LABORATÓRIO DE BIOENGENHARIA

Observação de células e estruturas celulares

INTRODUÇÃO

Existem essencialmente 2 tipos de microscópios: de luz e electrónicos, existindo ainda

entre cada uma destas classes vários tipos, tais como o de microscopia electrónica de
transmissão e de varrimento, microscópio óptico de campo claro, contraste de fase,
fluorescência, etc. As observações efectuadas neste trabalho serão, no entanto, limitadas à
utilização do microscópio óptico de campo claro (Fig. 1). A ampliação usada depende do
tipo de lentes da objectiva usada com a ocular. Os microscópios compostos têm três ou
quatro objectivas com ampliações de: 4x, 10x, 40-44x e imersão 97-100x. A ampliação
total das lentes é calculada pela multiplicação da ampliação da ocular (geralmente 10x) pela
ampliação das lentes da objectiva. A objectiva mais importante em microbiologia é a de
imersão das lentes em óleo, as quais têm maior poder de ampliação.

6 Figura 1 – Microscópio óptico.

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1 – Botão ON/OFF e regulador de
intensidade de luz.
5 2 – Oculares (10x).
1 3 – Botões macro e micrométrico.
3 4 – Plataforma de suporte da amostra.
5 – Botões reguladores da plataforma.
6 – Objectivas (5x, 10x, 40x, 100x).

A capacidade das lentes revelarem em pequeno detalhe 2 pontos distintos e separados é

chamada poder de resolução ou resolução. O poder de resolução (0,61λ/ΝΑ) é uma função

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do comprimento de onda (λ) da luz utilizada (pode ser alterado por exemplo por filtros,
tendo em média o valor de 0,5) e da abertura numérica (NA) das objectivas (para o ar é 1,0
e para o óleo de imersão 1,4). Α melhor resolução de um microscópio óptico é de cerca de
0,2 µm, isto é, dois objectos que distem menos que este valor não são distinguíveis.

A falta de contraste entre as estruturas celulares e o meio dificulta a sua observação ao

microscópio óptico. No sentido de minimizar este problema, estudaram-se vários tipos de
colorações. Este método, de grande utilidade na observação de estruturas celulares,
apresenta, no entanto, alguns inconvenientes uma vez que os corantes quando combinados
quimicamente com os componentes celulares provocam a morte das células. Os corantes
são compostos químicos sintéticos e para fins práticos são divididos em dois grupos:
corantes ácidos e corantes básicos. Esta propriedade não tem a ver com a sua acidez ou
basicidade, indica se a função de corante é desempenhada pelo anião ou pelo catião.

Consideram-se geralmente três tipos de colorações: 1) simples, 2) diferenciais, e 3)

especiais.

1. Colorações simples - são colorações nas quais se utiliza apenas um corante. Podem ser
positivas - quando as células são coradas (ex: azul de metileno, safranina, cristal de
violeta) - ou negativas - quando o meio é corado (ex: tinta da china, nigrosina). Esta
colorações são usualmente utilizadas quando se pretende saber a morfologia e o arranjo
das células.

2. Colorações diferenciais - são colorações em que se utiliza mais do que um corante. A

coloração diferencial mais vulgar é a coloração de Gram, que é usada como um passo na
caracterização de bactérias. A coloração Gram inicia-se com a aplicação do corante
cristal de violeta seguida da aplicação de uma solução de iodo. Nesta fase todas as
bactérias estão coradas de roxo. As células são em seguida tratadas com uma solução de
álcool e acetona. As células Gram positivas retêm o complexo cristal de violeta-iodo e
permanecem roxas, enquanto as células Gram negativas são completamente descoradas
pelas mistura álcool-acetona. Na última fase do processo aplica-se um novo corante -
safranina - que cora as Gram negativas de vermelho. As células Gram positivas
aparecem coradas de cor púrpura. Diferenças na constituição da parede celular dos
microrganismos explicam estes diferentes comportamentos de coloração.

3. Colorações especiais - são colorações que se destinam a corar estruturas celulares. Um

exemplo deste tipo de coloração é o usado para a observação de flagelos bacterianos. Os

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 flagelos, a estrutura mais comum de mobilidade em bactérias, são compostos por finas
estruturas proteicas com origem no citoplasma e projectadas para fora da parede celular.
São muito frágeis e não visíveis com um microscópio de luz. Os flagelos podem ser
observados por intermédio de um revestimento que aumenta o seu diâmetro.

