Separação de componentes de uma mistura por cromatografia de exclusão molecular

Trabalho prático nº3

23 de novembro de 2023
Nomes: Carolina Gaspar
Madalena Linhol
Sharon Gamboa
Tomás Metrógos

Curso: Ciências Biomédicas e da Saúde

 Separação de componentes de uma mistura
por cromatografia de exclusão molecular
Trabalho prático nº3

A busca por métodos eficazes de separação e análise de misturas complexas

remonta a séculos, impulsionada pelo desejo de compreender a composição
intrínseca de substâncias e materiais. No contexto dessa jornada histórica, a
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cromatografia de exclusão molecular (CEM) emerge como uma evolução

significativa, representando um marco nas técnicas de separação e análise
molecular.

A história da cromatografia remonta ao início do século XX,

quando o botânico russo Mikhail Tsvet introduziu o conceito
durante suas investigações sobre pigmentos vegetais. Tsvet
utilizou uma coluna de adsorvente para separar os constituintes
coloridos das plantas, dando origem à cromatografia inicial. No
entanto, a técnica de exclusão molecular como a conhecemos
hoje começou a tomar forma nas décadas seguintes, à medida
que os cientistas aprimoraram e refinaram a abordagem original.

A cromatografia de exclusão molecular foi desenvolvida como uma resposta à

necessidade de separar moléculas de diferentes tamanhos. No decorrer do
tempo, diversos cientistas contribuíram para a evolução desta técnica,
aprimorando o suporte poroso, os detectores e as condições operacionais. A
compreensão aprofundada da teoria por trás da CEM também se desenvolveu,
solidificando o seu lugar como uma ferramenta essencial em laboratórios de
pesquisa e indústrias.

A eficácia desta técnica reside na utilização de um suporte poroso, geralmente

um gel. À medida que a amostra é injetada na coluna, ocorre uma dinâmica
fascinante. Moléculas menores, que conseguem penetrar nos poros do suporte,
avançam mais rapidamente, enquanto as moléculas maiores são retardadas ao

1
serem excluídas dos poros, prolongando seu tempo de eluição. O resultado é
uma separação gradual dos componentes da amostra com base em seus
tamanhos moleculares.

Ao explorar esta técnica, visamos não apenas isolar os componentes individuais,

mas também compreender a distribuição e a interação entre eles. A capacidade
da CEM em oferecer resolução em escala molecular faz dela uma ferramenta
inestimável em diversos campos, desde a pesquisa bioquímica até a indústria
farmacêutica.

Neste contexto, este relatório descreve o desenho experimental, os materiais

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utilizados e os procedimentos adotados para conduzir a cromatografia de
exclusão molecular.

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 A atividade prática tem como objetivo a separação cromatográfica de uma
mistura de compostos de acordo com a sua massa molar. Além disso, tem como
objetivo a determinação dos respetivos coeficientes de distribuição (Kav).
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Material:
 1 coluna cromatográfica (1,8 x 35cm) e respectivo suporte;
 Pipeta de 1mL;
 1 proveta de 10 mL;
 1 tubos de ensaio e suporte
 1 pipeta Pasteur
 1 copo de 250 mL

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 Células de sílica fundida

Equipamento:
 Espectrofotómetro

Reagentes:
 Sephadex G-100 (Intervalo de fracionamento: 4 000 – 150 000): 12 g de
Sephadex para 210 mL de cloreto de sódio 0,9%.
 Solução de cloreto de sódio 0,9% (p/v).
 Amostra: azul de dextrano (5 mg), cromato de potássio (2 mg) e
citocromo c (10 mg) num volume total de 5 mL em solução de cloreto
de sódio 0,9% (p/v).

4
 A - Preparação da coluna cromatográfica

1. Desgaseificar o gel sob vácuo durante aproximadamente 30min.

2. Colocar a coluna no suporte.

3. Colocar no fundo da coluna uma pequena porção de lã de vidro, previamente

embebida em eluente (NaCl 0,9%).
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4. Colocar na coluna cerca de10 mL de eluente (NaCl 0,9%).

5. Adicionar o gel até preencher cerca de 75% da altura da coluna.

6. Deixar escoar o eluente até o menisco ser tangencial à matriz, sem a deixar
secar.

B - Separação dos componentes da mistura

1. Aplicar cuidadosamente, sobre o gel, 1 mL da solução da amostra.

2. Emergir a amostra no gel, eluindo a fase móvel muito lentamente.

3. Preencher o restante volume da coluna com o eluente (NaCl 0,9%).

4. Deixar passar o eluente através da fase estacionária até à resolução completa

dos componentes da mistura, recolhendo alíquotas de 1 mL de eloato para cada
um dos tubos de ensaio previamente marcados, tendo o cuidado de nunca
deixar secar a coluna.

5. Ler a absorvância das alíquotas a 280 nm.

5
Volume (mL) Absorvância
1 0,283
2 0,253
3 0,255
4 0,184
5 0,247
6 0,184
7 0,185
8 0,217

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9 0,235
10 0,186
11 0,199
12 0,253
13 0,145
14 0,146
15 0,197
16 0,227
17 0,249
18 0,493
19 1,375
20 1,712
21 2,126
22 2,600
23 1,925
24 1,906
25 1,959
26 2,005
27 2,114
28 2,302
29 1,804
30 2,162
31 2,149
32 2,125
33 1,957
34 1,942
35 1,686
36 1,560

6
 Volume (mL) Absorvância

37 1,300
38 1,134
39 1,026
40 0,912
41 0,822
42 0,778
43 0,715
44 0,716
45 0,683
46 0,631
47 0,649
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48 0,674
49 0,570
50 0,551
51 0,516
52 0,517
53 0,534
54 0,491
55 0,544
56 0,554
57 0,659
58 0,718
59 0,845
60 0,936
61 0,951
62 1,026
63 1,046
64 1,025
65 0,933
66 0,860
67 0,772
68 0,070

1
 1. Construir o cromatograma.
Eixo do x- Volume / Eixo do y- Absorvância

Cromatograma
3,000

2,500

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2,000

1,500
Série1
1,000

0,500

0,000
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67

2. Determinar o volume de exclusão da coluna (V0).

Sabemos que o volume de exclusão da coluna, V0, corresponde ao valor do x do
primeiro pico que observamos. Neste caso, esse valor corresponde a 22 mL.

