23/10/2019

TESTES IMUNOLÓGICOS
Imunologia Clínica
(IMUNÓGENOS, ANTÍGENOS, HAPTENOS, EPÍTOPO, ANTICORPO)

RELEMBRANDO CONCEITOS

Antígenos-definições Antígenos-definições

• Epítopo ou determinante antigênico:

• Imunógeno:
porção do antígeno que se liga ao
• substância que pode induzir uma
anticorpo ou ao TCR.
resposta imune específica.

• Anticorpo:
• Antígeno:
glicoproteínas sintetizadas e excretadas
• qualquer substância que pode induzir a
por células plasmáticas derivadas dos
produção e se ligar a anticorpos.
linfócitos B contra antígenos específicos.

Antígenos-definições

• Hapteno:
não induz a produção de anticorpos, mas
podem se ligar a eles, uma vez que a
resposta tenha se produzido.

Ação de antigenicidade,
mas não de imunogenicidade.

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HAPTENO
Capacidade de interagir com os LT ou LB já sensibilizados

Ação de antigenicidade,
mas não de imunogenicidade.

Capacidade de induzir uma resposta imune específica,

EM QUE SE BASEIA OS TESTES

IMUNOLÓGICOS?
 INTERAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO

O QUE SÃO TESTES

IMUNOLÓGICOS?

Definição e características dos

“Consiste na investigação da infecção, mediante a
detecção, quantificação e caracterização de variáveis
(imunoglobulinas, antígenos, citocinas) presentes no
plasma/soro sanguíneo ou em outros materiais biológicos,
tais como amostra fecal, urina, saliva, escarro ou tecidos.”
testes imunológicos
 São testes que dependem da ligação de antígenos com
anticorpos específicos.
 São testes que detectam a presença de anticorpos ou
antígenos na amostra biológica da pessoa.

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Definição e características dos

testes imunológicos

 A interação Ag-Ac é um tipo especial de reação

química e, como tal, sujeita a vários tipos de forças.

 Especificidade

 Afinidade

 Diversidade

Especificidade
 As células imunologicamente competentes sintetizam o
Ac sob a influência das características estruturais do
Ag.
 O sítio combinatório do Ac toma a configuração
espacial mais adequada para complementar a
configuração da estrutura estranha na molécula do
antígeno. (Determinante = epítopo).
Afinidade
 Capacidade de ligação do Ac com o Ag que estimulou a
sua síntese.
 Ac de alta afinidade reconhecem uma grande porção
da estrutura do determinante antigênico.
 Ac de baixa afinidade reconhecem pequena parte da
estrutura e podem reagir com moléculas que tenham
estruturas semelhantes com menor afinidade, levando
a reações cruzadas.

Características das interações Ag-Ac

Reação cruzada
Diversidade
- Dois Ag diferentes apresentam epítopos estruturalmente
semelhantes
- Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não
relacionado, mas com propriedades químicas similares.  Ac específicos sintetizados em resposta a um único
determinante antigênico são diferentes entre si e tem
propriedades diferentes, especialmente em relação a
afinidade.

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Definição e características dos

APLICAÇÃO DOS TESTES? testes imunológicos
RESULTADOS:
 Diagnóstico  Qualitativo: Reagente (+) ou Não Reagente (-)

 Prognóstico
 Pesquisa  Semi-quantitativo: A amostra testada for diluida. A
 Soroepidemiologia maior diluição que apresentar reação é o título (ex:
Reagente 1:64)

 Quantitativo: Informa a quantidade absoluta do material

detectado.

Qualitativo
 Ex: anti-HCV (imunocromatografia)

Semi-Quantitativo
 Ex: VDRL (Floculação)

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DILUIÇÃO
Quantitativo
 Anti-HBS (Eletroquimiolumunescência)

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
 PRECIPITAÇÃO
 Imunodifusão-dupla
 Imunodifusão-radial
 Imunoeletroforese
 AGLUTINAÇÃO
 Aglutinação direta e
indireta
 Inibição da aglutinação
 Teste de Coombs
 FLOCULAÇÃO
 IMUNOENSAIOS
 Elisa
 Citometria de Fluxo
 Imunofluorescência
 Radioimunoensaio
 Western-blot

