TP1 – Produção de anticorpos

O que são anticorpos?

Anticorpos são glicoproteínas da superfamília das imunoglobulinas, uma das mais abundantes do genoma humano, que são
produzidas nos vertebrados como resposta a uma exposição a estruturas agente exógenas – antigénios. Estes são mediadores da
imunidade humoral e são extremamente diversos e específicos. Inicialmente estas moléculas eram designadas por antitoxinas porque
foram descobertas por conferirem proteção contra a toxina da difteria. Os anticorpos (BCR secretado) e os TCRs são as duas classes
de moléculas utilizadas na imunidade adquirida para reconhecerem de forma específica os antigénios.

A primeira função dos anticorpos é reconhecer e ligar-se

ao material estranho – antigénio. Não obstante, estes também
desempenham uma segunda função de estimular a eliminação do
material estranho: ligação de algumas moléculas (moléculas
efetoras) ao material estranho coberto por anticorpos, ativando-se
mecanismos complexos de eliminação (ex: proteínas do sistema
complemento, fagocitose pelas células imunes do hospedeiro,
ect.). Assim, os sistemas efetores são estimulados essencialmente
pelas moléculas de anticorpo reunidas na superfície do material
estranho.

O anticorpo consiste em três unidades. Duas unidades

são idênticas entre si e participam da ligação ao antigénio –
segmentos Fab (fragmento de ligação ao antigénio). Essas unidades contêm regiões sequenciais extremamente variáveis para cada
antigénio e conferem a determinado anticorpo a sua especificidade de ligação. A existência de dois segmentos Fab idênticos facilita a
ligação do anticorpo ao antigénio. A terceira unidade – Fc (fragmento cristalizável) – participa na ligação às moléculas efetoras. A
molécula de anticorpo é formada por quatro cadeias: duas cadeias pesadas idênticas que constituem os fragmentos Fab e Fc e duas
cadeias leves iguais associadas apenas ao Fab (região
verde na imagem acima).

Isotipos de anticorpos

Os anticorpos (ou imunoglobulinas) podem ser

divididos em 5 classes distintas, denominadas por
isotipos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Estas diferem na sua
cadeia pesada, sendo respetivamente, α, δ, ε, ϒ e µ.
Estas diferenças refletem diferentes funções efetoras
aquando da ligação ao antigénio. Por exemplo, o
reconhecimento do antigénio pela IgM poderia resultar
na ativação do complemento, enquanto o
reconhecimento pela IgE (com o mesmo antigénio)
poderia causar desgranulação dos mastócitos.

• A IgG é um monómero que representa o

principal anticorpo no soro (porção líquida
remanescente do sangue após a sua
coagulação) e nos tecidos (exceto mucosas),
onde inativa os patogénicos diretamente, mas

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 também pela sua interação com as moléculas ativadoras efetoras (ex: complemento).
• A IgM é um pentâmero encontrado no soro e é extremamente eficiente na ativação do complemento. A sua forma monomérica
com uma sequência acoplada à membrana é o principal recetor de anticorpos utilizado pelos linfócitos B para reconhecer
antigénios. Difere da IgG porque possui um par adicional de domínios constantes em vez da região da dobradiça.
• Existem 3 formas solúveis de IgA. Os monômeros e pequenas quantidades de dímeros de IgA (dois monómeros ligados por
um polipéptido conhecido como cadeia J) são responsáveis por ajudar na ligação dos patogénicos às células efetoras por meio
de recetores específicos Fc para IgA. A IgA secretada é formada por um dímero de IgA e uma proteína conhecida como
componente secretor, e é essencial à proteção das superfícies mucosas contra o ataque dos microrganismos.
• A IgE é um monómero geralmente encontrado em concentração muito baixa no soro. Na verdade, a maior parte da IgE está
ligada aos recetores Fc de IgE dos mastócitos. O acoplamento de um antigénio à IgE desencadeia uma reação inflamatória
aguda, que pode colaborar com a defesa imune. Contudo, também pode desencadear reações alérgicas indesejáveis.
Também possui um par adicional de domínios constantes, em vez da região da dobradiça.
• A IgD é um anticorpo encontrado principalmente na superfície das células B como recetor de antigénio combinado com a IgM,
auxiliando no controlo da ativação e supressão dos linfócitos. Este monômero possui uma região de dobradiça longa.

• um anticorpo tem a capacidade de estabelecer interações físicas simultâneas com dois epítopos idênticos.
• um antigénio (molécula capaz de ser reconhecida por um anticorpo) pode conter vários epítopos distintos.
• as interações entre anticorpo e antigénio não são exclusivas de proteínas podendo ser estabelecidas com qualquer tipo de
molécula.

Atualmente, várias terapias têm por base a utilização de anticorpos. Podem ser reagentes utilizado na investigação, assim
como para diagnóstico.

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Como são produzidos os anticorpos?

Os anticorpos podem ser produzidos de forma “natural” ou de forma artificial.

Os anticorpos são apenas sintetizados pelos linfócitos B. Alguns

autores consideram que o anticorpo pode existir sob duas formas: numa
forma transmembranar na superfície dos linfócitos B, ou numa forma
secretada. Contudo, esta primeira forma corresponde na verdade ao recetor
das células B (BCR), pelo que alguns apenas consideram a segunda forma.

Quando o BCR reconhece um antigénio, a célula B diferencia-se em

plasmócito que depois irá secretar anticorpos, que logicamente terão a
mesma especificidade que os BCRs.

A região do complexo do antigénio que é especificamente reconhecida pelos linfócitos designa-se determinante antigénico
ou epítopo. A teoria da expansão clonal diz-se que clones de linfócitos específicos para vários antigénios são desenvolvidos antes e
independentemente da exposição ao antigénio. Quando o antigénio se liga à célula pré-existente, esta é ativada levando à resposta
imunológica. Como vimos anteriormente, esta exposição torna o organismo capaz de responder a determinado antigénio, sendo a
resposta secundária e subsequentes exposições ao mesmo antigénio, são tipicamente mais rápidas e de maior magnitude.

