BC Transdução

Biofísica Celular
Luís Martinho do Rosário

Rosa Maria Santos
dcv/fctuc_2022/23
1
Teóricas: temas principais
> transdução de sinais // lmr

> canais iónicos e excitabilidade celular // rms
> difusão e permeabilidade em membranas // lmr
> transporte activo: bombas e trocadores // lmr
2
TPs: DEBATES
1) Fosfolipases C sensíveis a fosfolípidos de inositol: tudo a ver com PH?

2) GEFs, GAPs e outros interruptores de proteínas G monoméricas
3) Fosfotirosinas em RTKs: vou por aqui, obrigado!
4) “Transceptores” de aminoácidos
5) Vasopressina e aquaporinas: o que corre mal na diabetes insipidus?
6) GLUTs na barreira hemato-encefálica: o cérebro é fisiologicamente euglicémico?
7) Células parietais, bomba de H+ e acidez estomacal
8) FATPs e FAT/CD36: como lidam com os ácidos gordos de cadeia longa?
3
> transdução de sinais
4
Bibliografia sugerida para este tema
● Kramer (2016) ou Gomperts, Kramer & Tatham (2009): capítulos
seleccionados. Ver INDEX. Disponível na biblioteca do DCV
● Nelson & Cox (2013) ou qualquer outro livro de texto

adequado de bioquímica, biologia celular ou biologia molecular: capítulos de
transdução de sinais
● Artigos de revisão sugeridos nas apresentações, cujos links

permitem a consulta online.
A disponibilização destes artigos não deve inibir os estudantes de encontrar fontes

alternativas, fruto de pesquisas activas e estruturadas.
A colecção de artigos inclui artigos da Encyclopedia of Life Sciences (eLS), que têm
acesso livre no campus da UC. Pode ainda usar-se uma ligação VPN à UC (ver
“Bibliografia” no Inforestudante).
5
para começar…
Evans J (2001) Receptor transduction mechanisms. In: eLS
Heldin C-H (2002) Signal transduction: Overview. In: eLS
um apontamento histórico…
Berridge MJ (2005) Unlocking the secrets of cell signaling. Annu. Rev. Physiol. 67: 1-21
e um pouco de food for thought, para agora ou mais

tarde!
Hofer AM & Lefkimmiatis K (2007) Extracellular calcium and cAMP: Second messengers
as “third messengers”? Physiology 22: 320-327
Kiel C et al (2010) Engineering signal transduction pathways. Cell 140: 33-47

(clicar para ler)
6
Moléculas de sinalização extracelular (1)
ou
primeiros
mensageiros
fonte:
Kodis EJ et al (2012) First
messengers. In: eLS
7
Moléculas de sinalização extracelular (2) sinalização celular (link, simples)
sinalização local
autócrina
parácrina (inclui neurotransmissão)
via mediadores químicos locais (inclui

neurotransmissores)
[NTs] típicas ~ células-alvo: vários μM

receptores pós-sinápticos têm afinidade baixa a NTs
sinalização à distância
endócrina
via hormonas
[Hs] típicas ~ células-alvo: pM-nM

receptores têm afinidade muito elevada a Hs 8
? O transporte de um NT ao longo da fenda sináptica ocorre por difusão
simples, demorando < 1 μs (processo muito rápido).
A difusão simples de uma hormona ao longo de vários cm demoraria

anos…
O transporte de uma molécula de hormona requer a corrente sanguínea.
Verifique mais tarde o cálculo dos lapsos de tempo difusionais,

recorrendo a uma expressão simples da teoria da difusão:
<x>2 ≃ 2Dδt
distãncia percorrida coeficiente de lapso de tempo
média difusão difusional
9
As moléculas de NTs têm tipicamente pequenas dimensões, para que os lapsos de

tempo difusionais sejam mais pequenos.
Tipicamente os NTs são aminoácidos ou derivados.

As dimensões moleculares das encefalinas (pequenos péptidos) são um pouco maiores.
Verifique mais tarde que o coeficiente de difusão está relacionado com o raio da molécula
hidratada através da equação de Stokes-Einstein.
10
a hormona insulina (estrutura cristalina)
O transporte de Hs pela circulação sanguínea não é

afectado pelo coeficiente de difusão.
As moléculas de Hs podem portanto ter dimensões muito

diferentes. Podem ser
esteróides, derivados de aminoácidos,

pequenos péptidos ou proteínas.
fonte:
Mayer JP (2007) Insulin structure and function.
Biopolymers 88: 687-713
11
ligandos hidrossolúveis ↔ RECEPTORES DA MEMBRANA PLASMÁTICA
(en: membrane receptors ou cell-surface receptors)
MAIORIA das hormonas e

mediadores químicos locais
TODOS os neurotransmissores
segundos mensageiros
Newton AC et al (2016) Second messengers.

Cold Spring Harb Perspect Biol 8(8)
12
ligandos lipossolúveis ↔ RECEPTORES INTRACELULARES
(en: intracellular receptors)
Hormonas esteróides
regulação da
transcrição
de genes As hormonas da tiróide também interagem com Rs intracelulares, mas o
seu transporte transmembranar ocorre por difusão facilitada
13
testosterona
adrenalina
Menos polar
Mais lipofílica
Elevado momento dipolar permanente

Muito polar colesterol
Muito hidrofílica
Reduzido coeficiente de partição e reduzido
coeficiente de permeabilidade membranar
(mais tarde) núcleo esteróide
14
Receptores membranares (1)
> receptores ionotrópicos
(en: ionotropic receptors ou ligand-gated ion channels)
Integram um canal iónico, aberto por ligação do agonista.
Sinalizam por fluxos iónicos.
> receptores metabotrópicos

(en: metabotropic receptors)
>> receptores acoplados a proteínas G / GPCRs

ou receptores com sete segmentos transmembranares / 7-TMS
(en: G-protein coupled Rs ou 7-TransmeMbrane Segment receptors)
>> receptores catalíticos ou receptores com um único

segmento transmembranar
(en: catalytic receptors ou single-pass receptors)
Não contêm um poro permeável a iões.

