Biotecnologia da reprodução – revisão

 Conteúdos:
1. Tecnologia de sêmen
2. Sêmen do epidídimo
3. Sêmen sexado
4. Inseminação artificial
5. Transferência de embrião

1. Tecnologia de sêmen
1.1 cálculo de sêmen
[anotações na folha A4 com exemplos]

1.2 conceitos gerais

 fluído natural produzido pelo sistema reprodutor masculino, constituído por
espermatozoides e plasma seminal (constituído pela secreção de glândulas anexas)
 durante o processamento é adicionado diluente ao sêmen
 funções do diluente: proteção do espermatozoide (evitar danos físicos durante o
transporte e auxiliar na proteção da membrana plasmática pelos danos do choque
térmico) e aumentar o período de viabilidade espermática, fonte de energia para a
célula espermática, inibir o crescimento bacteriano, manutenção do pH, efeito
tamponante, auxilia na manutenção da pressão osmótica
 o diluente é espécie-específico e sua composição varia conforme o tipo de
armazenamento de sêmen

1.3 sêmen fresco

 acabou de ser coletado do macho e será utilizado no menor tempo possível (em poucos
minutos), ou seja, o sêmen é coletado e utilizado quando o macho está próximo a fêmea
 oferece melhor taxa de prenhez quando comparado com outros
 pode ser utilizado em diferentes vias de inseminação, sendo a principal a intravaginal
 é possível ser utilizado sem adição de diluentes, porém não é recomendado pois reduz
o tempo de vida dos sptz
 espécies que utilizam: suínos, caninos, ovinos e equinos
 etapas de processamento: coleta > avaliação espermática > diluição > IA imediata

1.4 sêmen resfriado

 maior flexibilidade de tempo entre a coleta e inseminação (variando entre 24h a no
máximo 48h para transporte do material)
 o sêmen é armazenado em baixa temperatura entre 5° a 15° variando conforme espécie
e protocolo utilizado
 obrigatório a adição de diluente de resfriamento
 a viabilidade espermática começa a diminuir após 72 horas de armazenamento,
independentemente do diluente utilizado
 o transporte é realizado em caixas de isopor com gelo com em containers específicos
 após o resfriamento e antes da IA, deve-se separar uma alíquota de sêmen, aquece-la e
realizar a avaliação da qualidade espermática
 espécies que utilizam: suínos, caninos, ovinos e equinos
 etapas de processamento: coleta > avaliação > adição de diluente de resfriamento >
armazenamento sob resfriamento (para transporte) > nova avaliação pós-transporte >
IA

1.5 sêmen congelado

 possui maior flexibilidade de uso, visto que o tempo de armazenamento é maior
 possui uma taxa de prenhez menor comparada com as outras biotecnologias, pois o
processo de criopreservação possui alguns efeitos deletérios sobre os espermatozoides
 é mantido em palhetas imersas em nitrogênio líquido dentro de botijões
 o diluente adicionado é específico para congelamento
 protocolo base: coleta > avaliação > adição de diluente de resfriamento > centrifugação
> descartar o sobrenadante (plasma) > ressuspensão do pellet (somente as células do
sêmen) > adição do diluente de congelamento > colocar as doses em palhetas e lacrá-
las > resfriamento > palhetas sob o vapor de nitrogênio líquido (maior redução da T°) >
imersão em nitrogênio liquido
 o descongelamento é realizado com as palhetas são imersas em banho maria a 37° por
alguns segundos
 uma nova avaliação da qualidade espermática deve ser realizada após o
descongelamento e antes da IA
 espécies que utilizam: bovinos, ovinos, caninos e equinos

2. sêmen do epidídimo
2.1 conceitos gerais
 a espermatogênese ocorre no interior dos túbulos seminíferos dentro dos testículos
 a maturação do espermatozoide ocorre no epidídimo, começando na cabeça e
terminando na cauda
 durante o trajeto epididimários irão: adquirir capacidade de fertilização, se livrar da gota
citoplasmática, apresentar motilidade baixa
 a coleta de sptz do epidídimo é realizada em situações que o reprodutor veio a óbito e
para estoque de espermatozoides em espécies ameaçadas de extinção
 a avaliação espermática deve ser realizada imediatamente após a coleta
 os espermatozoides da cauda do epidídimo apresentam baixa motilidade devido a
presença de imobilina, que reduz o gasto de energia desnecessária

2.2 aspiração microcirúrgica

 realizada no animal ainda vivo
 é necessário submeter o paciente a anestesia e analgesia adequada
 procedimento: abordagem aberta (incisão de todas as camadas até o epidídimo) >
túbulos epididimários incididos > aspiração do conteúdo com tubo apropriado