A maior parte dos microrganismos (ou outros agentes estranhos) passam as barreiras epiteliais e colonizam os tecidos e é aí
que entra a imunidade adaptativa. Esta é desencadeada após ativação dos linfócitos. Para que os linfócitos reconheçam o antigénio,
tipicamente necessitam de células apresentadoras de antigénio (APCs), sendo as mais especializadas as células dendríticas. Os
linfócitos naïve expressam recetores de antigénio, mas ainda não foram expostos ao antigénio. Após ativação, estes linfócitos vão
proliferar, resultando num aumento do número de clones específicos para aquele antigénio – expansão clonal. Posteriormente, ocorre
diferenciação do linfócito ativado em células capazes de eliminar o antigénio (células efetoras), assim como produção de células de
memória. Esta ativação e diferenciação leva alguns dias, o que explica porque é que a resposta adaptativa é mais lenta a atuar. Após
eliminação do microrganismo, estas células sofrem apoptose, permanecendo somente as células de memória.

No gráfico abaixo podemos ver mais uma vez que a resposta primária da imunidade adaptativa tem um período lag (ou período
latente) de aproximadamente 10 dias, durante o qual nenhum anticorpo é detetado no soro. O fim deste período é caracterizado por um
aumento de IgM, havendo em simultâneo diferenciação das células B em plasmócitos – células produtoras de anticorpos. As células
auxiliares do tipo II (TH2) vão promover a produção de outras classes (class switch) de imunoglobulinas, nomeadamente IgG (havendo
declínio de IgM e aumento de IgG). Durante a resposta primária, algumas destas células B são diferenciadas em células de memória. A
resposta secundária ocorre mais rápido e o período de latência é menor, e a produção de IgG é superior. Os anticorpos produzidos
nesta secunda resposta são mais eficientes, uma vez que se ligam com maior afinidade aos epítopos alvo. Os plasmócitos produzidos
durante a resposta secundária vivem mais tempo do que aqueles que são produzidos na resposta primária.

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 Como vimos, a unidade básica do anticorpo é constituída
por duas cadeias pesadas e duas cadeias leves idênticas, ligadas
por pontes dissulfito entre as cadeias. Esta unidade básica pode
ser decomposta em pequenas cadeias polipeptídicas. Após
digestão com pepsina, podemos isolar uma molécula conhecida
como F(ab’)2 que ainda era capaz de precipitar antigénios, e desse
modo, conservava as regiões de ligação ao antigénio. O fragmento
pFc’ (que representa a metade C-terminal da região Fc) é formado
e reunido por ligações não covalentes. A ação de outra enzima
proteolítica – a papaína – produzia dois fragmentos Fab
univalentes, que ainda eram capazes de se ligar ao antigénio (Fab
– fragmento de ligação ao antigénio). O fragmento restante não
tinha qualquer afinidade com os antigénios, sendo designado por
Fc (fragmento cristalizável). A utilização destas proteínas permitiu
identificar as funções associadas a cada região da molécula de anticorpo.

As diferentes moléculas de imunoglobulina podem

reconhecer diferentes antigénios, possuindo regiões variáveis
(sequências relativamente curtas que apresentam variação
extrema). Existem três dessas regiões hipervariáveis em cada
cadeia leve e três em cada cadeia pesada e são comumente
designadas por regiões determinantes de complementaridade
(CDR, complementarity determining regions). Estas foram
caracterizadas como estruturas compostas de aminoácidos que
estabelecem contacto com o complexo MHC (major
histocompatibility complex). As regiões framework são sequências
de aminoácidos relativamente conservadas, localizadas nos lados
das regiões hipervariáveis das imunoglobulinas e das regiões
variáveis dos recetores das células T, e que conservam a estrutura
global comum a todos os domínios da região V (variável) do anticorpo. Na imagem, a região framework está representada a rosa (nas
cadeias leves) e a verde (nas cadeias pesadas).

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Anticorpos monoclonais e policlonais

Anticorpos monoclonais ligam-se a um epítopo específico de um antigénio, tendo por isso um alto grau de especificidade.
Estes são produzidos por linfócitos B que foram expostos a um determinado antigénio. Eles podem ser produzidos por técnicas de
cultura de tecidos (ex vivo), começando-se por injetar os antigénios alvo em animais (como o ratinho). Uma vez produzidas as células
B, estas são isoladas e fundidas com células de mieloma, de modo a produzir um anticorpo que consiga produzir mais anticorpos –
hibridomas. Estas células provém todas da mesma linhagem células e ligam-se ao mesmo epítopo específico.

Um anticorpo policlonal refere-se a um anticorpo que normalmente reconhece apenas um único antigénio, mas no qual
vários epítopos diferentes são reconhecidos. Estes anticorpos não têm o mesmo grau de especificidade que os monoclonais.
Anticorpos policlonais são produzidos in vivo injetando no animal um determinado antigénio. Posteriormente, o animal recebe uma
segunda e eventualmente terceira imunização (injetamos mais antigénio) para produzir altos níveis de anticorpos específicos. Após a
imunização, os anticorpos policlonais são obtidos através do soro. Esta solução é purificada de modo que outras proteínas – que não
sejam as imunoglobulinas de interesse – sejam removidas.

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 Ambos estão envolvidos em terapias contra o cancro, doenças inflamatórias. Por exemplo, a herceptina (medicamento
conhecido por Trastuzumab) é um anticorpo monoclonal que se liga à proteína HER2 (presente em doentes com cancro da mama e do
estômago). Outro exemplo é o Adalimumab, um anticorpo monoclonal que se liga à proteína TNF envolvida na inflamação (muito
utilizado no tratamento da doença de Crohn, psoríase e artrite reumatoide).

