Técnicas de processamento seminal:

➜ A técnica empregada varia de acordo com a - Só é utilizado quando não pode selecionar as
finalidade e qualidade da amostra outras técnicas (Ultima alternativa)

• SWIM UP - Inseminação intrauterina

• MIGRAÇÃO ASCENDENTE - Espematozoide, leucócitos, células redondas tudo

• SPERM WASH fica no pellet
• GRADIENTE DESCONTINUO DE DENSIDADE
➜ Swin UP
➜ Soluções de trabalho:
- Os espermatozóides podem ser selecionados pela
• Meio de lavagem ( HTF, MOPS OU HEPES) sua capacidade de nadar fora do plasma seminal e
• Suplemento proteico (HSA, SSS) em meio de cultura

• Gradiente coloidal ( 40% Upper, 80%

Lower)

➜ Sperm Wash: É o procedimento preliminar para

separar os sptz do plasma seminal. Com o objetivo
de remover o fator decapacitante e outros
elementos prejudiciais e concentrar os
espermatozóides. 1:2

- 1 ml de HTF

- MEIO HTF -> SÊMEN LA NO FUNDO DO TUBINHO

E IR SOLTANDO A AMOSTRA LENTAMENTE

- Tubos inclinados

- Vai ficar no fundo, todas células mortas, imóveis

- Cuidar para não misturar

- Todas as células serão levadas para o fundo
formando o pelet - Técnica mais utilizada