Sinalizam por modulação directa da actividade de proteínas.
15
Fonte:
Receptores membranares (2) Nasiripourdori A (2011) From toxins targeting ligand gated ion
channels to therapeutic molecules. Toxins 3: 260-293
receptores ionotrópicos
poro
comporta
(gate)
receptor de acetilcolina tipo nicotínico receptor de glutamato tipo NMDA

(pentamérico) (tetramérico)
16
Receptores membranares (3)
receptores ionotrópicos Na+
superfamílias (Ca2+)
tipo colinérgico
nAChR (acetilcolina)
5-HT3 (serotonina)
GABA-A (ácido gama-aminobutírico)
GlyR (glicina) Cl-
tipo glutamatérgico Ca2+ (Na )+
N-metil-D-aspartato = NMDA (glutamato)

AMPA / Kainate (glutamato)
nAChR
tipo purinérgico
P2X (ATP extracelular)
entrada Na+ ⇒ ΔΨ ⇒ ⨁VSCC ⇒ ↑Ca2+
17
Receptores catalíticos: RTKs (1)
receptores com actividade de tirosina cinase / RTKs
(en: Receptor Tyrosine Kinases)
Segmento transmembranar único.

Domínio intracelular catalítico:
tirosina cinase.
Exs:
Receptor de factor de crescimento da

Epiderme / EGFR
(en: Epidermal Growth Factor Receptor)
Receptor de insulina / InsR

(en: Insulin Receptor)
Fonte:
Du Z & Loly CM (2018) Mechanisms of receptor
O InsR inactivo é um homodímero resultante
tyrosine kinase activation in cancer. de ligações dissulfeto entre os domínios
Mol. Cancer 17:58 extracelulares.
18
Como funciona uma reacção de fosforilação catalisada por uma
? proteína-cinase?
Transferência de um grupo fosforilo para um resíduo de serina,

treonina ou tirosina (eucariotas).
Tirosina cinase → fosfotirosinas.
19
Activação por dimerização,
após ligação do ligando.
Autofosforilação por
transfosforilação com
formação de fosfotirosinas
nos domínios catalíticos.
Dupla função da
autofosforilação:
> fosfotirosinas constituem locais de ancoragem para proteínas
> tirosina cinase do receptor fica cataliticamente competente para fosforilar

enzimas efectoras ancoradas ou proteínas ancoradas sem actividade
catalítica - proteínas adaptadoras 20
Fonte:
Schlessinger J (2000) Cell signaling by receptor-tyrosine
kinases. Cell 103: 211-225
Algumas enzimas efectoras são activadas ligando
directamente as fosfotirosinas do RTK através de
domínios PTB (en: Phosphotyrosine Binding)

ou
domínios SH2 (en: Src-Homology type 2).
Outras são activadas ligando as fosfotirosinas de proteínas

adaptadoras através de domínios PTB ou SH2.
Exemplo de proteína adaptadora fosforilada por um

RTK (InsR):
substrato do receptor de insulina / IRS
(en: Insulin Receptor Substrate)
Brummer T et al (2010) Docking proteins.
FEBS J. 277: 4356-4369 21
Fonte:
Lemmon MA & Schlessinger J (2010) Cell signaling
by receptor-tyrosine kinases. Cell 141: 1117-1134
❚ RTKs activados
❚ proteínas adaptadoras
❚ domínios PTB e SH2
❚ domínios envolvidos na ligação a membranas
❚ domínios envolvidos na interacção com outras
proteínas
geram
extensas plataformas ou complexos de

sinalização com pontos de ramificação.
22
Curiosidade sobre domínios PTB e SH2?
Wagner MJ et al (2013) Molecular mechanisms of SH2- and PTB-domain-containing proteins in

receptor tyrosine kinase signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol 5(12): a008987
23
Sinalização por insulina e IGF-1 (1)
fonte:
Najjar S (2001) Insulin action:
Molecular basis of diabetes. In:
estimulação de
eLS
processos anabólicos
> tomada de glicose e síntese de glicogénio

(glicogénese)
> tomada e síntese de ácidos gordos,
triacilglicerois (lipogénese)
> tomada de aminoácidos e síntese de proteínas
> síntese de DNA
e ainda
(-) glicogenólise / (-) gluconeogénese /

(-) lipólise / (-) proteólise
estimulação do crescimento /
mitogénese via transcrição e
expressão de genes específicos do ciclo 2 vias principais, partilhadas com a acção
celular / diferenciação do factor de crescimento tipo-insulina tipo 1 /
IGF-1 (Insulin-like Growth Factor type 1) via IGF-1R 24
regulação metabólica
via IRS- PI3K-
PKB/Akt
fonte:
Haeusler RA et al (2018) Biochemical and cellular properties of insulin
receptor signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 19: 31-44
(artigo disponibilizado a pedido) 25
De facto, ninguém acusou a transdução pelo receptor
de insulina de ser uma ciência trivial…
Ver também a figura 1 em Haeusler RA et al (2018)
26
27
fonte:
1- Ligação de insulina a um receptor de Hakuno F & Takahashi S-I (2018) IGF1 receptor
signaling pathways. J. Mol. Endocrinol. 61: T69-T86
insulina / InsR (ou a um IGFR).
Os InsRs são expressos por quase todos os tipos

celulares, com destaque para as células do
músculo esquelético, músculo cardíaco, tecido
adiposo e fígado.
Há 2 isoformas do InsR (InsR-A e InsR-B),

geradas por splicing alternativo do exão 11 do seu
mRNA. Dá-se ênfase aqui a InsR-B, a isoforma
mais expressa no fígado.
2/3- Dimerização das subunidades catalíticas e

transfosforilação em resíduos de tirosina.
28
4- Algumas fosfotirosinas servem de locais de ancoragem ao substrato do receptor de insulina /
IRS através de domínios PTB.
As isoformas de IRS mais relevantes funcionalmente são IRS-1 e IRS-2. IRS1/2 sofrem translocação
para o receptor e para a membrana, a cujos fosfolípidos se ligam via domínios PH (ver à frente).
5/6- Fosforilação de IRS1/2 pelo InsR em resíduos de tirosina. As fosfotirosinas de IRS1/2 são
reconhecidas pelos domínios SH2 da subunidade reguladora (85 kDa, p85) da
fosfatidilinositol 3-cinase tipo Ia / PI3K-Ia (Phosphatidylinositol 3-Kinase or Phosphoinositide
3-Kinase type Ia ), activando a sua subunidade catalítica (p110) e posicionando PI3K-Ia junto à
membrana.
fonte:
Engelman JA et al (2006) The evolution of phosphatidylinositol 3-kinases as regulators of growth
and metabolism. Nat. Rev. Genet. 7: 606-619
29
(artigo disponibilizado a pedido)
fosfatidilinositol 3-cinase tipo Ia (PI3K-Ia)
7- PI3K-Ia pode agora fosforilar
fosfolípidos de inositol na
membrana.
3 Tipos de PI3Ks.
PI3Ks (tipo I) fosforilam PI, PI(4)P e PI(4,5)P2 a PI(3)P,