Quer os anticorpos monoclonais, quer os policlonais,

possuem vantagens e desvantagens, o que os torna úteis para
diferentes aplicações.

Ambos estão também envolvidos na investigação. Eles

podem ser usados na purificação e na deteção de proteínas.
Alguns exemplos destas técnicas são: Imunohistoquímica,
Western blot, ELISA e Imunoprecipitação.

Imunogénio vs Antigénio

Imunogénio é qualquer substância que desencadeia uma

resposta imunitária adaptativa. Embora todos os imunogénios
sejam antigénios, nem todos os antigénios são imunogénios. Isto
porque existem antigénios que não têm a capacidade de induzir
resposta imune inata – por não possuírem PAMPs, por exemplo. Os
haptenos, por exemplo, são moléculas de baixo peso molecular
reconhecidas pelo anticorpo pré-formado, mas que não é
intrinsecamente imunogénica, a não ser que esteja associada a
uma molécula carrier que forneça os epítopos reconhecidos pelas
células T auxiliares. Haptenos são grupos químicos (ex: sulfonato
de m-aminobenzeno). A imunização com hapteno livre não produz
anticorpos contra o hapteno. Contudo, quando estes grupos estão
ligados a um carrier proteico, há produção de anticorpos que
reagem com grande afinidade ao hapteno. Assim, os haptenos
promovem respostas imunitárias quando conjugadas com o
antigénio de interesse.

Antigénios conjugados e adjuvantes

Para tornar um antigénio imunogénico de forma a poder ser usado na produção de anticorpos pode ser necessário conjugá-lo
(entenda-se ligar de forma covalente) com outra entidade molecular, tipicamente de maiores dimensões. Os conjugados mais
frequentes para imunização são proteínas como a albumina do soro bovino e a ovalbumina do ovo. Além da conjugação dos antigénios,
as formulações para imunização podem incluir a adição de outras substâncias para estimular a resposta imunitária.

A técnica convencional de produção de anticorpos contra uma proteína de interesse é a injeção de pequenas amostras da
proteínas num animal como o coelho. No entanto, a administração do antigénio raramente é suficiente para provocar uma resposta
imune vigorosa, mesmo quando o antigénio contém alta proporção de determinantes estranhos. É necessária uma coadministração de
um adjuvante. Um adjuvante é uma substância (sólida, líquida, emulsão ou suspensão de partículas) que ajuda a promover a resposta
imunitária a um antigénio por diferentes mecanismos.

Um papel importante dos adjuvantes é ativar as células dendríticas e outras células apresentadoras de antigénio. Após
contacto com o antigénio, os padrões moleculares associados ao patogénico (PAMPs) vão estimular a maturação das células
dendríticas e o seu deslocamento até aos tecidos linfoides secundários para apresentação de antigénios às células T, que por sua vez,
oferecem às células B a ajuda dependente de células T para switch class, maturação da afinidade e produção ideal de anticorpos. Em
geral, os adjuvantes potentes são preparações brutas de extratos bacterianos que contêm misturas de ligantes do recetor TLR, como o

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LPS ou o peptidoglicano. Em essência, a maioria dos adjuvantes constitui misturas de PAMPs, que ativam as células dendríticas e outras
células do sistema imune inato por meio de seus recetores de reconhecimento de padrão (PRR - Pathogen recognition receptors). Como
as células dendríticas só são capazes de emitir sinais coestimuladores essenciais para as células T se ativadas por intermédio de seus
PRR, os antígenos sem atividade intrínseca de ligação aos PRR não ativam as células dendríticas e, portanto, não provocam fortes
respostas imunes por si sós.

Aplicações de diagnóstico

• Testes rápidos de antigénio

• Ensaios de imunocromatografia (lateral flow assays)
o Também conhecidos por LFT, LFD, LFA, LFIA ou teste rápido.

Um ensaio de fluxo lateral (imunocromatografia) é um dispositivo de diagnóstico simples de usar que auxilia a confirmação da
presença ou ausência de um dado alvo (ex: patogénicos, biomarcadores humanos ou animais, contaminantes de água, alimentos, etc.).
Os LFAs normalmente contêm uma linha de controlo para confirmar que o teste está a funcionar corretamente, juntamente com um ou
mais alvos ou linhas de teste. Este dispositivo utilizar uma membrana de nitrocelulose, nanopartículas coloridas (labels) e tipicamente
anticorpos para produzir resultados.

Quando uma amostra é adicionada, a amostra fluirá ao longo do dispositivo de teste, passando pela membrana de
nitrocelulose e pelo absorvente. O modo como funciona estes testes, designa-se muitas vezes por “ensaio de sanduíche”.

Aplicações terapêuticas

• Anti-toxinas (ex: anticorpos que atuam contra a toxina diftérica).

• Anti-cancro (ex: anticorpos que atuam contra células cancerígenas);

Quando falamos de terapêuticas para doenças como o cancro, uma das mais versáteis é sem dúvida a utilização de anticorpos
monoclonais. O nosso sistema imunitário produz essas células naturalmente, mas nos anos 70, os cientistas perceberam como é que
se podia fazer uma produção em massa destas imunoglobulinas.

As células sofrem mutações, podendo, por vezes, começar a proliferar de forma desregulada, contudo, o nosso sistema
imunitário possui CTLs (linfócitos T citotóxicos, Tc), células que detetam células infetadas ou mutadas. Quando encontra uma destas
células, os CTLs libertam toxinas que provocam a apoptose destas células mutadas. Contudo, este método pode causar, por vezes,
danos nas células que são também saudáveis. Felizmente, os CTLs podem ser inativados por umas moléculas denominadas por PD1.
Este recetor inibitório é expresso em células T ativadas quando a ele se ligam os ligandos PD-L1 ou PD-L2. Muitas células possuem um
counter receptor deste PD-L1, ou seja, os CTLs são inativados e as células cancerígenas continuam a proliferar.