- Serve para remover liquido seminal, concentrar - Motilidade e vitalidade tem q estar normais
amostra, mas NÃO seleciona espermatozóides
- Concentração reduz muitooo
- Utilizar quando a amostra é muito ruim em
- Só se usa para amostras boas
concentração
➜ Migração ascendente com sedimentação
- Criptozoospermia
- Câmara de Tea-Jondet
- Desvantagem: Caro
➜ Gradiente descontínuo de densidade
- No fundo gradiente coloidal, viscoso, depois
segunda camada com gradiente com metade da
concentração, depois a amostra.
- No primeiro coloide (topo), todos os mortos, no
segundo espermatozoides com morfologia e
motilidade ruim não passa, no terceiro (fundo) está
os espermatozoides bons, utilizados
- Coloide tóxico para o espermatozóide
- Depois de 20 min já retira o sobrenadante, e
centrifuga novamente e ressuspende
- Melhor técnica
- Muito eficaz
➜ Ejaculação Retrógrada
- Uretra peniana se fecha, fazendo com que o
espema volte pra bexiga
- Alteração no ducto
- Albumina é ácida e mata o sptz
- Solução de NaHCO3 48h antes ➜ Masturbação
➜ Coletar urina logo após masturbação ➜
Centrifugar urina 10min a 1600 rpm ➜ Proceder
com Sperm Wash do pellet
➜ Amostra infectocontagiosa
- Paciente HIV positivo, hepatite positiva
- No liquido seminal que está o vírus
- Sperm Wash (primeiro para retirar liquido seminal
e ressuspender), depois colocar no gradiente de
densidades (retirar partículas) Swim up do pellet –
Congelar o sobrenadante (Quarentena) ➜ 1
Aliquota é congelada e enviada para o lab de
genética
Meios de cultura
➜ Para o embrião crescer, é necessário: Fonte
energética, proteínas, fatores de crescimento,
vitaminas, antibióticos e indicadores de pH.
- Manutenção das condições ideais durante o
período de cultivo incluindo temperatura, pH,
osmolaridade, exposição à luz e respiração
1. SOBREVIDA ESPERMÁTICA : UM BOM MEIO DE
CULTURA DEVE SER CAPAZ DE MANTER, PELO
MENOS, 60% DOS SPTZ COM MP AO FINAL DO
TEMPO DE INCUBAÇÃO (18 A 20H)
2. DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÃO DE
CAMUNDONGOS: UTILIZAM-SE EMBRIÕES DE
CAMUNDONGO DE 2 CELULAS (72H-
BLASTOCISTOS)80%
Meios:
• CAPTAÇÃO DE OÓCITOS
 • CAPACITAÇÃO DE SPTZ
• EMBRIÕES (CULTURA)- SEQUENCIAIS E
ÚNICO
• TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES
• BIOPSIA
• CRIOPRESERVAÇÃO
• SUPLEMENTAÇÃO
• DENUDAÇÃO (HIDROLISE DO ACIDO
HIALURONICO.)
• IMOBILIZAÇÃO DE SPTZ (PVP-
POLIVINILPIRROLIDONA)
• ÓLEO
• PREPARO OVERNIGHT
Componentes dos meios de cultura:
• Meio de cultura definido
• Alta reprodutibilidade
• Utilização de componentes altamente
purificados
• Divulgação incompleta da composição do
meio de cultura (Patente)
• Variação na descrição da composição –
constituintes e concentração Interesses
comerciais
➜ Transição maternalzigótica (MZT)
COMPONENTES :
• ÁGUA: CONSTITUINTE MAIS IMPORTANTE DOS
MEIOS DE CULTURA
- FATOR LIMITANTE PARA SUPORTAR O
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
- EXCELENTE SOLVENTE
- ALTA SUSCEPTIBILIDADE A CONTAMINAÇÃO
(PARTÍCULAS ORGÂNICAS, INORGÂNICAS E MICRO-
ORGANISMOS)
• SUPLEMENTOS PROTEÍCOS: RESERVA DE
NITROGÊNIO PARA SÍNTESE PROTÉICA
- ABSORÇÃO DE TOXINAS
- 10%
- GARANTIR PROPRIEDADES CORRETAS DE
TAMPONAMENTO E ESTABILIZAÇÃO DO MEIO
- PREFERENCIALMENTE ALBUMINA SÉRICA
HUMANA (HSA) OU SINTÉTICA (SSS)
- Aderência do embrião
• AMINIÁCIDOS: PRECURSORES PARA SÍNTESE
PROTEICA E SUBSTRATO DE ENERGIA (ATE 4 CELS
PODEM DESENVOLVER SEM AA)
- SINALIZADORES
- DIFERENTES COMBINAÇÕES RECOMENDADAS
NOS DIFERENTES ESTÁGIOS DE CULTURA
EMBRIONÁRIA
- REQUERIMENTO DE AMINOÁCIDOS ESPECÍFICOS
É DESCONHECIDO
- GLUTAMINA (L-ALANYL-L-GLUTAMINA E GLICIL-
LGLUTAMINA)
- AMÔNIA- QUEBRA ESPONTÂNEA DE HSA E
AMINOÁCIDOSRENOVAÇÃO DO MEIO A CADA 48H
(ALTERAÇÃO DO METABOLISMO EMBRIONÁRIO,
DE PH, DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA)
• FONTE DE ENERGIA:
- PIRUVATO – FONTE PREFERENCIAL DE ENERGIA
NOS ESTÁGIOS PRECOCES DO DESENVOLVIMENTO
- GLICOSE – PODE CAUSAR BLOQUEIO DO
DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO
(CONTRADITÓRIO)
- ATUALMENTE CONSIDERA- SE QUE A GLICOSE
NÃO INIBE O DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO,
SENDO SUGERIDO O USO, NOS MEIOS DE
CULTURA, EM CONCENTRAÇÕES SEMELHANTES
ÀQUELAS OBSERVADAS NA TUBA (2,0-3,0 MM).
- ESSENCIAL COMO FONTE PRIMÁRIA DE ENERGIA
PARA EMBRIÕES EM ESTÁGIO DE BLASTOCISTO
- ESSENCIAL NA PREPARAÇÃO DO SÊMEN E
FERTILIZAÇÃO
• VITAMINAS - efeito desconhecido
• ANTIBIÓTICOS
• EDTA- ácido etilenodiamino tetra-acético
• Sódio (Na) e K- Controle da osmolaridade e
• pH Cálcio (Ca) - Importante papel na comunicação
celular e armazenado no interior celular pH- (7,2 a
7,4), bicarbonato de sódio e fosfato (HEPES
(phenol red) e MOPS)
• Óleo
Indução ovariana:
➜ Estimulação ovariana-Protocolos curtos e
longos:
•Bloqueio hipofisário- (agonistas e antagonistas de
GnRH)
•Doses de gonadotrofinas: de acordo com causa da
infertilidade, características e idade da paciente.
➜ Drogas indutoras do crescimento folicular:
• Citrato de clomifeno
• Gonadotrofinas: FSHr, FSHu
• Inibidores da aromatase
➜ Citrato de clomifeno: Análago do estrogênio
• Liga-se aos receptores estrogênicos da hipófise,
agindo como um antagonista competitivo do
estrogênio.
• Conseqüência: Redução significativa do
mecanismo de feedback negativo, acarretando a
liberação do GnRH hipotalâmico
➜ Gonadotrofinas: Glicoproteínas sintetizadas e
excretadas pela hipófise
➜ Inibidores da aromatase: Inibem o complexo
enzimático da aromatase, bloqueando a conversão
ovariana dos andrógenos para estrógenos. A
redução dos níveis plasmáticos de estrogênio,
acarreta a liberação de GnRH hipotalâmico, com
aumento dos níveis de gonadotrofinas.
• Possui uma meia-vida curta.
➜ Drogas indutoras do gatilho ovulatório: quando
3 ou mais fol. > que 18mm e endométrio 8mm
• hCG (O hCG e o LH possuem em comum uma
mesma subunidade ,o hCG mostra uma meia-vida
maior ( + de 24 horas) do que a do LH (60
minutos) e a sua afinidade pelos receptores
ovarianos é superior à do LH)
• LH recombinante ( em fase experimental).
➜ Drogas para suporte da fase lútea: •
Progesterona e Hcg
- Utilizar progesterona em gel vaginal no começo
dos sinais da ovulação, realizar Beta HCG após 14
dias, se positivar, continuar utilizando por 14
semanas
➜ Complicações do processo de estimulação
ovariana: Síndrome de hiperestimação ovariana
(SHO)
-pacientes jovens e saudáveis Fatores que podem influenciar:

-decorrente da falta de um controle do processo de - Fator cervical / incompatibilidade muco-sêmen

crescimento folicular e individualidade . Causam
aumento da permeabilidade capilar, diversas
substâncias podem estar envolvidas nesse
processo, com a histamina, prostaglandinas....
-A SHO aparece na fase pós-ovulatória de um ciclo
induzido e caracteriza-se por um aumento do
volume ovariano e da permeabilidade vascular,
- Disfunção ovariana grave / moderada
– Oligospermia leve / moderada
- Endometriose tratada ou leve
- Disfunção sexual: Vaginismo
- Sêmen congelado previamente

acarretando uma perda da fração protéica do
compartimento intravascular.
-1% nos ciclos de tratamento
a) SHO leve:
➜ Critérios de avaliação dos Oócitos: Maturidade
(CCO-acido hialuronico)
Grau I : uma a três camadas de células fortemente
aderidas ·

Grau 1: distensão e desconforto abdominal; Grau II : células do cumulus densas e fortemente

Grau 2: náuseas, vômitos e/ou diarréia associada
com aumento ovariano de 5 a 12 cm.
b) SHO moderada
Grau 3: forma leve mais sinais ultra-sonográficos de
ascite.
aderidas ·
Grau III : células expandidas e frouxamente aderidas
·
Grau IV : células muito expandidas e frouxas
- Etapa Enzimática- Hialuronidase (30 segundos )

c) SHO severa - Etapa Mecânica- pipeta afilada

Grau 4: moderada mais ascite e/ou hidrotórax e - Maturação nuclear-condensação da cromatina,

dificuldades respiratórias;
Grau 5: mudanças no volume sangüineo,
hemocentração ,leucopenia, anormalidades na
coagulação, alteração da função renal com oligúria
Tratamento: reequilíbrio hidroeletrolítico, a
prevenção dos acidentes tromboembólicos e o
tratamento das complicações, tais como a ascite, o
hidrotórax, a torção e a ruptura ovariana
quebra da membrana nuclear, formação do fuso
meiotico e segregação dos cromossomos
- Maturação citoplasmática- (reorganização
mitocondrial,migração dos granulos para periferia e
mobilização do RE para liberação de Ca
- Morfologia

➜ Inseminação intra-uterina (IIU)

- Estimulação ovariana

- Coleta dos espermatozóides e processamento

- Sperm wash, Swin-up , Sedimentação ou

Gradiente coloidal (vol. max 0,5mL)
➜ Fuso meiótico: Refringencia zona pelucida
(organizacao molecular) ➜ Presença de vacúolos:

- Variam de tamanho

- Constituição: igual a do espaço perivitelínico

- Fusão da vesícula do REL ou Complexo de Golgi

- Maior problema: Deslocam os fusos meióticos

- <20% oócitos com grandes vacúolos são

fertilizados
➜ Anormalidades do Oócito: Possíveis fatores
➜ Alterações extracitoplasmáticas: EPV (diminuído
capazes de induzir tais alterações:
ou aumentado + grânulos)
- Estimulação ovariana controlada e resposta
ovariana

- Doses gonadotrofinas

- Alterações no microambiente folicular

- Seleção não fisiológica dos folículos recrutados

• Ciclos estimulados – 60-70% dos oócitos

apresentam alterações morfológicas

➜ Dismorfismos morfológicos: Granulações ,

citoplasma denso,inclusões,vacúolos,agregados de ➜ Montagem de placas:

RE, corpos retráteis - Identificação em todas as placas

- Placa de checagem e banhos (HTHHepes+SSS)

(recepção de oocitos)
 - Necessário fazer cálculos para preparo de meios

➜ Ferilização in vitro (FIV): Indicações:

• Disfunção ovulatória moderada e severa

• Obstruçao tubária
• Falhas de IIU
• Endometriose
• ISCA

➜ Procedimento laboratorial – FIV

- Oocitos NAO denudados – Grau de maturação

nuclear?