PI(3,4)P2 e PI(3,4,5)P3, respectivamente.
Fosfolípidos de inositol com grupos fosfato na posição

3’ do núcleo de inositol não são substratos de
PI3K-Ia fosfolipases C (PLCs) - ver à frente.
30
proteína cinase B (PKB/Akt)
Colocalização de PDK-1 (3-Phosphoinositide-Dependent Protein
Kinase-1) e proteína cinase B / PKB (Protein Kinase B) em domínios
membranares ricos em PI(3,4,5)P3.
Ligação de PDK-1 e PKB/Akt à membrana via domínios PH

(Pleckstrin Homology). Noutras proteínas só uma minoria de
domínios PH liga especificamente fosfolípidos de inositol - ver à
frente.
PDK-1 fosforila e activa PKB/Akt.
PKB/Akt fosforila e regula numerosas proteínas, sendo

responsável pela especialização metabólica do eixo IRS-PI3K-
PKB/Akt.
PDK-1 e PKB/Akt fosforilam proteínas em resíduos de

serina/treonina. Pertencem à família AGC de proteínas cinase,
que incluem PKA, PKG e PKC. 31
Mais sobre a PKB/Akt...
Manning BD & Toker A (2017) AKT/PKB signaling:

Navigating the network. Cell 169: 381-405
32
… e um pouco sobre “resistência à insulina”?
Boucher J et al (2014) Insulin receptor signaling in Guo S (2014) Insulin signaling, resistance, and the
normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb. metabolic syndrome: Insights from mouse models to
Perspect. Biol. 6:a009191 disease mechanisms. J. Endocrinol. 260: T1-T23 33
fonte:
Haeusler RA et al (2018) Biochemical and cellular properties of insulin regulação da glicogénese
regulação por GLICOGÉNIO SINTASE
CINASE tipo 3 (GSK-3)
35
**
regulação da
tomada de glicose
(GLUT4)
fonte:
Haeusler RA et al (2018) Biochemical and cellular properties of insulin
** a abordagem deste material exige a
discussão prévia de proteínas G monoméricas
**
“Compartimento” de reciclagem.
Reciclagem de GLUT4 -
endocitose e exocitose constitutiva.
“Compartimento” de
armazenamento.
Exocitose regulada das vesículas de

armazenamento de GLUT4 / GSVs
(GLUT4 Storage Vesicles)
budding (brotamento do Golgi trans)

transport (transporte ao longo do
citoesqueleto)
tethering (confinamento em redes de
fonte:
actina)
Bogan JS (2012) Regulation of glucose docking (ancoramento à membrana)
transporter translocation in health and
diabetes. Annu. Rev. Biochem. 81: 507-532 fusion (fusão com a membrana)
39
fonte:
** Watson RT & Pessin JE (2006) Bridging the GAP
between insulin signaling and GLUT4 translocation.
Trends Biochem. Sci. 31: 215-222
GSVs são vesículas
diferenciadas: não contêm
marcadores moleculares de
endossomos.
Em repouso (ausência de
estimulação por insulina) as GSVs
localizam-se principalmente na
região perinuclear.
Estão ainda dispersas pelo

citoplasma, em associação com
microtúbulos.
40
** Jaldin-Fincati JR et al (2017) Update on GLUT4 vesicle
traffic: A cornerstone of insulin action. Trends
Mafakheri S et al (2018) Regulation of RabGAPs
involved in insulin action. Biochem. Soc. Trans. 46: 683-
Endocrinol. Metab. 28: 597-611 690
fonte:
Tatulian A. (2015) Tunduguru R & Thurmond DC (2017) Promoting glucose
transporter-4 vesicle trafficking along cytoskeletal tracks:
PAK-ing them out. Front. Endocrinol. 8: 329
A translocação de GLUT4
para a membrana é controlada
pelo eixo de sinalização IRS-
PI3K-PKB/Akt, que controla
as várias funções metabólicas
do InsR.
Quais as proteínas efectoras

de PKB relacionadas com a
translocação de GLUT4?
41
**
fonte:
Leto D & Saltiel AR (2012) Regulation of Em repouso: Inibição da translocação de GLUT4 pela
glucose transport by insulin: control by forma inactiva de proteínas G monoméricas da família
GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13: 383-396
Rab associadas a GSVs, controladas por proteínas
Rab-GAP constitucionalmente activas.
Rab-GAP principal: TBC1D4 ou AS160 (Akt Substrate of

160 KDa).
Estimulação por insulina: Remoção da inibição

por PKB/Akt2 via fosforilação dos Rab-GAPs.
Controlo por Rab/GTP de (i) proteínas

motoras de microtúbulos e filamentos de
actina, responsáveis pelo transporte de GSVs;
fonte:
(ii) outras proteínas de ligação GSV -
Haeusler RA et al (2018) citoesqueleto.
Miócitos: Rab8a, Rab13

Adipócitos: Rab10
42
fonte:
** Klip A et al (2014) Signal transduction meets vesicle traffic: ramificação do eixo de sinalização em PI3K
the software and hardware of GLUT4 translocation. Am. J.
Physiol. Cell Physiol. 306: C879-C886
Detalhe evidenciando a activação de MyoVa (miosina