Os anticorpos monoclonais surgem assim como uma ferramentas essenciais. Podem ser utilizados dois tipos: um anticorpo
monoclonal que se liga ao PD-L1 (impedindo que os CTLs sejam inativados), ou anticorpos monoclonais que se liguem ao PD-1
(impedindo que algo inative os CTLs).

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TP2 – Métodos baseados em anticorpos

Existem anticorpos naturais (IgG, IgE, IgD, IgM e IgA), mas podem também ser sintetizados anticorpos artificialmente. Estas
imunoglobulinas, para além de funções diferentes, diferem principalmente no padrão de secreção.

Os anticorpos são moléculas de grande dimensão, por isso, dificilmente atravessam as membranas biológicas ou a barreira
hematoencefálica, etc. Assim, se queremos utilizar anticorpos para detetar certos processos, estas limitações têm de ser
ultrapassadas. Em laboratório podemos modificar a estrutura
dos anticorpos. A parte mais importante da molécula é a
parte variável, pois é ela que confere especificidade. Deste
modo, se modificarmos a sua estrutura podemos diminuir o
seu tamanho (small antibody e nanobody). Estes anticorpos
podem então atravessar estas barreiras, contudo, podem não
ser tão eficientes (afinidade ou especificidade menores).

Conforme o nosso objetivo, podemos remover partes do anticorpo que não sejam necessárias, havendo vantagens e
desvantagens em cada opção. Podemos utilizar e estudar anticorpos de vários animais, contudo, ao introduzirmos estes anticorpos
artificiais em humanos, por exemplo, estamos a provocar uma resposta imunológica ao introduzir uma molécula estranha. Por esse

motivo, a indústria tem desenvolvido sistemas para “humanizar” os anticorpos, introduzindo aminoácidos ou determinando a
sequência homóloga em humanos. As terapêuticas de imunoterapia utilizam muito estes sistemas.

Podemos identificar nos fármacos que tipo de anticorpos

estão a ser utilizados: -omab 100% ratinho, etc. Os mais comuns são os
anticorpos 100% ratinhos. Logicamente, quanto mais humano, menor
será a imunogenicidade.

No entanto, estas técnicas baseadas em anticorpos não são

exclusivamente usadas para o desenvolvimento de terapias. Estes
métodos têm inúmeras aplicações na investigação em Ciência.

Os anticorpos têm inúmeras funcionalidades:

• Deteção (utilizando fluorocromo);

• Purificação;
• Identificar moléculas;

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Anticorpos conjugados

Um anticorpo conjugado pode ser monoclonal ou policlonal que se liga a algo que auxilia na deteção, purificação ou seleção
de proteínas. Podemos conjugar os anticorpos com:

• Fluorescência (deteção): Isotiocianatos fluorescentes (FITC); Isocianato de tetrametilhodamina (TRITC); Cianina (Cy3);
Ficoeritrina (R-PE);
• Coloração (deteção): enzimas colorimétricas como a HRP ou a fosfatase alcalina.
• Metais (deteção): útil na microscopia eletrónica.
• Outros sistemas modulares: biotina-avidina-streptavidina;
• Radioisótopos;

A afinidade de um anticorpo é a
força da interação entre o sítio de ligação de
antigénio num anticorpo e um epítopo de
antigénio. A avidez (também chamada
afinidade funcional) é a força total da interação
entre um anticorpo e múltiplos epítopos. Deste
modo, a avidez é sempre igual ou superior à
afinidade intrínseca. A IgG e a IgM têm uma
maior avidez do que as outras imunoglobulinas.

Existem também anticorpos primários e secundários. Um anticorpo primário liga-se diretamente a um antigénio específico,
enquanto um anticorpo secundário não se liga ao antigénio alvo, antes, liga-se ao anticorpo primário. Os anticorpos primários são
usados para detetar antigénios específicos numa amostra, enquanto os anticorpos secundários são usados para amplificar o sinal
gerado pelo anticorpo primário. Os anticorpos secundários ligam-se à região Fc dos anticorpos primários e podem ser conjugados
com enzimas ou corantes fluorescentes para deteção. Os anticorpos primários podem ser monoclonais (mais frequentemente) ou
policlonais. Contudo, os anticorpos secundários são sempre policlonais. Denote-se que o anticorpo primário e secundário são sempre
feitos em animais diferentes, se o primário for feito, por exemplo, em ratinho, o secundário não pode ser de ratinho, caso contrário, o
anticorpo secundário não vai conseguir ligar-se ao primário (por não reconhecer como estranho).

Imunoprecipitação

Os anticorpos podem ser utilizados para purificar um antigénio numa mistura complexa com outros antigénios, de modo
a estudar a natureza do antigénio e das proteínas que a ele se ligam. Para ilustrar esta técnica vejamos o seguinte exemplo: geramos
um anticorpo monoclonal contra um recetor da superfície celular, como o TLR4, que tem um papel importante no reconhecimento de
componentes patogénicos. Ao imunoprecipitarmos o recetor utilizando o nosso anticorpo monoclonal anti-TLR4 ligados em esferas de
agarose (torna-os mais pesados, logo, mais fáceis de centrifugar) ou magnéticas (usa-se um íman para atrair o precipitado até a uma
zona do cubo). Deste modo, podemos verificar se (eventualmente) alguma proteína se encontrava ligada a este recetor de antigénio.
Procederíamos à lavagem do material para verificar o que tínhamos capturado. No caso de imunoprecipitação apenas do recetor,
veríamos apenas uma banda no gel juntamente com bandas correspondentes ao anticorpo usado para realizar a imunoprecipitação.
Todas as bandas inesperadas são proteínas candidatas à interação do recetor que podemos identificar selecionando uma amostra e
submetendo-a à espectrometria de massa ou análise por sequenciamento de proteínas.

