40 e x100, proceder rigorosamente, da mesma forma e calcular para
cada uma das objectivas o Coeficiente micrométrico, ou seja o valor de cada divisão do
micrómetro ocular. Estes valores deverão ser apreendidos e fixados pois são necessários ao
cálculo das medições dos microrganismos, de acordo com a objectiva que utilizarmos nessas
medições.

Resultados da Calibração
Ampliação da Objectiva Coeficiente micrométrico (µm)
X4 25
X10 10
X40 2.5
X100 1

Execução de medições
Após a calibração do micrómetro ocular, está em condições de proceder à medição das
células microbianas. Utilizaremos para tal uma cultura de leveduras que lhe são fornecidas em
tubos de ensaio.
Faça uma preparação a fresco de leveduras, utilizando as técnicas que já conhece e
substitua o micrómetro objectivo, pela preparação dos microrganismos a medir.
Foque e ilumine correctamente os microrganismos e observe-os, utilizando a objectiva
mais conveniente (x40).
Escolha uma célula isolada e proceda à sua medição. Para isso rode convenientemente o
micrómetro ocular e verifique quantas divisões ocupa o maior diâmetro da levedura. Registe
esse número. Faça medições de outras células. Repare que se tratam de células em forma
oval, pelo que ficarão melhor caracterizadas pelas medidas do diâmetro maior e menor. Repare
que algumas células se apresentam gémuladas. Meça também as gémulas e compare-as com
o tamanho da célula mãe.

Resultados das medições: Número de divisões ocupadas no micrómetro ocular x

coeficiente micrométrico da objectiva utilizada.

Sugestões
- Após realizar o trabalho prático, faça a medição do diâmetro do campo da objectiva x
40, utilizando o micrómetro objectivo. Compare este resultado com o obtido, utilizando a
fórmula, que dá o diâmetro de campo, em função do índice de campo e da ampliação da
objectiva.
- Durante a calibração do micrómetro ocular, e dos resultados obtidos para os
coeficientes micrométricos, de cada objectiva, procure verificar se existe alguma relação entre
os coeficientes micrométricos de duas objectivas e os respectivos factores de ampliação.

43
 - Suponha que media uma célula microbiana utilizando a objectiva x10, e que esta
ocupava duas divisões no micrómetro ocular. Se medisse a mesma célula microbiana,
utilizando a objectiva x40, quantas divisões ocuparia no micrómetro ocular? Quantos
micrómetros media a célula?

Figura 31. Aspecto das escalas dos micrómetros.

44
PRINCIPAL BIBLIOGRAFIA CONSULTADA.
Christian (s.d.). Refração da Luz. In: Física - Terminologia e Óptica. 87 pp.
Ferreira W. F. C. e Sousa J. C. F. (1998). Microbiologia. Volume 1. Lidel edições técnica.
342pp.

Pinto - Marques, C.A.R., & Galhardo, M.I.P.A.T., (1988). Trabalhos Práticos de Microbiologia.
3ª ed. A.E.A., Instituto Superior de Agronomia, Lisboa.

http://ce.ecn.purdue.edu/~piwc/w3-istory/hooke/hooke-microscope.gif
http://faculty.mc3.edu/jearl/ML/ml-5.htm
http://www.bio-rad.com
http://www.nirgal.net/graphics/leeuwenhoek_mic.jpg
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab1.html
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab2.html
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab3.html
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab3.html
http://www.slic2.wsu.edu:82/hurlbert/micro101/pages/101lab4.html

45