CURSO CIÊNCIAS BIOMÉDICAS LABORATORIAIS

TRABALHO PRÁTICO
A Importância da recuperação antigénica na técnica de IHQ
UNIDADE CURRICULAR: IMUNOHISTOQUÍMICA E PATOLOGIA MOLECULAR ANO LETIVO 2022-2023

1. Introdução

O sucesso da recuperação antigénica demonstrou que a modificação da estrutura proteica induzida pelo
formol é um processo reversível sobre certas condições e desde que as proteínas mantenham a sua
estrutura primária fornecida pelo conjunto de aminoácidos. A introdução de métodos de recuperação
antigénica foi, sem dúvida, um dos principais modos que hoje conhecemos, pois até ao seu aparecimento
somente uma pequena percentagem de antigénios podia efetivamente ser detetada. Com o aumento de
substâncias detetáveis nos tecidos ou células aumentou a procura da Imunohistoquímica tanto ao nível
do diagnóstico, como do prognóstico, como da indicação terapêutica. (Ferro A., Imunohistoquímica, 2014,
ISBN: 978-989-20-5416-2).

2. Objetivo

Avaliar a importância da recuperação antigénica na técnica de Imunohistoquímica

3. Procedimento: Técnica de Imunohistoquímica

A) DESPARAFINAÇÃO E HIDRATAÇÃO

 2x Xilol 10 min
 2x Álcool 100% 3 min
 1x Álcool 70% 3 min
 Água corrente 3 min
B) RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA

(Lâmina A: Com recuperação antigénica; Lâmina B: Sem recuperação antigégica)

 Encher a parte inferior do equipamento com água até ao nível máximo indicado;

 Colocar a solução de recuperação antigénica nos Coplin Jars, colocar as lâminas e colocar os
Coplin Jars no banho maria durante 40 minutos.

 Após o tempo decorrido, deixar arrefecer as lâminas nos Coplin Jars com solução de
recuperação durante 20 minutos.

 Colocar em tampão de lavagem.

C) INIBIÇÃO DE SUBSTÂNCIAS ENDÓGENAS

 Inibição da peroxidase endógena: Preparar uma solução de peroxido de hidrogénio aquosa a

10% (v/v). Cobra as lâminas com o H2O2 durante 10 minutos. Lavar em tampão (3x2min).
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 D) INCUBAÇÃO COM ANTICORPO PRIMÁRIO

Incubação do anticorpo primário com as condições previamente padronizadas: Diluição, tempo e

temperatura. Após incubação, lavagem tampão (3x2min).

E) SISTEMA DE DETECÇÃO

Técnica com anticorpo secundário anti-rabbit/anti-mouse com polímero de peroxidase:

Incubar 30 minutos com o anticorpo secundário com polímero de peroxidase (Dako®);
Lavagem em tampão (3x2min).

F) CROMOGÉNEO

 Diaminobenzidina (DAB) (Dako®): Para cada 1 ml de diluente de DAB e adicionar 20 µl de

cromogéneo. Incubar durante 5 a 10 minutos. Lavar as lâminas com água destilada. (NOTA: A
primeira lavagem com água após o DAB tem que ser feita de modo a descartar o DAB num recipiente para posterior neutralização

com lixivia); Lavagem em água corrente durante 5 minutos

G) CONTRASTE NUCLEAR

 Corar as lâminas com Hematoxilina 3 minutos;

 Lavagem em água corrente durante 2 minutos
 Diferenciação em água amoniacal 1% (v/v) 1 minuto
 Lavagem em água corrente durante 3 minutos

H) DESIDRATAÇÃO E DIAFANIZAÇÃO

 1x Álcool 70% 5 min

 1x Álcool 95% 5 min
 2x Álcool 100% 5 min
 2x Xilol 5 min
I) MONTAGEM DE LÂMINAS

Montar as lâminas com meio de montagem permanente.

4. Discussão e Conclusão

Após a realização do trabalho prático TP1 e da leitura do artigo "A molecular mechanism of formalin fixation and
antigen retrieval” Sompuram SR et al. Am J Clin Pathol. 2004 Feb;121(2):190-9, responda Às seguintes questões:

I. Quais os resultados obtidos na lâmina A em comparação com a Lâmina B? (não responder)

II. De que modo é que a recuperação antigénica pode afetar o diagnóstico final? (TP1)

III. Comente a Imagem 3 do artigo.

IV. Qual o modelo experimental usado para avaliar o mecanismo molecular da fixação por formol e
recuperação antigénica? (artigo)

V. Quais as limitações dos resultados obtidos? (artigo)