A imunoprecipitação também pode ser usada para verificar se a proteína X se liga à proteína Y mediante coexpressão dessas
proteínas na mesma célula, seguida por imunoprecipitação da proteína X (ou Y), utilizando um anticorpo adequado e visualizando os
resultados num gel SDS-PAGE. Após transferência do gel para um suporte de membrana por Western blotting, é possível colocar
anticorpos contra a proteína Y e verificar se houve coprecipitação com a proteína X. Esta é das técnicas mais utilizadas e também se
designa por Imunoblotting. Em suma, ambas estas técnicas (Imunoprecipitação e Imunoblotting/WB) utilizam anticorpos para detetar

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proteínas específicas, mas diferem: na imunoprecipitação isolamos uma proteína alvo utilizando anticorpos e esferas de agarose,
enquanto que no Imunoblotting utiliza um gel de eletroforese (nem sempre) e sondas de anticorpo para analisar as proteínas.

Imunoblotting

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 A proteína A e a Proteína G são proteínas de origem bacteriana que se ligam a anticorpos de diferentes espécies com grande
afinidade, o que os torna úteis na imunoprecipitação e no immunoblotting. Normalmente o que se faz é, por exemplo, misturar a proteína
G com as esferas onde vamos colocar os nossos anticorpos. A proteína G vai ligar-se sobretudo à região constante do anticorpo.

A imunoprecipitação permite-nos enriquecer ou purificar uma proteína ou complexo de proteínas particular a partir de uma
mistura heterogénea de proteínas ou biomoléculas. No caso do Imunoblotting, podemos separar por tamanhos/cargas e identificar
proteoformas específicas (modificações pós-traducionais, splicing alternativo…).

A imunoprecipitação distingue-se de aglutinação, pois a

imunoprecipitação é uma técnica usada para isolar e purificar proteínas
específicas ou outras moléculas de uma mistura complexa usando anticorpos,
enquanto aglutinação é o processo de agregação de antigénios para os seus
respetivos anticorpos.

Imunoprecipitação da Cromatina (ChIP)

Esta técnica permite analisar o repertório de sequências promotoras génicas (ou outras regiões no DNA) ligadas a um fator
de transcrição ou outra proteína de ligação do DNA em determinada condição experimental.

O método consiste no seguinte: as células são incubadas por um período definido, com ou sem estímulo/tratamento. De
seguida, aplica-se um breve tratamento com um agente químico de ligação cruzada (ex: formaldeído) para garantir que todo o fator de
transcrição ligado a um promotor continue ligado nas condições do ensaio. Depois da ligação química cruzada dos complexos proteína-
DNA, efetua-se a lise celular e há sonicação (aplicação de som) da mistura para fragmentar o DNA de peso molecular muito alto em
fragmentos menores e mais fáceis de controlar. A seguir, utiliza-se um anticorpo específico contra o fator de transcrição de interesse
para imunoprecipitar a proteína de mistura. Graças à etapa da ligação cruzada, o fator de transcrição estará ligado às regiões de DNA
(ex: promotores a que foi ligado). Posteriormente, podemos fazer um PCR a um dado gene que supomos ser regulado pelo fator de

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transcrição. Se o nosso fator de transcrição foi ligado à região promotora de um gene, o fragmento de DNA correspondente será
amplificado ao realizamos o PCR. Assim, podemos, por exemplo comparar a quantidade de DNA amplificado em condições de controlo
e de tratamento para determinar se um tratamento pode promover a ligação do nosso fator de transcrição a promotores génicos
específicos. Esta técnica baseada em anticorpos permite-nos identificar que genes são regulados por um dado fator de
transcrição.

Imunocitoquímica

A Imunocitoquímica (ICC) é uma técnica laboratorial

que utiliza anticorpos para detetar e visualizar a presença de
proteínas ou antigénios específicos nas células. O anticorpo
primário liga-se à proteína ou antigénio de interesse, permitindo
a sua visualização no microscópio de fluorescência. ICC difere
da imunohistoquímica (IHC) na medida em que a ICC analisa
células isoladas, enquanto a IHC analisa secções nos tecidos
biológicos. Assim, podemos identificar a localização subcelular de uma proteína particular.

FACS (Fluorescence-activated cell sorting)

Este método é uma técnica

especializada de citometria de fluxo, que usa
marcadores florescentes para marcar e isolar
grupos celulares. Esta tecnologia separa as
células com base no marcador celular
superficial. Deste modo conseguimos
identificar e isolar diferentes subpopulações
numa mistura complexa de células. Estas
células são cobertas por anticorpos
fluorescentes, podendo ser selecionadas pelo
separador de células ativado por fluorescência
(FACS). Passamos as células num tubo para
serem incitadas por um laser, que consegue
identificar o tipo de célula. Em geral, as células
são coradas com anticorpos contra
determinados marcadores da superfície celular
(ex: CD4 ou CD19), e células positivas e
negativas são separadas em diferentes tubos
no instrumento.

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ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Este método é utilizado deteção ou quantificação de um antigénio, anticorpo ou proteínas (ex: citocinas inflamatórias)
usando um ligando (ex: anti-imunoglobulina) conjugado com uma enzima que altera a cor de um substrato. Este método tem por base
a grande especificidade que existe entre um determinado antigénio e anticorpo. Esta técnica envolve a imobilização do antigénio ou do
anticorpo numa superfície sólida como um microplate. Posteriormente, uma amostra contendo a molécula complementar é adicionada
ao microplate. Se a molécula presente na amostra adicionada ligar-se, ficará imobilizada em conjunto com a outra molécula que já
estava imobilizada no microplate. Esta ligação pode ser detetada usando um anticorpo secundário conjugado com uma enzima que
produz um sinal colorimétrico quando reage com o substrato.