Existem também corantes que coram especificamente estruturas/macromoléculas

celulares. Por exemplo, os corantes fluorescentes acridina laranja e DAPI (4'-6-
diamidino-2-phenilindole), intercalam a dupla hélice do DNA, corando-o
especificamente. O kit Live/Dead foi desenvolvido para diferenciar numa amostra
bactérias viáveis e não viáveis. Este teste baseia-se na integridade da membrana
citoplasmática: as bactérias com membranas intactas coraram de verde e as que têm a
membrana destruída coram de vermelho. Outros corantes, como o carmin acético,
permitem visualizar cromossomas em microscopia de campo claro, tornando possível,
por exemplo, vizualizar as diferentes fases da mitose.

O trabalho experimental tem por objectivo conhecer a morfologia de células de diferentes

grandes grupos de organismos. Adicionalmente, pretende-se observar
estruturas/macromolélulas das diferentes células.

PARTE EXPERIMENTAL

Durante o trabalho laboratorial cada grupo de 2 alunos deverá observar células de diferentes
organismos. Os organismos estarão apenas identificados com letras, pois pretende-se que
durante as aulas laboratoriais sejam caracterizados e apenas no final do período laboratorial
será fornecida uma tabela com a sua identificação.

Durante a aula prática, cada grupo de alunos deverá realizar diferentes preparações de
microscopia de campo claro. Após a observação macroscópica e microscópica de cada
organismo, cada aluno deverá registar TUDO o que observou para poder completar as
tabelas anexas, que devem ser entregues no final da aula. Cada grupo deverá, ainda,
propagar o microrganismo que irá usar nas aulas seguintes, através do método de
estriamento (ver anexo a este protocolo).

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Protocolo experimental de preparações de microscopia óptica de campo claro

Observação de preparação a fresco

1. Limpe cuidadosamente uma lâmina com etanol;

2. Se pretender analisar uma cultura em MEIO SÓLIDO, coloque uma gota de água estéril
na lâmina (com uma ansa);

3. Esterilize a ansa, deixe arrefecer, toque no topo de uma colónia;

4. Misture as células na lâmina com a gota de água. Este procedimento é desnecessário se a

cultura já se encontra re-suspendida ou cultivada em MEIO LÍQUIDO: coloque 25 µl da
cultura na lâmina e passe para o passo 6 (As culturas serão fornecidas pelo docente).

5. Esterilize novamente a ansa;

6. Coloque a lamela em cima da gota, tendo o cuidado de não pressionar o material

biológico;

7. Coloque a preparação no microscópio e foque com a objectiva de menor ampliação

usando em primeiro lugar o parafuso macrométrico (ajuste mais grosseiro) e para o
ajuste mais fino o parafuso micrométrico;

8. Passe sucessivamente para a de maior ampliação, e quando usar a objectiva de 100x,

coloque em cima da área a observar uma gota de óleo de imersão e ajuste novamente a
focagem. NOTA: não use óleo de imersão com qualquer outra objectiva.

9. Observe cuidadosamente a forma, estruturas, tamanho e movimento do

organismo/célula;

10. Registe as observações;

11. Retire a preparação, coloque-a numa solução desinfectante, e limpe o óleo da objectiva
de imersão com papel macio e etanol.

Preparação de um esfregaço (normalmente utilizado para observação de bactérias e

leveduras)

1. Coloque numa lâmina limpa e seca uma gota de água destilada;

2. Esterilize uma ansa, toque numa colónia e misture bem o material biológico na gota de
água (dispersando a água colocada na lâmina com a ansa já inoculada);

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3. Fixe o material celular com o calor, levando a lâmina à chama várias vezes, de modo a
secar sem aquecer demais.

Coloração simples a partir de uma preparação a fresco

1. Prepare uma preparação a fresco sobre a lâmina;
2. Coloque o corante usando a técnica de irrigação: coloque uma gota de corante [azul de
metileno a 1% (p/v)] num dos lados da lamela e arraste o corante com a ajuda de papel de
filtro no lado oposto da lamela.
3. Observe a preparação ao microscópio óptico. Se necessário, recorra à objectiva de
imersão.