Va), activada por Rab8a/GTP em miócitos do músculo
esquelético (e por Rab10/GTP em adipócitos).
Miosinas (myosins) e cinesinas (kinesins) são proteínas

motoras responsáveis pela mobilidade baseada em filamentos
de actina e pelo transporte anterógrado ao longo de
microtúbulos, respectivamente. Ambas têm actividade de
ATPase, que fornece a energia de Gibbs necessária para o
deslocamento.
Activação de proteínas G da família Rho (Rac1 em

miócitos) e regulação do ciclo de polimerização-
despolimerização de actina.
Juntamente com a via PKB/AS160/Rab, o ciclo de

remodelação de actina é fundamental para o
processo de translocação de GLUT4 para a
membrana.
43
a abordagem deste material exige a
fonte: discussão prévia de proteínas G monoméricas
Tatulian A (2015) Structural dynamics of
insulin receptor and transmembrane
signaling. Biochemistry 54: 5523-5532
estimulação do crescimento
via Ras-MAPK
Grb2 reconhece fosfotirosinas

em proteínas-substrato do
InsR (IRS1/2 e Shc) via
domínios SH2.
A sinalização a jusante é
idêntica à que será discutida
para o EGFR (à frente).
44
GPCRs e proteínas G heterotriméricas (1)
receptores acoplados a proteínas G (GPCRs)
> 1000-1400 membros (vertebrados)
> reconhecimento de odores e feromonas:

500-1000
> mais do que 1-3% dos genomas
domínio extracelular N-terminal

domínio intracelular C- terminal
(liga uma proteína G heterotrimérica)
7 segmentos transmembranares de α-hélices

fonte:
Bockaert J (2014) G-protein coupled receptors. In: eLS. 45
fonte:
McMullen TP et al (2018) GPCR signal transduction:
Evolution by gene duplication. In: eLS
GPCRs podem ser
- homodímeros (ex: mGluRs)

- heterodímeros (ex: receptores GABAB)
46
proteínas G heterotriméricas
guanosina trifosfato (GTP)
3 subunidades
■ Gα (17 genes) ligam nucleótidos de guanina
■ Gβ (5 genes) GTP e GDP
■ Gγ (14 genes)
47
Activadas pela alteração conformacional do

receptor - o GEF para proteínas G heterotriméricas.
Inactivadas pela actividade de GTPase de

Gα/GTP.
Esta actividade é promovida por “reguladores da

sinalização por proteínas G” (RGSs) - GAPs para
proteínas G heterotriméricas.
Ver proteínas G monoméricas à frente.
actividade de GTPase de Gα/GTP
Willardson BM & Tensmeyer NC (2017) G proteins.

In: eLS 48
Curiosidade sobre RGSs?
Kimple AJ et al (2011) Regulators of G-protein signaling and their Gα substrates: Promises and
challenges in their use as drug discovery targets. Pharmacol. Rev. 63: 728-749
49
o ciclo das proteínas G heterotriméricas
50
4 famílias, determinadas
pela natureza de Gα
■ αs
■ αi/o
■ αq/11
■ α12
fonte:
Bockaert J (2014) G-protein coupled receptors. In: eLS.
51
Proteínas G monoméricas (1)
proteínas G monoméricas
ou “proteínas G pequenas” ou “GTPases” ou “proteínas G tipo Ras”
(en: small G proteins ou GTPases ou Ras-type G proteins)
superfamília ~ 150 membros

pequenas, 20-25 kDa
5 subfamílias
■ Ras (Rat sarcoma)
■ Rac/Rho Csépányi-Kömi R (2012) Small G proteins and their
■ Rab regulators in cellular signalling. Mol. Cell. Endocrinol.
■ Arf 353: 10-20
■ Ran
52
fonte:
Proteínas G monoméricas (2) Kosloff M & Selinger Z (2001) Substrate assisted catalysis -
application to G proteins. Trends Biochem. Sci. 26: 161-166
■ factores de troca de nucleótidos de

guanina (GEFs)
(en: Guanine Nucleotide Exchange Factors)
Promovem a dissociação de GDP e a ligação de

GTP. G/GTP - forma activa - liga a enzima
efectora.
Exemplos mais à frente.
■ proteínas activadoras da GTPase

(GAPs)
(en: GTPase Activating Proteins)
Estimulam a actividade de GTPase de G/GTP.

G/GDP - forma inactiva - dissocia-se da enzima
GEFs e GAPs: “interruptores” moleculares de Efectora.
proteínas G monoméricas Exemplos mais à frente.
53
Curiosidade sobre GEFs e GAPs?
? Bos JL et al (2007) GEFs and GAPs:

Critical elements in the control of small G
proteins. Cell 129: 865-877
fonte:
Sprang S (2001) GEFs: Master regulators of G-protein
activation. Trends Biochem. Sci. 26: 266-267
54
Proteínas G monoméricas (3) Grb2 (Growth factor receptor-bound 2):
proteína adaptadora
Sos (Son of sevenless)

um Ras-GEF
Ras: uma proteína G monomérica
Raf (Rapidly accelerated fibrosarcoma)

ou MAP3K cinase serina/treonina (fosforila MEK)
via Ras-MAPK MEK (MAP and ERK Kinase)

ou MAP2K
cinase tirosina/serina (fosforila ERK)
ou MAPK
MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) ou
fonte: ERK (Extracellular Signal-Regulated Kinase)
Csépányi-Kömi R (2012) Small G proteins and their regulators in cinase serina/treonina
cellular signalling. Mol. Cell. Endocrinol. 353: 10-20 55
complexo
RTK – Grb2 – Sos - Ras
Grb2 reconhece fosfotirosinas no EGFR

através de domínios SH2.
Grb2 reconhece Sos através de domínios

SH3 (o domínio SH3 N-terminal liga regiões
ricas em prolina).
Os domínios SH3 têm um papel importante

em interacções proteína-proteína.
56
Sos actua como Ras-GEF. cascata de cinases

Raf – MEK - MAPK
Sos interactua com Ras através dos
domínios REM (Ras Exchange Motif,
estabiliza a ligação) e CDC25H (CDC25
Homology, catalítico).
fonte:
Rojas JM (2011) Mammalian son of sevenless guanine
nucleotide exchange factors: Old concepts and new
perspectives. Genes & Cancer 2: 298-305. 57
Sinalização por AMP cíclico (1)
GPCR (ou receptor 7-TMS)
proteína G
heterotrimérica
enzima efectora
segundos mensageiros
outras proteínas
respostas celulares
58
produção e terminação do sinal
terminação
(degradação)
produção
(síntese)
adenilil ciclases / ACs