Quando o anticorpo ou o antigénio é marcado com um radioisótopo, poderá ser quantificado por instrumentos que detetam
o decaimento, nesse caso o método tem o nome de Radioimmunoassay (RIA). Contudo, atualmente usa-se mais o ELISA.

Existem 3 tipos de ELISA:

• Direct assay: deteta o antigénio diretamente, sem utilizar um anticorpo secundário.

• Indirect assay: deteta o antigénio indiretamente, ou seja, com a utilização de um anticorpo secundário.
• Capture assay “sandwich”: deteta o antigénio utilizando dois anticorpos que se ligam a diferentes epítopos do mesmo
antigénio.

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TP4 – Técnicas imunológicas em investigação

Métodos para obter populações de linfócitos para estudos funcionais

• Isolamento de leucócitos periféricos no sangue.

• Isolamento de linfócitos de órgãos.
• Purificação de populações específicas de linfócitos por FACS ou por “magnetic-activated cell sorting” (MACS).

Algo que é também muito útil, é detetar anticorpos no sangue para saber a exposição de um indivíduo a determinados
patogénios.

Para obter os leucócitos do sangue

periférico, este tem de ser heparinado por
centrifugação num gradiente de Ficoli – como as
células têm densidades diferentes, vão se
distribuir em zonas diferentes. As células
mononucleares do sangue periférico (PMBCs)
ficam concentradas no limiar central entre o polímero e a fase aquosa. Nestas células mononucleares temos monócitos, células T e
células B.

Existem vários ensaios que se podem fazer com as células que são obtidas no sangue periférico. Os estudos em humanos
são muito informativos mas restringem-se essencialmente ao estudo dos leucócitos e componentes do sangue. Por exemplo, altas
concentrações de IgE indicam alergias, uma vez que a IgE estimula a desgranulação dos mastócitos e basófilos que contêm histamina
que provoca a reação alérgica.

Alguns estudos a nível mais molecular e celular podem ser feitos com uma linha celular denominada por Jurkat (células
cancerígenas). Esta é uma linha tumoral derivada dum paciente com leucemia e é muito usada para estudar mecanismo de ativação
de linfócitos T. São utilizadas porque podem ser geneticamente modificadas e utilizadas para identificar anticorpos/compostos que
interfiram com a ativação do TCR. Por exemplo, na imagem vemos que esta linha celular específica tem um promotor de IL-2 fundido
com o gene da Luciferase. O IL-2 é uma citocina que quando o linfócito é ativado é produzida em grande quantidade. Quando esta célula
for ativada, é possível medir a quantidade de Luciferase produzida. Nas moléculas que inibissem a ativação dos linfócitos T, o sinal da
Lucifrase não existiria. Deste modo podemos estudar o efeito que certas moléculas têm na ativação dos linfócitos T.

Na imagem do lado direito vemos também que podemos fundir a luciferase com o promotor NFAT, que é um fator de
transcrição envolvido na ativação dos linfócitos T. Este sistema foi utilizado para identificar anticorpos que interferem com a ligação
PD-1 com o PD-L1/L2. Esta ligação inibe a ativação da célula T e é uma das razões pelas quais as células cancerígenas não são
eliminadas. Deste modo, uma das terapias mais utilizadas atualmente é a utilização de anticorpos que bloqueiem esta ligação. Caso
um anticorpo se mostrasse inibidor desta ligação, o sinal da luciferase iria aumentar (porque haveria ativação das células T).

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Em animais (murganhos) as possibilidades de estudo são mais diversas

Hibridoma de linfócitos T: Tal como para linfócitos B, é possível isolar os linfócitos T do baço dum
animal imunizado e fundir estas células com as de um linfoma com capacidade proliferativa. As
células têm propriedades híbridas, são ativadas por antigénio e proliferam como as células
cancerígenas. IMPORTANTE: não podem ser utlizadas em ensaios de proliferação ou injetadas em
animais porque podem originar tumores.

Clone de linfócitos T: Permite o estudo de ativação específica por antigénio. No entanto, é

bastante laborioso manter estes clones porque só proliferam na presença do antigénio
apresentado pelo MHC, e IL-2. Este sistema não é muito prático pois temos de ter sempre as
células apresentadoras de antigénio em cultura.

Células obtidas de animais transgénicos para o TCR: A maioria dos linfócitos T nestes animais
expressa um só TCR de especificidade conhecida (p.ex. Ovalbumina). Estas células podem ser
ativadas in vitro ou in vivo com o péptido reconhecido (p.ex. OVA). Permite estudar a resposta de
linfócitos T “naive”.

• Nós podemos depois injetar estas células de especificidade conhecida, como a

ovalbumina, num ratinho. Para ativar estas células seria então necessário colocar estas células em contacto com células
apresentadoras de antigénio que tivessem o péptido da ovalbumina – pois um ratinho normal não possui esta proteína. Para
tal obtiveram as células apresentadoras de antigénio a partir da medula óssea do humano – na medula existem células com a
capacidade de se diferenciarem em qualquer molécula do sistema imunológico. É possível in vitro utilizar fatores de
diferenciação específicos para células apresentadoras de antigénio de modo a obter estas últimas. Posteriormente, injetamos
estas células no animal, provocando resposta inflamatória. O ratinho vai recrutar uma série de linfócitos T específicos para a
ovalbumina. De seguida, para estudar a ativação destas células, podemos retirar uma amostra dos gânglios linfáticos mais
próximos e analisar por citometria de fluxo.

Uma estratégia muito utilizada nesta transferência de células baseia-se no facto de haver estirpes de animais que expressam
uma isoforma CD45.1 ou a isoforma CD45.2. Esta é uma proteína membranar que existe à superfície de todos os leucócitos, mas como
existem duas isoformas podemos utilizar anticorpos distintos para distinguir populações provenientes de animais diferentes.