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
 SEM USO DE MARCADORES:
 Reações de precipitação
 Reação de aglutinação
 Floculação

 COM USO DE MARCADORES:

 Elisa
 Citometria de Fluxo SEM USO DE MARCADORES
 Imunofluorescência
 Radioimunoensaio

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Fatores que interferem na

Reação de Aglutinação formação de agregados
 Ocorre quando se formam agregados suficientemente
grandes de partículas.
 Tanto IgG quanto IgM são eficientes neste tipo de  Classe do Ac envolvido (IgM mais eficiente).
reação. pH entre 6 e 8.

 Pode ser realizado em lâmina, placa ou tubo.
 Tempo.
 Resultados qualitativos ou semi-quantitativos.  Temperatura

Fatores que interferem na formação

de agregados Tipos de partículas utilizadas
 Partículas com determinantes antigênicos naturais
 Hemácias
 Bactérias
 Protozoários
 Partículas inertes revestidas.
 Látex
 Bentonita
 Gelatina
Efeito Pró-zona - Excesso de Ac
Efeito Pós-zona - Excesso de Ag

Técnicas mais utilizadas Aglutinação direta

 Aglutinação direta  Baseia-se na aglutinação de partículas antigênicas
 Hemaglutinação direta insolúveis íntegras ou fragmentadas por Ac específicos.
 Inibição da hemaglutinação  Utilizada no diagnóstico de infecções bacterianas e por
 Hemaglutinação indireta protozoários.
 Aglutinação passiva  Ex.: Reação de Widal para salmonelose.
 Hemaglutinação passiva
 Inibição da aglutinação passiva
 Inibição da hemaglutinação passiva
 Reação de floculação.

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Aglutinação direta Hemaglutinação direta

 Baseia-se na aglutinação de determinantes antigênicos
Ac séricos da própria hemácia por Ac específicos.
Suspensão padronizada
 Ex.: Tipagem sangüínea.
de Salmonella virginia

Aglutinação

REAGENTE NÃO REAGENTE

1 2 3 4
A B AB O

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HAI para Chagas

Hemaglutinação indireta
 Baseia-se na capacidade do Ac de sensibilizar as
hemácias e na incapacidade de aglutiná-las.
 É necessário a adição de um segundo Ac (antiglobulina
ou soro de Coombs) para que ocorra a aglutinação.
 Ex: HAI para Chagas, teste de coombs

Aglutinação passiva
 Baseia-se na adsorção passiva de partículas inertes,
como látex, com Ag insolúveis, como proteínas e
polissacarídeos.
 Na presença de Ac, no soro do paciente, ocorre
aglutinação.
 Ex.: ASLO

Reação de floculação Reação de floculação

 Ocorre quando a interação direta de Ac específicos
com o Ag leva a formação de grumos em meio fluido,
detectáveis à microscopia ótica.

 Ex.: VDRL (Venereal Disease Research Laboratories).

VDRL negativo VDRL positivo

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Técnicas baseadas nas reações

Reações de precipitação de precipitação
 Permite a semi-quantificação de precipitados formados  Imunodifusão
pela reação Ag-Ac.  Simples linear
 simples radial
 Existem fatores físico-químicos e imunológicos que  Imunoeletroforese
interferem na quantidade de precipitado formado.  Eletroimunodifusão
(concentrações de Ag e Ac).  simples linear
 Nefelometria
 Turbidimetria

Imunodifusão Imunodifusão simples linear

 Baseia-se na difusão de uma substância solúvel em um  Ac é incorporado ao
meio líquido ou semi sólido como o ágar. ágar.
 A mistura é colocada em
 O transporte da substância de uma parte para a outra tubo.
do meio é resultado do movimento molecular ao acaso.  Deposita-se o Ag
incorporado ao ágar.
 O tubo é selado,
mantido a temperatura
constante e observado
em uma semana.

Imunodifusão simples radial Imunodifusão simples radial

 O Ac é incorporado ao
ágar e colocado em
uma placa de Petry.
 No centro é feito um
orifício e nele é
colocado o Ag a ser
testado.