AMP cíclico (Adenylyl Cyclases ou Adenylate Cyclases)
ou adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico / cAMP
(3’,5’-cyclic Adenosine Monophosphate) fosfodiesterases de nucleótidos
cíclicos / PDEs (cyclic nucleotide
Phosphodiesterases) 59
mecanismo catalítico da ciclização em ACs classe III
(AC1-10 em mamíferos)
fonte:
Steegborn C (2014) Structure, mechanism, and regulation of
soluble adenylyl cyclases - similarities and differences to
transmembrane adenylyl cyclases. Biochim. Biophys. Acta
1842: 2535-2547
60
adenilil ciclases transmembranares (tmACs)
tmACs (AC1-9 em mamíferos) são

activadas directamente pela
proteína G estimuladora / Gs
(stimulatory G protein) - Gαsβγ.
Algumas tmACs são inibidas directamente

por proteínas G da família αi, incluindo a
proteína G inibidora / Gi (inhibitory
G protein) - Gαiβγ.
Algumas tmACs são reguladas por Ca2+,

cinases (fosforilação) e Gβγ.
fonte: AC10: AC “solúvel” ou sAC, localizada no

Halls ML & Cooper DMF (2017) Adenylyl cyclase signalling citoplasma e núcleo.
complexes - pharmacological challenges and opportunities.
61
Pharmacol. Ther. 172: 171-180
tmACs versus sAC sAC é directamente activada por
HCO3- e Ca2+. É a única proteína de
? sinalização directamente regulada por

bicarbonato.
sAC é insensivel a Gs.
sAC não é sensível ao alcalóide

forskolina (forskolin), que activa
tmACs1-8 mesmo na ausência do
receptor.
sAC funciona como sensor de ATP,

Ca2+ e HCO3-/CO2/pH, integrando
sinais intracelulares. Actua em
fonte: diferentes loci do citoplasma
Kamenetsky M et al (2006) Molecular details
of cAMP generation in mammalian cells: A
(incluindo mitocôndrias) e no núcleo .
tale of two systems. J. Mol. Biol. 362: 623-
639 Wiggins SV et al (2018) Pharmacological forskolina
modulation of the CO2/HCO3-/pH-, calcium-,
and ATP-sensing soluble adenylyl cyclase.
Pharmacol. Ther. 190: 173-186 62
Sinalização por AMP cíclico (5) Proteína G estimuladora / Gs
Sensível à toxina da cólera (CT), uma

enterotoxina produzida pela bactéria Vibrio cholerae.
CT reage covalentemente com Gαs (ADP-ribosilação)

nas células do epitélio intestinal, inibindo a actividade
de GTPase de Gαs/GTP.
pmAC activa na ausência de estimulação hormonal.

Aumento anormal de cAMP intracelular. Perda massiva
de electrólitos e fluidos para o lúmen intestinal
(diarreia).
Proteína G inibidora / Gi
Sensível à toxina pertussis (PT), produzida por Bordetella pertussis. Induz a acumulação de
muco nos alvéolos broncopulmonares e a tosse convulsa.
PT reage covalentemente com Gαi (ADP-ribosilação), impedindo a dissociação de GDP de

Gαi/GDP, a activação de Gαi e a inibição de pmACs.
63
AC6 e o canal aniónico CFTR: parceiros da toxina da
? cólera
ver highlight do editor
Thomas A et al (2018) AC6 is the major adenylate cyclase forming

a diarrheagenic protein complex with cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator in cholera. J. Biol. Chem. 293: 12949-12959
64
acções opostas de Gs e Gi explorar aqui
65
alvos celulares de cAMP ▍Proteína cinase dependente de
cAMP ou proteína cinase A / PKA
(Protein Kinase A)
▍Canais iónicos regulados por

nucleótidos cíclicos: CNGCs
e canais HCN
▍Fosfodiesterases de nuceótidos
cíclicos / PDEs (cyclic nucleotide
Phosphodiesterases)
▍Proteínas de troca activadas

directamente por cAMP / EPACs
(Exchange Proteins Directly Activated by
cAMP)
AKAPs: proteínas de ancoragem de PKA (A-Kinase

Newton AC et al (2016) Second messengers.
Anchoring Proteins)
Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 8(8). pii:
a005926
66
Curiosidade sobre AKAPs?
?
Proteínas scaffold. Ligam e organizam PKA e
outros elementos do sistema de sinalização
de cAMP, incluindo ACs, PDEs, EPACs e
proteínas-alvo de PKA.
Medeiam a formação de extensos complexos,

gerando microdomínios de sinalização e
fonte:
conferindo especificidade na transdução por Torres-Queseda O et al (2017) The many faces of
cAMP. compartmentalized PKA signalosomes. Cell. Signal. 37: 1-11
67
Sinalização por AMP cíclico (8) Tetrâmero composto por 2 subunidades
reguladoras e 2 subunidades catalíticas
proteína cinase A (PKA) (R2C2, inactivo).
Ligação de cAMP ao domínio de ligação de

nucleótidos cíclicos / domínio CNB (Cyclic
Nucleotide Binding) das sub. R causa a
dissociação das sub. C, desreprimindo os
locais catalíticos e activando-as.
PKA-C fosforila proteínas-alvo em resíduos

de serina/treonina. Fosforilação ocorre em
múltiplos loci da membrana, citoplasma e
núcleo.
No núcleo PKA-C regula a transcrição de

genes por fosforilação de factores de
transcrição (ex: proteína CREB, cAMP-
Response Element Binding).
Sassone-Corsi P (2012) The cyclic AMP

pathway. Cold Spring Harbor Perspect. Biol.
4(12). pii: a011148 68
Sinalização por AMP cíclico (9) Glicogénio fosforilase / GP (Glycogen
Phosphorylase) catalisa a fosforólise de glicogénio,
produzindo glicose-1-fosfato. G1P é isomerizado a
exemplo de acção de PKA G6P, que é desfosforilado a glicose (estado pós-
absortivo, fígado).
GP é activada por fosforilação mediada por