2.3 aspiração percutânea

 realizada em animal vivo submetido a anestesia e analgesia
 é pouco invasiva, sem abordagem aberta
 procedimento: inserção de agulha na cauda do epidídimo e aspiração do conteúdo

2.4 técnica de flutuação

 realizada em animal morto
 procedimento: o testículo junto com epidídimo é removido > o ducto diferente é ligado
> material imerso em solução estéril para transporte até o laboratório > lavagem do
material para remoção de sujidades > a cauda do epidídimo é cuidadosamente separada
e dissecada > realização de múltiplo cortes no epidídimo colocados dentro de diluente
aquecido e rico em nutrientes por alguns minutos > migração dos espermatozoides para
o meio (diluente)
 apresenta maior contaminação por sujidades (microrganismos, sangue, debris
celulares)
 principal recomendação é para testículos pequenos

2.5 técnica de fluxo retrógrado

 realizada em animal morto
 procedimento: o testículo junto com epidídimo é removido > o ducto diferente é ligado
> material imerso em solução estéril para transporte até o laboratório > lavagem do
material para remoção de sujidades > a cauda do epidídimo é cuidadosamente separada
e dissecada (incluindo os túbulos epididimários e ductos deferentes) > na ponta do
ducto deferente é acoplada uma seringa com o diluente (lavagem)
 maior número de células recuperadas com menor contaminação por sujidades
 requer mais experiencia e muita habilidade manual
 recomendada para testículos grandes (bovinos, equinos, ovinos)

3. sêmen sexado
3.1 conceitos gerais
 é a separação dos espermatozoides baseado na diferença do conteúdo de DNA
(cromossomos X ou Y), resultando na possibilidade de escolher o sexo do produto antes
da IA
 o espermatozoide fêmea possui cerca de 4% mais material genético que o
espermatozoide macho
 a escolha tem grande importância econômica pois está conectada com o desempenho
produtivo e reprodutivo
 fêmea = maior valor em propriedades de produção de leite; macho = maior valor em
propriedade de gado de corte
 para o uso do sêmen sexado deve-se levar em consideração as particularidades e
objetivos de cada propriedade
 vantagens: poder escolher o sexo do produto com acurácia de 85% a 95%, maior
intensidade de seleção zootécnica acelerando o melhoramento genético do rebanho,
mais fêmeas de reposição na propriedade com qualidade sanitária.
 Limitações: preço mais elevado na dose de sêmen, necessidade de protocolos e manejo
intensivo, menor taxa de concepção quando comparado ao sêmen convencional
 Atualmente o uso de sêmen sexado é mais pronunciado em bovinos

3.2 procedimento
 passagem do ejaculado pela citometria de fluxo que seleciona as células espermáticas
baseadas na quantidade de DNA
 resultado: espermatozoides com X, espermatozoides com Y e espermatozoides
indefinidos (descartados)
 a velocidade de separação é lenta: 3.000 a 4.000 células por minuto para cada sexo =
procedimento demorado e caro
 após a separação dos espermatozoides > procedimento de congelamento >
armazenamento em palhetas imersas em nitrogênio líquido por tempo indefinido
 dose inseminante 2 a 10x106 espermatozoides (dose menor que a convencional), devido
ao alto custo de produção por dose
 para aumentar as taxas de concepção, os protocolos de IATF com uso de sêmen sexado
envolvem indutores de ovulação, métodos de detecção de sinais de estro e uso de duas
inseminações em um intervalo de poucas horas

4. inseminação artificial
4.1 conceitos gerais
 é a deposição de sêmen de forma artificial no interior do sistema reprodutivo da fêmea
 vantagens: acelerar o melhoramento genético através da escolha de sêmen de
reprodutores de alto padrão, evitar o transporte de animais, reduzir as chances de DSTs,
eliminar a chance de acidentes durante a cópula entre animais importantes, permitir o
uso de espermatozoides de reprodutores que já vieram a óbito (sêmen congelado),
facilita a reprodução em cativeiro utilizando sêmen congelado de espécies com risco de
extinção, maior controle reprodutivo do rebanho
 limitações: Maior custo de procedimento (mão de obra especializada, equipamentos,
materiais, etc), detecção de fêmeas em estro que exige treinamento, tempo e técnica
adequada para cada espécie
 o local de deposição do sêmen varia conforme a espécie e o tipo de sêmen (fresco,
resfriado ou congelado)
 a IA pode ser: vaginal (sêmen depositado na vagina), cervical (sêmen depositado na
cérvix) ou intrauterina (sêmen depositado dentro do útero)
 a meta é sempre colocar o sêmen o mais próximo possível do oócito
 o sucesso da IA depende de muitos fatores: bom manejo reprodutivo, calendário
sanitário, manejo alimentar eficiente, mão de obra disponível, fêmeas devidamente
identificadas