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Imunoeletroforese
 Combina eletroforese com difusão dupla em gel de
ágar.
 A eletroforese evidencia cinco a seis componentes
séricos, a imonoeletroforese distingue mais de trinta.
 Realizada em dois tempos:
 Separação eletroforética
 Imunodifusão
Imunoeletroforese
 Método qualitativo.
 Confiável para caracterização de proteínas.
 Aplicação mais comum é no diagnóstico das
gamopatias monoclonais (mieloma múltiplo).

Imunoeletroforese

Definição e características dos

testes imunológicos
 Como a reação Ag-Ac é raramente visível, a escolha da
técnica ideal depende do analista clínico.
 Tipos de marcadores
 Radioisótopos
 Fluorescentes
 Enzimático com substrato cromógeno

COM USO DE MARCADORES  Quimioluminescente

 Eletroquimioluminescente

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Radioisótopos Radioimunoensaio
 Marcador utilizado - isótopo radioativo, normalmente  Muito utilizado para dosagens de hormônios,
125I (vida média  60 dias). marcadores tumorais e IgE específica
 Radioimunoensaio - componente marcado é o Ag.
 Ensaio Imunorradiométrico - componente marcado é o  Limitações:
Ac.  Vida média dos reagentes.
 Alta sensibilidade (hg e g).  Risco operacional.

Fluorocromo Fluorocromo

 É uma substância que absorve luz de comprimento de
onda menor e emite luz de comprimento de onda maior
quando excitada.
 A absorção de luz por uma molécula de fluorocromo eleva o
nível de energia de seus elétrons. Ao retornar ao estado basal,
há emissão de fluorescência de comprimento de onda maior
do que o da luz excitadora inicial.

 Fenômeno conhecido como fluorescência.

Fluorocromo Fluorocromo

 Fluoroimunoensaio - Componente marcado é o

antígeno.

 Ensaio imunofluorimétrico - Componente marcado é o

anticorpo.

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Características desejáveis de um
fluorocromo Tipos de IFA
 Direta
 Baseia-se na localização de Ag em células ou tecidos
utilizando um Ac específico marcado com fluorocromo.
 Estabilidade.  Vírus respiratórios, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum,
 Grande capacidade de absorção. herpes.

 Absorção e fluorescência de luz no espectro visível.  Indireta

 Nenhuma interferência com a reação imunológica.  Baseia-se no uso de um Ac marcado com fluorocromo, cuja
finalidade é detectar outro Ac.
 Toxoplasmose, chagas, clamídia, FTA-ABS.

IFA

Chagas positivo Chagas negativo

Toxoplasmose positivo

Enzimático com substrato

IFA
FTA-ABS positivo
FTA-ABS negativo
cromógeno
 Enzimaimunoensaios - são técnicas que permitem
medidas quantitativas diretas da interação Ag-Ac por
mediada da atividade enzimática sobre um substrato.
 Tem substituído o radioimunoensaio por terem
sensibilidade comparável, reagentes estáveis,
possibilidade de utilização numa variedade de sistemas
de detecção.

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Enzimático com substrato

cromógeno Ensaios heterogêneos
 Requisitos da enzima:
 Alta atividade específica
 Facilidade de obtenção na forma purificada  A atividade enzimática não é alterada como parte da
 Conjugação fácil reação imunológica, sendo necessário separar os
 Resultado da reação deve ser um produto estável reagentes marcados livres dos ligados.
 Preço acessível
 ELISA - Enzime-linked immunosorbent assay

ELISA ELISA
 Como o substrato forma um produto colorimétrico, a  Tipos:
alteração da cor é monitorada visualmente ou com  Competitivo
auxílio da aparelho.  Sanduíche
 Captura
 Alta sensibilidade, especificidade, rapidez, baixo
custo, objetividade de leitura.

ELISA Competitivo Elisa Não Competitivo

 Mais utilizado para detecção de Ag.
 O Ac utilizado teve ligar com a mesma avidez o Ag da
amostra e o Ag marcado.  Pode ser utilizado para pesquisa de Ag e de Ac.
 Resultado positivo resulta no não desenvolvimento de  Intensidade da cor desenvolvida é proporcional a
cor ou desenvolvimento mínimo de cor (inversamente concentração de Ac ou Ag presente na amostra.
proporcional).
 Usualmente tem maio sensibilidade e especificidade.
 Usualmente tem maior especificidade e menor
sensibilidade.