glicogénio fosforilase cinase. Esta, por sua vez, é
activada por fosforilação mediada por PKA.
As cascatas de cinases são frequentes em

processos de transdução, proporcionando uma
ampla amplificação de sinais. Ver via Ras-MAPK
atrás.
GPCRs: receptor de glucagina (glucagon) e

receptores adrenérgicos β / β-AR (β adrenergic
receptors, β- adrenoreceptors ou β-adrenoceptors),
fosforólise de glicogénio activados por catecolaminas. Acoplados a pmACs
e produção de glicose via Gs.
(fígado)
69
proteínas de troca activadas directamente por cAMP (EPACs)
EPACs ligam cAMP em domínios CNB,

removendo a autoinibição do domínio CDC25H,
que aceita Rap1 ou Rap2 como substrato. Ver
os domínios de Sos atrás.
A forma activa cAMP/EPAC actua como Rap-

GEF, promovendo a troca de GDP por GTP.
As EPACs são exemplos de GEFs activados por

ligação directa de segundos mensageiros.
Os diferentes GEFs são activados por

mecanismos muito diversos. Por exemplo, o
Ras-GEF Sos pode ser activado por ligação a
um RTK através de proteínas adaptadoras (ver
fonte: atrás).
Bos JL (2006) Epac proteins:
multi-purpose cAMP targets. Trends
Biochem. Sci. 31: 680-686 70
fonte:
Gloerich M & Bos JL (2010) Epac: Defining a new
mechanism for cAMP action. Annu. Rev. Pharmacol.
Toxicol. 50: 355-375
Schmidt M et al (2013) Exchange protein directly

activated by cAMP: A multidomain cAMP
mediator in the regulation of diverse biological
functions. Pharmacol. Rev. 65: 670-709
Robichaux WG 3rd et al (2018) Intracellular

cAMP sensor EPAC: Physiology,
pathophysiology, and therapeutics development.
Physiol. Rev. 98: 919-1053
71
Um importante “módulo de sinalização” de Ca2+?
? cAMP ¦ EPAC ¦ Rap ¦ PLCε ¦ PKCε ¦

CaMK
fonte:
Smrcka AV et al (2012) Role of phospholipase Cε in physiological
phosphoinositide signaling networks. Cell Signal. 24: 1333-1343
antevisão
PLC - fosfolipase C sensível a fosfolípidos de inositol
PKC - proteína cinase C
CaMK - proteína cinase dependente de Ca2+/ calmodulina
fonte:
72
Gloerich M & Bos JL (2010)
Sinalização por fosfolípidos de inositol (1)
fosfolipases Fosfolipases A1, A2 / PLA1, PLA2
(Phospholipases A1, Phospholipases A2)
Hidrolisam ligações acil éster em sn-1 ou sn-2,

produzindo lisofosfolípidos e ácidos gordos livres
(PLA2: ácido araquidónico).
Fosfolipases D / PLD
(Phospholipases D)
Hidrolisam a ligação fosfoéster no lado da “cabeça”

polar, produzindo ácido fosfatídico.
fonte:
Vines CM & Bill CA (2015) Phospholipases. In: eLS ácido fosfatídico
73
ácido
araquidónico
mio-inositol
fonte:
Newton et al (2016) Second messengers. Cold Spring Harb
Perspect Biol doi: 10.1101/cshperspect.a005926
Fosfolipases C / PLC
(Phospholipases C)
Hidrolisam a ligação fosfoéster no lado oposto à “cabeça” polar, produzindo 1,2-diacilglicerol (diacylglycerol / DAG).
Para além de DAGs, as PLCs sensíveis a fosfolípidos de inositol (PI-PLC ou simplesmente PLC) produzem inositol
1,4,5-trifosfato, Ins(1,4,5)P3. Utilizam maioritariamente fosfatidilinositol 4,5-bifosfato - PI(4,5)P2 - como substrato. 74
75
fosfolipases C sensíveis a fosfolípidos de inositol
6 subfamílias, pelo menos 13 membros

Regiões mais conservadas:
> Domínios X, Y - o núcleo catalítico das PLCs, altamente

conservado.
> Domínios PH - ligam PI(4,5)P2 com elevada afinidade e
especificidade na PLCδ. Podem mediar interacções proteina -
proteína.
> Domínios C2 - Contrariamente a cPKC (ver à frente),
geralmente não conferem sensibilidade a Ca2+. Podem mediar a
interacção com membranas.
> Mãos EF (EF hands) - scaffolds intramoleculares.
Contrariamente a calmodulina (ver à frente), não conferem
sensibilidade a Ca2+.
Cocco L et al (2015) Phosphoinositide-specific phospholipase C in health

and disease. J. Lipid Res. 56: 1853-1860
76
Curiosidade sobre domínios PH e C2 em PLCs?
?
Corbalan-Garcia S & Gómez-Fernández JC (2014)
Signaling through C2 domains: More than one lipid
target. Biochim. Biophys. Acta 1838: 1536-1547
Lemmon MA (2007) Pleckstrin homology (PH)

domains and phosphoinositides. Biochem. Soc.
Symp. 74: 81-93
77
Sinalização por fosfolípidos de inositol (5) Nakamura Y & Fukami K (2017) Regulation and
physiological functions of mammalian
phospholipase C. J. Biochem. 161: 315-321
PLCγ
Activada por RTKs (ex: EGFR) após
reconhecimento de fosfotirosinas via
domínios SH2 e fosforilação.
PLCε
PLCβ Domínios de associação a Ras e Rap (RA)
ligam Ras/GTP e Rap/GTP, activando PLCε.
Activada por GPCRs via Gq. Exemplos: receptor colinérgico
tipo muscarínico / mAChR, receptor adrenérgico α1 / α1-AR,
receptor glutamatérgico metabotrópico.
Activação por Gq requer domínios C-terminais específicos.