Coloração simples a partir de um esfregaço

1. Prepare um esfregaço;
2. Cobra o esfregaço com o corante [azul de metileno a 1% (p/v)]. Deixe actuar durante 1-3
min.;

3.Retire o excesso de corante com água corrente;

4. Seque com papel de filtro;
5. Observe a preparação ao microscópio óptico. Se necessário, recorra à objectiva de
imersão.

Coloração de Gram (parede de peptidoglicano)

1. Prepare um esfregaço;

2. Cubra o esfregaço com solução de cristal de violeta durante 30 segundos;

3. Lave com água e cubra o esfregaço com solução de iodo de Gram durante 30 segundos;

4. Lave com água e lave o esfregaço com solução descolorante. Deixe actuar durante
alguns segundos;

5. Lave o esfregaço com água e cobrir com solução de safranina durante 30 segundos;

6. Lave com água, seque com papel absorvente e observar ao microscópio com objectiva de
imersão (começando com a de menor ampliação);

7. Observe e registe a morfologia celular e o grupo a que pertence a bactéria - Gram

positivas (púrpura) ou Gram negativas (vermelho).

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Coloração diferencial para estudo da estrutura de uma célula vegetal

1. Coloque sobre 4 lâminas de vidro com a pipeta de Pasteur uma gota dos diferentes
corantes diferenciais: solução de Ringer, solução de iodo, vermelho - neutro e azul de
metileno.
2. Utilize o bisturi para fazer quatro pequenos cortes na epiderme da túnica cebola e
coloque-os sobre as gotas dos corantes.
3 . Cubra cautelosamente cada um com as lamelas.
4. Observe a preparação ao microscópio.

Estudo do processo de osmose numa célula vegetal

1. Coloque sobre uma lâmina de vidro com a pipeta de Pasteur uma gota de água.
2. Coloque depois um fragmento da epiderme da túnica cebola e cubra com uma lamela.
3. Observe a preparação ao microscópio.
4. Utilizando a técnica de irrigação, substitua o meio de montagem pela solução de NaCl a
20 %.
5. Substitua novamente o meio de montagem por água destilada.
5. Registe as alterações observadas e esquematize o que observou.

Coloração de cromossomas lineares

1. Coloque 25 µl de carmim acético 2% (p/v) no centro de uma lâmina.

2. Coloque o material celular com a pinça sobre o carmim acético.
3. Dissocie o material com duas agulhas de dissecção e aguarde um minuto.
4. Cobra com a lamela o material dissociado.
5. Retire o excesso de corante da preparação com papel de filtro.
6. Observe a preparação ao microscópio óptico. Se necessário, recorra à objectiva de
imersão.

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Propagação de microrganismos pelo método de estriamento

Propague em meio sólido o organismo 2 que escolheu e anote-o pois vai trabalhar com ele
nas aulas seguintes.

1. Identifique na caixa de Petri de meio sólido PCA o nome do microrganismo que vai
cultivar, o seu nome e a data.
2. Esterilize uma ansa por flamejamento.
3. Deixe arrefecer a ansa, sem a contaminar.
4. Toque numa colónia isolada da cultura de inóculo.
5. Inocule o meio de cultura através da técnica de estriamento (use a ansa como se fosse um
lápis de carvão – cubra toda a superfície do meio, sem nunca voltar atrás, e mude de
direcção, pelo menos 3 vezes) (Anexo 2).

6. Incube as culturas em posição invertida numa estufa incubadora, a 30˚C durante 18

horas.
7. Observe e anote a morfologia colonial do seu organismo (Anexo 1).

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ANEXO 1: Guia de observação e caracterização da morfologia colonial de microrganismos
(culturas em meio sólido)

Morfologia colonial

FORMA

PUNCTIFORME CIRCULAR FILAMENTOSA IRREGULAR RIZOIDE FUSIFORME

ELEVAÇÃO

PLANA ELEVADA CONVEXA PULVINADA UMBUNADA

MARGEM

INTEIRA ONDULADA LOBADA ERUDIDA FILAMENTOSA ENCRESPADA

OUTRAS CARACTER ÍSTICAS:

Cor, brilho, opacidade, consistência, tamanho, etc...

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ANEXO 2: Propagação de um microrganismo pelo método do estriamento.

Método de estriamento

Esterilização da ansa Tocar numa colónia

Arrefecer a ansa isolada

Ansa
Ansa

Bico de Bunsen Bico de Bunsen

Pode esterilizar novamente a ansa

antes de recomeçar o estriamento
noutro quadrante

Placa de Petri com

meio de cultura sólido

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