Cromatograma
3,000

2,500

2,000

1,500
Série1
1,000

0,500

0,000
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67

2
 3. Determinar o volume total da coluna (Vt).
A coluna caracteriza-se por ser um cilindro, dessa forma, para conseguirmos
calcular o seu volume total precisamos do raio, 1.5cm, e da altura do cilindro,
15cm, bem como da constante , 3.14. Substituindo os valores temos que:

𝑉𝑡 = 𝜋 × 𝑟 2 × ℎ ↔ 𝑉𝑡 = 3,14 × (1,5)2 × 15 ↔ 𝑉𝑡 = 105.975 𝑐𝑚3

4. Determinar o volume de eluição da BSA, do citocromo c e do

cromato de potássio.
O volume de eluição corresponde ao momento em que os valores de
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absorvância da coluna sofrem alterações a partir do primeiro pico. O valor do

volume de eluição é o valor correspondente ao pico.
De acordo com os valores de absorvância obtidos, os volumes de eluição das
amostras são:
Ve (BSA) = 28 cm3
Ve (citocromo c) = 30 cm3
Ve (cromato de potássio) = 63 cm3

5. Calcular os coeficientes de partição para a BSA, o citocromo c

𝑽 −𝑽
e para o cromato de potássio, utilizando a equação 𝑲𝒂𝒗 = 𝑽𝒆−𝑽 𝟎
𝒕 𝟎

Dados:
Vt=105.975 cm3
V0= 22 cm3
Ve (BSA) = 28 cm3
Ve (citocromo c) = 30 cm3
Ve (cromato de potássio) = 63 cm3

KAV (BSA) = (28-22)/(105,975-22)= 0,07145

Kav (citocromo c) = (30-22)/(105.975-22)= 0,09526
Kav (cromato de potássio) = (63-22)/(105.975-22)= 0.488241

3
Conforme os dados obtidos, a análise destes compostos foi realizada a
comprimentos de onda na ordem dos 280 nm. Este comprimento de onda é
utilizado neste caso pois as amostras absorvem radiações na zona do UV, ainda
que o azul dextreno absorva também da gama dos visíveis por ser de cor azul,
sendo este utilizado para determinar o volume de exclusão da coluna,
correspondente ao primeiro pico registado.
Os valores de KAV podem ser comparados tendo em conta as massas
moleculares das amostras utilizadas. No caso do azul dextreno, o valor de K AV
seria igual a zero já que o valor do volume de eluição seria igual ao valor do

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volume de exclusão da coluna, sendo que por essa razão seja apenas utilizado
para saber o valor desse volume.
Relativamente aos valores de KAV para a BSA, citocromo C e cromato de
potássio, estes são superiores a zero e inferiores a 1, obtendo-se valores
distintos, com exceção para a BSA e citocromo C, devido às massas moleculares
respetivas.
Assim, através destes resultados, é possível constatar que a os valores do
coeficiente de partição estão interligados com a massa molecular da amostra e o
com o tamanho dos poros do gel utilizado. As proteínas utilizadas possuem uma
massa molecular idêntica, daí o seu coeficiente de partição ser de ordem
semelhante tal como o volume de eluição ser bastante aproximado. Já com o
cromato de potássio, como a sua massa molecular é mais reduzida do que os
anteriores, o seu volume de eluição tem que ser superior e, consequentemente,
o KAV também tem que ser superior.

4
 Através do método cromatográfico de exclusão molecular, foi-nos possível
observar, de acordo com o nosso objetivo, a separação dos compostos através
da massa molecular. A construção do cromatograma possibilitou-nos uma
melhor visualização e compreensão deste processo de separação.

Além disso, também nos foi possível determinar os coeficientes de distribuição

(Kav) dos diferentes compostos. Depois de calcularmos o volume de eluição
(Ve) dos componentes, o volume de exclusão (V0) e o volume total (Vt) da
coluna, conseguimos estabelecer uma relação entre os diferentes compostos e
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as suas respetivas massas moleculares relativas.

Em resumo, esta experiência reafirma a importância da cromatografia de

exclusão molecular como uma técnica versátil para a separação e análise de
misturas complexas. Esta técnica também proporciona um entendimento mais
profundo das interações moleculares em sistemas biológicos e químicos.

5
COLLINS, C. H. I. Michael Tswett e o “nascimento” da Cromatografia.
Disponível em:
<https://www.iicweb.org/scientiachromatographica.com/files/v1n1a1.pdf>
. Acesso em: 23 nov. 2023.

Fundamentos. Disponível em:

<http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?Itemid=451>. Acesso em:
23 nov. 2023.

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Porto Editora – cromatografia na Infopédia [em linha]. Porto: Porto Editora.
[consult. 2023-11-23 20:53:47]. Disponível em
https://www.infopedia.pt/$cromatografia