78
Proteína cinase C / PKC
(Protein kinase C)
3 subfamílias, pelo menos

10 membros
> cPKC (“convencionais”)
domínio C2 - liga Ca2+
domínio C1 - liga DAGs
> nPKC (“novas”)

domínio C2 alternativo - não liga Ca2+
Lipp P & Reither G (2011) Protein kinase C: > aPKC (“atípicas”)

The “masters” of calcium and lipid, Cold Spring
domínio C2 ausente
Harb Perspect Biol doi: 10.1101/cshperspect.a004556
domínio C1 atípico - não liga DAGs
Steinberg SF (2008) Structural basis of protein
kinase C isoform function. Physiol. Rev. 88: 1341-1378
79
cPKC / translocação e activação Activação de certos GPCRs e RTKs conduz à
activação de PLCβ e PLCγ, causando a hidrólise
de PI(4,5)P2 em DAGs e Ins(1,4,5)P3.
Ins(1,4,5)P3 é muito polar e hidrofílico, difundindo-

se no citossol. Liga receptores no ER e outros
organelos, causando libertação de Ca2+.
Ca2+ liga cPKCs via domínios C2.
DAGs são pouco polares e lipofílicos,

permanecendo na membrana. Ligam cPKCs via
domínios C1.
Ca2+ e DAGs causam a translocação de cPKCs

para a membrana. As cPKCs são activadas por
dissociação de um pseudosubstrato autoinibidor.
Newton et al (2016) Second messengers. Cold

Spring Harb Perspect Biol doi: 0.1101/cshperspect.a005926
Antal CE & Newton AC (2014) Tuning the sigaling output of

protein kinase C. Biochem. Soc. Trans. 42: 1477-1483
80
domínio C1
cPKC
nPKC
1,2-dioctanoil-sn-glicerol
(um DAG)
forbol-12,13-dibutirato
(um éster de forbol)
Gallegos LL & Newton AC (2008) Spatiotemporal dynamics of lipid Igumenova TI (2015) Dynamics and membrane interactions of
signaling: protein kinase C as a paradigm. IUBMB Life 60: 782-789 protein kinase C. Biochemistry 54: 4953-4968
81
Ca2+ intracelular como segundo mensageiro (1)
> Gradientes electroquímicos de Ca2+ através

da membrana
> Aglomeração de transportadores, hot-spots

e sinais localizados de Ca2+
Clapham DE (2007) Calcium signaling. Cell 131:

1047-1058 82
produção do sinal
> Influxo: canais de Ca2+ (membrana)

> Libertação de Ca2+ de depósitos
Intracelulares (ex: ER): receptores de
Ins(1,4,5)P3, receptores de rianodina
terminação do sinal
> Efluxo: bomba de Ca2+, trocador Na+/Ca2+
(membrana)
> Tomada por organelos (ex: ER): bomba
de Ca2+
> Tamponização por proteínas ligantes de
Ca2+
Bootman MD et al (2012) Calcium signalling and regulation of

cell function. In: eLS 83
libertação de Ca2+ de depósitos | receptores de Ins(1,4,5)P3 / IP3Rs
Os IP3Rs medeiam libertação de Ca2+ de depósitos intracelulares (principalmente ER e aparelho de Golgi), gerando sinais
de Ca2+ citossólicos - aumentos localizados da [Ca2+].
Quando ocorrem nas imediações de outros organelos (mitocôndrias ou lisossomos), estes aumentos permitem a
sequestração de Ca2+ por sistemas de transporte de baixa afinidade.
Prole LP & Taylor CW (2019) Structure and function of IP3 receptors. 84
Cold Spring Harb Perspect Biol doi: 10.1101/cshperspect.a035063
Os IP3Rs contêm locais de ligação de Ca2+ estimuladores na face citossólica. A ligação de Ins(1,4,5)P3
aumenta a afinidade destes locais a Ca2+ e a abertura dos poros, permitindo a propagação regenerativa de
sinais por “libertação de Ca2+ induzida por Ca2+” (CICR / Ca2+-induced Ca2+ release).
Estas “ondas de Ca2+” podem propagar-se ao longo da rede reticular da célula, recrutando regiões mais
remotas.
Rossi AM & Taylor CW (2019) IP3 receptors - lessons from analyses
ex cellula. J. Cell Sci. 132, jcs222463. doi:10.1242/jcs.222463 85
Bootman MD et al (2012) Calcium signalling

and regulation of cell function. In: eLS
Ver exemplos fisiológicos

em Berridge 2009
86
libertação de Ca2+ de depósitos | receptores de rianodina / RyRs
(ryanodine receptors)
RyR1 RyR2
RyR1s estão acoplados directamente a canais de Ca2+ sensíveis à voltagem tipo L (canais CaV1.1) no músculo
esquelético, formando um sistema de “canais com dois poros”: “libertação de Ca2+ induzida por voltagem”.
Lanner JT et al (2010) Ryanodine receptors: structure,

Petegem FV (2012) Ryanodine receptors: structure and expression, molecular details, and function in calcium release.
function. J. Biol. Chem. 287: 31624-31632 Cold Spring Harb Perspect Biol 2:a003996 87
RyR2s estão localizados a curta distância de canais CaV1.2 no músculo cardíaco, libertando Ca2+ por “libertação de Ca2+
induzida por Ca2+” (CICR).
Os sinais de Ca2+, amplificados por CICR em ambos os casos, promovem a interacção entre actina e miosina, estimulando
a contracção.
Zalk R et al (2007) Modulation of the ryanodine receptor and Capes EM et al (2011) Ryanodine receptors. Skeletal Muscle
intracellular calcium. Annu. Rev. Biochem. 76: 367-385 1: 18 88
sensores de Ca2+ em proteínas | mãos EF
(EF hands) Uma mão EF contém um motivo hélice-volta- -
hélice, em que um loop ligante de Ca2+ separa duas
α-hélices com orientação quase perpendicular.
E helix Cada Ca2+ é coordenado por sete átomos de

oxigénio, formando um complexo com geometria de
bipirâmide pentagonal. A afinidade a Ca2+ varia
largamente entre os diferentes membros da família (de
subnanomolar a milimolar).
As mãos EF estão presentes em muitas proteínas

ligantes de Ca2+ / CaBPs (Ca2+-binding proteins),
incluindo calmodulina, troponina C, S100 e membros
F helix da família de proteínas NCS (neuronal calcium
sensor): família de CaBPs com mãos EF.
A superfamília de CaBPs não se limita à família de

proteínas com mãos EF. Abrange ainda a família de
Haynes L (2016) Calcium-binding proteins. In: eLS proteínas com domínios C2 (ex: cPKC), anexinas e
proteínas dependentes de vitamina K, entre outras.
89
CaBPs com mãos EF | calmodulina
Calmodulina / CaM
(calmodulin) é uma
pequena proteína (17
kDa) com quatro mãos
EF, duas em cada
extremidade de um linker.
target peptide A ligação de 4 iões Ca2+

from CaMKII induz uma grande
alteração conformacional,
expondo superfícies
hidrofóbicas que
interaccionam com
hélices anfipáticas de
proteínas-alvo,
Johnson CN et al (2014)
EF-hand calcium-binding proteins. In: eLS envolvendo-as.
Halling DB (2016) Conserved properties of individual