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Para obtenção duma população específica de linfócitos

Por exemplo, se quisermos isolar uma população específica,

comos as células T reguladoras podemos utilizar com fluorescências
anticorpos específicos para o fator de transcrição FOXP3 ou para a
glicoproteína CD25. Nota: FOXP3 a marcação não é muito viável porque é
intracelular. Como medimos essa fluorescência:

Fluorescence-activated cell sorter (FACS): Permite obter uma população com

um grau de pureza elevado mas, dependendo da frequência das células a
purificar, pode demorar algum tempo (2-4h). De acordo com a fluorescência
é induzida uma carga nas gotículas que permite separá-las quando passam
por estas placas de carga oposta.

• A desvantagem deste aparelho é que demora muitas vezes, então

no final as células podem já não estar muito viáveis. A vantagem é
que em termos de pureza é muito eficiente.
• Esta técnica também pode ser utilizada para isolar células
individuais para análise: “single-cell analysis” → importante na
transcriptomic, metabolomic, proteomic.

Magnetic-activated cell sorting (MACS): Purificação por meio de esferas magnéticas cobertas com
anticorpo. As células que ligam as esferas paramagnéticas são retidas numa coluna quando sujeita a
um campo paramagnético.

• Este método é mais rápido e eficaz que o FACS para separar grandes quantidades de células
mas com menos pureza.
• Esta técnica pode ser utilizada como primeiro passo antes do FACS.
• Quando levamos a suspensão estas esferas, aquelas que são reconhecidas pelo complexo
esfera-anticorpo vão ficar retidas quando se aplica o campo magnético. Passam pela coluna
as que não têm as esferas ligadas:
o Seleção positiva se o anticorpo reconhece o que queremos isolar.
o Seleção negativa se o anticorpo reconhece o que nós não queremos. Esta pode ser
uma vantagem pois as moléculas que isolamos vão ter à sua superfície as esferas
ligadas, o que pode ser incoveniente na experiência que estamos a realizar.

Exemplo: se quisermos isolar as células B que anticorpos podemos utilizar para fazer uma seleção
negativa? Poderíamos utilizar anticorpos que reconhecem CD4 e CD8 de modo a reter as células T,
obtendo uma população mais homogénea em células B.

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Métodos para estudar a resposta de linfócitos T in vitro

Suponhamos que queremos comparar a respostas de linfócitos T entre dois indivíduos. Após colhermos o sangue e
purificarmos a nossa amostra, e depois utilizamos um estímulo. Este não tem de ser específico para o TCR (independente da
especificidade do TCR), mas vai ter em conta a ativação basal que as células T já possuem → vai fazer proliferar mais as células que
são mais ativadas:

Por ativação policlonal: Utilizada para ativar linfócitos T isolados de PBMCs ou de orgãos linfóides de ratinhos (p.ex. baço, gânglios).

Estímulos:

• Concanavalina-A and fitohemaglutinina (PHA): ligam-se a resíduos de açucares na superfície do TCR e CD3.
• Anticorpos: anti-TCR e anti-CD3, ligam-se a regiões conservadas, podem ser utilizados em combinação com anticorpos
contra moléculas co-estimuladoras: anti-CD28 ou anti-CD2. A imobilização do anti-CD3 numa superfície favorece a ativação
dos linfócitos.
• Superantigénios: ativam linfócitos T que expressam TCRs com determinada cadeia β.
• PMA+ ionomicina: mimetizam os sinais que TCR recebe quando reconhece o MHC:péptido, nomeadamente com o aumento
de Ca2+ intracelular.

Este método que vimos permite-nos estudar a ativação das células T, mas não a sua especificidade. Se quisermos estudar
a especificidade temos de imunizar o animal com determinado antigénio. Passados alguns dias é que removemos as células dos
gânglios linfáticos ou do baço. Preparamos células em cultura e administramos os antigénios retirados do soro. No caso abaixo
verificamos que o antigénio A tem maior especificidade, logo maior proliferação.

Esta proliferação pode ser medida de várias maneiras (avaliação da proliferação celular):

• Incorporação de timidina tritiada [3H] no DNA das células em divisão. Essa incorporação faz com que em situações onde
houve muita proliferação, há muita incorporação de timidina que pode ser recolhida das células em filtro com medição da
radioatividade. A desvantagem é a utilização de radioatividade.

• BrdU, um análogo da deoxitimidina, é incorporado no DNA e detetado com um anticorpo. Deste modo conseguimos ver as
células que incorporaram mais BrdU (serão as que proliferaram mais). Se utilizarmos um anticorpo associado a um marcador
florescente podemos medir isto através de citometria de fluxo.

• Iodeto de propídeo , intercala-se na cadeia de DNA e emite fluorescência

que pode ser detetada por citometria de fluxo. Pode também ser utilizado
para estudar a fase do ciclo celular já que a fluorescência vai depender da
quantidade de DNA na célula.

• CFSE (carboxylfluorescein succinimidyl ester): a célula é permeável a

este composto que quando se liga às proteínas citoplasmáticas fica retido
na célula, emite fluorescência mas não é tóxico. Cada vez que a célula se
divide, a fluorescência emitida passa para metade e pode ser medida por

citometria de fluxo.

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 Vejamos o seguinte exemplo: No gráfico mais à
esquerda temos células que não foram incubadas com
nenhum estímulo (controlo negativo), logo, a fluorescência
é máxima. No ensaio do meio e da direita temos a
presença de células estimuladoras. Uma das funções das
células T reguladoras é inibirem a proliferação de células T
efetoras. Em que situação é que as células T reguladoras
fizeram melhor o seu papel – isto é, diminuir a proliferação celular? Nota: as células efetoras é que foram marcadas → No ensaio mais
à direita, onde a proliferação é menor.

No gráfico ao lado vemos a supressão das células T reguladoras

quando são submetidas a diferentes terapias. Uma das terapias revelou melhorar
a ação das células T reguladoras, pois aumentou a sua capacidade de supressão.