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Elisa Não Competitivo Elisa Não Competitivo

PC

COC

NC
Reação negativa Reação positiva

ELISA Captura Problemas com ELISA

 Problemas técnicos
 Permite a pesquisa da IgM específica sem interferência
da IgG específica, eliminada no primeiro passo, sendo
de grande sensibilidade.
 Pesquisa de toxoplasmose.
 Alto background - cor de fundo, são leituras mais altas que
as reais (ligação inespecífica, lavagem inadequada).
 Efeito Hook - Resultados menores que o esperado na
quantificação de determinada substância, resultando numa
subestimação grosseira da quantidade da substância na
amostra.
 Ac heterófilos - Resultados falso-positivos podem ser
encontrados em pacientes com altos índices de IgM,
grávidas e imunossuprimidos.

Western Blotting Western Blotting

 Procedimento em que as proteínas são separadas pelo
tamanho por eletroforese e, após a separação,
transferidas para uma membrana de nitrocelulose, onde
ficam imobilizadas.
 Essa membrana sensibilizada é utilizada como suporte
sólido.

Acompanhamento de infecção de um paciente

com HIV

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Quimioluminescência Quimioluminescência
 É a emissão de luz produzida em algumas reações
químicas envolvendo moléculas que emitem luz,
quando passam do estado de excitação para o basal
eletrônico.
 Na maioria são reações de oxidação.
 Emissão de luz (milissegundos [ésteres de acridinia] a
5 minutos [adamantil 1,2-dioxetano aril fosfato]).

Quimioluminescência Quimioluminescência
 Vantagens:
 Baixos limites de detecção - Alta Sensibilidade
 Baixo Background Interferente
 Faixa dinâmica amplamente linear
 Conjugado estável
 Relativamente não tóxico
 Amplificação eletrônica do sinal - PMT 106
 Não necessita seletor para comprimento de onda

Testes imunológicos sem

CASO CLÍNICO 1
interação Ag-Ac
 Citometria de fluxo  O paciente LMT, 43 anos, deu entrada no PA,
 Fluorimetrico queixando-se de falta de ar e arritmia. Na sua
 Laser anamnese estava escrito que mora em casa de taipa, e
 HPLC tem familiares com história da doença.
 UV
 Detector eletroquímico (reação Redox)  Qual a provável doença?
 Quais os exames sorológicos (técnicas) que podem ser
solicitados?
 Quais os possíveis resultados de cada técnica?

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CASO CLÍNICO 2 CASO CLÍNICO 3

 RN de MJR, 1 dia, realizou um exame tipagem
sanguínea e fator Rh. Sabendo que o pai é O positivo e
a mãe é A negativo, responda:
 Quais os tipos sanguíneos que a RN pode ter?
 A tipagem sanguínea e o fator Rh são baseados em quais
técnicas?
 Como a mãe é Rh negativo era necessário que ela fizesse
um exame antes do parto para evitar a Eritroblastose fetal.
Qual exame é esse? Qual a técnica usada?
 A paciente MJT, 4 anos, deu entrada no PA,
queixando-se de febre, dor na garganta e dor no corpo.
O médico então solicitou alguns exames para
diagnosticar a doença, dentre eles o ASLO.
 Qual a técnica usada no exame solicitado?
 Quais os possíveis resultados e diagnóstico dessa técnica?

CASO CLÍNICO 4
 A paciente MJT, 43 anos, gestante fez uns exames
sorológicos de rotina gestacional. Os resultados estão
abaixo. Interprete-os.
“PARA CONQUISTAR O SUCESSO VOCÊ
Exame IgG IgM PRECISA SE TORNAR O HERÓI DA SUA
RUBÉOLA R NR PRÓPRIA VIDA E TRABALHAR TODOS OS DIAS
CITOMEGALOVÍRUS R NR
PARA QUE SEUS OBJETIVOS ACONTEÇAM”
TOXOPLASMOSE NR NR
OBRIGADA!!

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