Ca2+-binding sites in calmodulin. PNAS : E1216-E1225 90
proteína cinase dependente de Ca2+/calmodulina tipo II / CaMKII
(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II)
A ligação de Ca2+/CaM activa proteínas-alvo, frequentemente por desrepressão do local catalítico.
Swulius MT & Waxham MN (2008) Ca2+/calmodulin dependent protein 91

kinases. Cell Mol. Life Sci. 65: 2637-2657
Muitas outras proteínas-alvo de Ca2+/CaM

estão envolvidas em sinalização e metabolismo
celular. Exemplos: cinase da cadeia leve de
miosina, calcineurina e outras fosfatases,
glicogénio fosforilase cinase, sintases do óxido
nítrico (nNOS e eNOS) e Ca2+-ATPase da
membrana plasmática.
Stratton MM et al (2013) Structural studies on the regulation of Ca2+/calmodulin

dependent protein kinase II. Curr. Opin. Struct. Biol. 23: 292-301 92
Um importante “módulo de sinalização” de Ca2+?
? cAMP ¦ EPAC ¦ Rap ¦ PLCε ¦ PKCε ¦

CaMK
fonte:
Smrcka AV et al (2012) Role of phospholipase Cε in physiological
phosphoinositide signaling networks. Cell Signal. 24: 1333-1343
antevisão
PLC - fosfolipase C sensível a fosfolípidos de inositol
PKC - proteína cinase C
CaMK - proteína cinase dependente de Ca2+/ calmodulina
fonte:
93
Gloerich M & Bos JL (2010)
J.R. Fraústo da Silva & R.J.P. Williams (2001) The biological chemistry of
the elements: The inorganic chemistry of life, 2nd ed., Oxford University
Press 94
95
96

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Biofísica Celular

Luís Martinho do Rosário

> transdução de sinais // lmr

1) Fosfolipases C sensíveis a fosfolípidos de inositol: tudo a ver com PH?

● Nelson & Cox (2013) ou qualquer outro livro de texto

● Artigos de revisão sugeridos nas apresentações, cujos links

A disponibilização destes artigos não deve inibir os estudantes de encontrar fontes

Heldin C-H (2002) Signal transduction: Overview. In: eLS

e um pouco de food for thought, para agora ou mais

Kiel C et al (2010) Engineering signal transduction pathways. Cell 140: 33-47

via mediadores químicos locais (inclui

[NTs] típicas ~ células-alvo: vários μM

[Hs] típicas ~ células-alvo: pM-nM

A difusão simples de uma hormona ao longo de vários cm demoraria

O transporte de uma molécula de hormona requer a corrente sanguínea.

Verifique mais tarde o cálculo dos lapsos de tempo difusionais,

As moléculas de NTs têm tipicamente pequenas dimensões, para que os lapsos de

Tipicamente os NTs são aminoácidos ou derivados.

a hormona insulina (estrutura cristalina)

O transporte de Hs pela circulação sanguínea não é

As moléculas de Hs podem portanto ter dimensões muito

esteróides, derivados de aminoácidos,

MAIORIA das hormonas e

Newton AC et al (2016) Second messengers.

Elevado momento dipolar permanente

> receptores metabotrópicos

>> receptores acoplados a proteínas G / GPCRs

>> receptores catalíticos ou receptores com um único

Não contêm um poro permeável a iões.

receptor de acetilcolina tipo nicotínico receptor de glutamato tipo NMDA

tipo glutamatérgico Ca2+ (Na )+

N-metil-D-aspartato = NMDA (glutamato)

Segmento transmembranar único.

Receptor de factor de crescimento da

Receptor de insulina / InsR

Transferência de um grupo fosforilo para um resíduo de serina,

Tirosina cinase → fosfotirosinas.

> fosfotirosinas constituem locais de ancoragem para proteínas

> tirosina cinase do receptor fica cataliticamente competente para fosforilar

domínios PTB (en: Phosphotyrosine Binding)

Outras são activadas ligando as fosfotirosinas de proteínas

Exemplo de proteína adaptadora fosforilada por um

extensas plataformas ou complexos de

Wagner MJ et al (2013) Molecular mechanisms of SH2- and PTB-domain-containing proteins in

> tomada de glicose e síntese de glicogénio

(-) glicogenólise / (-) gluconeogénese /

Ver também a figura 1 em Haeusler RA et al (2018)

Os InsRs são expressos por quase todos os tipos

Há 2 isoformas do InsR (InsR-A e InsR-B),

2/3- Dimerização das subunidades catalíticas e

PI3Ks (tipo I) fosforilam PI, PI(4)P e PI(4,5)P2 a PI(3)P,

Fosfolípidos de inositol com grupos fosfato na posição

Ligação de PDK-1 e PKB/Akt à membrana via domínios PH

PDK-1 fosforila e activa PKB/Akt.

PKB/Akt fosforila e regula numerosas proteínas, sendo

PDK-1 e PKB/Akt fosforilam proteínas em resíduos de

Manning BD & Toker A (2017) AKT/PKB signaling:

Exocitose regulada das vesículas de

budding (brotamento do Golgi trans)

Estão ainda dispersas pelo

Quais as proteínas efectoras

Rab-GAP principal: TBC1D4 ou AS160 (Akt Substrate of

Estimulação por insulina: Remoção da inibição