- Concentração de espermatozoides (50.000 a

150.000 sptz móveis / oocito)

- Pre-incubação 30min

- Motilidade após incubação

- Incubação 16 a 18h

- Denudação – mecânica
➜ PICSI: Physiological Intracytoplasmic Sperm
➜ Injeção intracitoplasmática de espermatozóides
Injection
(ICSI): Indicações:
- Recomendado para:
- Fator masculino severo (oligozoospermia e
• Amostras com fragmentação de DNA astenozoopermia grave)
• Pacientes que tiveram embrioes de má
- Azoospermia (ausência de espermatozóides)
qualidade nos dias 3 e 5
• Pacientes com baixa taxa de fertilização - Pós-vasectomia
• Pacientes com baixas taxas de fertilização - Fator imunológico
• Amostras com alterações morfologicas
- Falha na fertilização dos óvulos na FIV
• Amostras oligoastenozoospermicas
convencional
➜ Preparos dos meios overnight:
➜ Micromanipulacão de gametas e embriões
- Placas com meios que necessitem que necessitem
- PZD: Dissecção Parcial da Zona Pelucida
incubação deverão ser preparadas no dia anterior
(ex. Global, HTF,meios sequenciais....) - SUZI: Inserção de Espermatozoides no Espaco
Perivitelinico
- Meios que não necessitem incubação poderão ser
preparados no dia anterior a punção e mantidos - ICSI: Injeção Intracitoplasmatica de
em tubos cônicos fechados para aquecimento Espermatozoides
Ex:(HTF-hepes)
 ➜ Agulha ICSI: Capturar o espermatozóide e injetar
no óvulo

- Placa de injeção (ICSI)

- Preparo no momento do uso

- Seleção e captura do sptz ➜ Seleção morfológica de espematozóides em alta

- Posicionamento do oocito magnificação para ICSI

➜ ICSI - Procedimentos de ICSI:

• Holding posicionada

• Corpúsculo Polar no sentido 12h ou 6h;

• Espermatozoide é imobilizado e sugado para

dentro da micropipeta;

• ZP e pressionada e perfurada, ate que penetre o

a membrana(3h);

• Espermatozoide e depositado no citoplasma e

micropipeta e retirada;

Aula prática 13/05/2023

- Indução ovariana: FSH ➜ É um hormônio que deve

ser injetado diariamente para os folículos crescerem

➜ Agulha de punção, é utilizada para aspirar o

folículo, ela vai para um tubo , depois se verte e, em
placa limpa, depois retira os óvulos e em plaquinha
menor e limpa com meio de cultivo

➜ Agulha de Holding: Para segurar, não perfura

 Mhtf meio utilizado no lado
de fora para lavar o óvulo
Mhtf puro/limpo
➜ Denudação: Remoção das células ao redor do
óvulo
➜ Embrião no 5° dia: BLASTOCISTO, precisa ou
congelar ou implantar no útero
➜ Palheta e criotubo: Servem para congelar o
sêmen
➜ Haste de congelamento: Congelar o embrião
➜ Stripper: É utilizado para denudação
➜ TODO meio de cultivo precisa ter soro, o soro é
proteico.
➜ Global: Sem soro (HSA)
➜ Global total: Com soro (HSA)
➜ Se mexer o meio e não formar espuma: Não tem
soro
➜ Se mexer o meio e FORMAR espuma: Já tem soro
➜ MHM, Global, servem para tudo, é um único meio
➜ Se tiver indicando para qual estágio utilizar, é um
meio SEQUENCIAL, Com tampão fosfato ou HEPESs
ou MOPS
➜ Meio com tampão Hepes ou Mops: São meio para
trabalhar em bancada, não sofrem alteraçãoes, é um
tampão forte, utilizado para espermatozóides ou
coleta de óvulos
➜ Meio com tampão fosfato: Utilizar dentro da
incubadora, reage com CO2
➜ Fenoret: Indicador de pH, cor normal:
Rosinha claro
➜ Existem meios sem indicadores de Ph
➜ Todo meio tem antibiótico: Gentamicina
Classificação embrionária:
➜ P1 e M1 são imaturos, não fertilizam
➜ M2 pode fertilizar
D1- Avalia o número de pró-nucleos (ideal é 2), sua
simetria e CNP
D2 e D3 – Avaliam a mesma coisa, n° de células (D2
– 2-4, D3 – 6-10), sua simetria, n° de núcleos
visíveis (Se for multinucleado é ruim), n° de
fragmentação
D4 – Avalia se está compacta ou em compactação,
fragmentação
D5 – Avalia o grau da Blastocele, grau da massa
celular interna e trofoectoderme
Blastocele (Grau)
1 – 25%
2 – 50%
3 – 90%
4 – 100% (Expandido)
5 – Eclodido
6 – Eclodiu (Zona pelúcida sumiu)
MCT/Trofoectoderme
A – Muitas células, fortemente aderidas
B – Muitas células, pouco aderidas
C – Poucas células, poco aderidas