A ativação das células T, seja de uma maneira específica ou não

específica, a certo ponto terá de cessar, ou seja, existem mecanismos de regulação para eliminar as células T que já não são
necessárias → apoptose ou morte celular. Durante este processo de morte celular programada, as células ativam uma família de

proteáses, as caspases, expõem à sua superfície fosfatidil serina, e sofrem fragmentação do DNA.

Avaliação da morte celular

• Uma das formas das células entrarem em apoptose é utilizar anticorpos contra a forma ativa da caspase-3. Se o anticorpo
estiver marcado com um fluorocromo podemos medir o processo com citometria de fluxo. Nesse caso, como a caspase atua
intracelularmente, temos de ter um passo de permeabilização da célula.
• Sem permeabilizar as células podemos avaliar a apoptose utilizando anexina V. Este composto liga-se à fosfofatidil serina e
permite ver alterações precoces → quando a célula ativa a morte celular programada uma das primeiras coisas que acontece
é que a fosfatidil serina (normalmente localizada no folheto interno da membrana) passa a estar exposta no folheto externo.
• Outra técnica para avaliar a morte celular é designada de TUNEL: deteta a fragmentação do DNA: a enzima TdT adiciona BrdU
às cadeias fragmentadas que é
reconhecido por anticorpos fluorescentes
(A) ou utilizando dUTP marcado com
biotina (B) que é detetada depois de
incubada com streptavidinaperoxidase, p.
ex. No entanto, este método já só avalia
uma fase muito tardia da apoptose,
contudo, poderá ser o único método
possível de utilizar.

Estes métodos podem ser importantes por exemplo, para detetar se a resposta imunológica está a causar muito dano.

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Avaliação da produção de citocinas

• ELISA: citocinas secretadas pelos linfócitos e detetadas no

meio de cultura de células.
o Esta técnica não dos dá a percentagem de células
que estão a produzir determina citocina.
• ELISPOT: uma modificação do ensaio de ELISA que permite
ter a frequência dos linfócitos T que estão a produzir uma
determinada citocina.
o Formam-se pequenos pontos, pois no poço da
ELISA existe anticorpos que reconhecem a
citocina. No topo, vamos colocar em vez de
sobrenadante, vamos colocar as células pré-
ativadas. Essas células ao secretarem citocinas,
estas vão ser imediatamente detetadas pelo
anticorpo próximo. Se utilizarmos um anticorpo
secundário, vamos obter pequenos pontos que
correspondem a locais onde existe células T a
produzir citocinas.

As células TH1 (linfócitos auxiliares T tipo I) têm como função o controlo de bactérias intracelulares, enquanto as TH2 estão
associadas à produção de anticorpos e anti reações alérgicas (com produção de IFN-ϒ). Se soubermos o perfil de citocinas que são
secretadas pelas células T, conseguimos tentar relacioná-las com um tipo de população de células específico.

Uma técnica que é também utilizada é a marcação intracelular de citocinas e análise por citometria. Para que a produção
de citocinas por células individuais seja possível
de detetar por citometria de fluxo é necessário
impedir a secreção da citocina. Se formos
incubar células com anticorpos contra
determinada citocina, não íamos conseguir nada
porque as citocinas estão no sobrenadante e não
no interior das\ células. Contudo, conseguimos
obter a citocina ao inibirmos a sua secreção
(inibe a passagem do RE para o Golgi,
acumulando no RE).

Este método permite também a

utilização de anticorpos contra
marcadores de superfície, permitindo
por exemplo determinar a frequência de
células CD4+ ou CD8+ com determinado
perfil de citocinas produzidas. Por
exemplo, nestas imagens podemos
retirar que as células que produzem mais
IFN-ϒ são as CD8. Ainda que existam em
menor número, são as que produzem
mais quantidade desta citocina.

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 Para evitar a permeabilização das
células existe outra técnica de captura de
citocinas, que consiste na produção de
anticorpos híbridos. Uma das regiões Fab
liga-se à citocina e a outra região Fab liga-
se a uma proteína da superfície da célula
(ex: MHC classe I, expresso por todas as
células). O anticorpo está ligado à célula,
quando esta é ativada produz a citocina, mas como o anticorpo está à superfície das células consegue captar as citocinas. Depois
utilizando um anticorpo secundário é possível detetar as células que produziram determinada citocina.

Estudo da especificidade dos linfócitos T

Os linfócitos T apenas reconhecem o antigénio ligado ao MHC. A utilização de tetrámeros de MHC-péptido permite
ultrapassar esta limitação para o estudo da especificidade. Esta técnica é utilizada, por exemplo, para estudar a percentagem de células
específicas para um péptido viral no sangue periférico dum indivíduo com HIV.

Estes tetrâmeros não são das técnicas mais baratas, mas há uma empresa que, em vez de
termos de comprar um MHC já com o péptido associado, consegue fornecer kits que já permitem
que o próprio investigador prepare os tetrâmeros com os péptidos que deseja. Isto já é mais
vantajoso, pois conseguimos estudar mais clones específicos para péptidos do patogénio. A
imagem abaixo é um exemplo do estudo da especificidade de células T CD8+ num ratinho infetado
com Plasmodium. Utilizaram-se tetrâmetros com o péptido específico do parasita. Olhando para
aqui podemos dizer onde há mais células CD8+ específicas para este péptido → cérebro de animal
com malária cerebral.

Existe ainda um estudo que se pode fazer

com células T CD8+ que está associado à sua função
(citotóxicos, eliminam vírus e células tumorais) -
Linfócitos TCD8 ativados são capazes de induzir morte
das células que apresentem à superfície o complexo
MHC I-péptido específico. A avaliação da morte das
células alvo pode ser medida por a libertação de
crómio radioativo (51Cr).

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