4.2 deposição do sêmen durante a monta x detecção do estro x coleta de sêmen

 SUÍNOS: ejaculação intrauterina; detecção é feita através do reflexo de tolerância a
monta, aplicando pressão na região lombar da porca avaliando se ela fica em posição
estática, indicando o cio e também através de protocolos hormonais para manipulação
do estro; a coleta de sêmen é realizada pelo método de mão enluvada, com o cachaço
montando no manequim, para a IA é utilizado sêmen fresco ou resfriado depositado via
intrauterina com auxilio de pipetas em formado de saca rolha (facilita a passagem pela
cérvix
 BOVINOS: ejaculação vaginal; detecção realizada pela visualização do rebanho,
considerando que fêmeas no cio permitem a monta por rufiões e outras fêmeas;
normalmente são utilizados protocolos de IATF (baseado na administração de
hormônios) sendo desnecessário a observação de fêmeas em estro; a coleta de sêmen
é realizada com auxilio de vagina artificial, massagem de glândulas anexas ou
eletroejaculador; é utilizado sêmen congelado para IA intrauterina com auxílio de um
aplicador
 OVINOS: ejaculação vaginal; detecção de fêmea em estro é necessário o uso de rufião
com tinta aplicada no peito, também podendo ser aplicados protocolos hormonais de
IATF; o sêmen é coletado com auxílio de vagina artificial ou eletroejaculador;
rotineiramente pode ser utilizado sêmen fresco, resfriado ou congelado; a deposição do
sêmen é cervical (sêmen fresco ou resfriado) no primeiro anel cervical (ovinos), em
caprinos a cérvix é tracionada com auxilio de pinças para facilitar sua transposição sendo
possível a realização de inseminação intrauterina de forma não-cirúrgica; para sêmen
congelado é necessária abordagem cirúrgica para deposição intrauterino por via
laparoscópica
 CANINOS: ejaculação vaginal; detecção de estro é realizada através da observação de
sinais comportamentais associados a citologia vaginal; a coleta é realizada pela técnica
de mão enluvada; a inseminação vaginal é realizada com sêmen fresco ou resfriado; a
inseminação com sêmen congelado é depositado dentro do útero com auxílio de
endoscópio e pipeta de inseminação
 EQUINOS: ejaculação intrauterina; detecção de estro é realizada através da observação
do comportamento quando exposta a um rufião devidamente contido ou por
monitoração da dinâmica folicular por palpação retal associada a ultrassonografia,
alguns hormônios podem ser administrados para encurtar a fase lútea ou a fase de estro
sendo necessária a monitoração do folículo ovariano; o sêmen é coletado do garanhão
com auxílio de vagina artificial; a deposição de sêmen é via intrauterina tanto para
sêmen fresco, resfriado ou congelado

5. Transferência de embrião
5.1 conceitos gerais
 é a retirada de um embrião do útero de uma fêmea doadora e transferi-lo
artificialmente para o útero de uma fêmea receptora, que irá ser responsável por gestar,
parir e cuidar do filhote
 objetivo: aumentar o número de filhotes produzidos por fêmea
 vantagens: geração de maior numero de filhotes por fêmea de alto valor zootécnico,
comercialização de embriões congelados, evitar o transporte de animais transportando
apenas o embrião congelado, reproduzir doadoras com alterações no sistema
locomotor que impossibilita a monta e gestação, reproduzir fêmeas que estejam
participando de competições esportivas
 limitações: maior custo, necessidade de mão de obra qualificada, necessidade de
manejo intensivo, qualidade de receptoras

5.2 doadora
 fêmea de alto valor genético que dará origem ao embrião (geralmente escolhida pelo
proprietário)
 a doadora é selecionada com base na idade, peso, condição uterina, comportamento,
se há alterações musculoesqueléticas e desenvolvimento mamário, avaliando o
histórico reprodutivo
 em equinos deve-se realizar um exame reprodutivo completo da égua doadora, sendo
ideal a avaliação de um ou de dois ciclos estrais antes da sua utilização na técnica de TE

5.3 receptora
 fêmea que irá receber o embrião, gestar e parir o filhote
 as receptoras selecionadas devem: estar saudáveis, com boas condições corporais,
tamanho compatível com a doadora, fáceis de manejar, que apresentam ciclos
regulares, habilidade materna e sem histórico de alterações reprodutivas
 antes de ser receptora, a fêmea deve ser avaliada através de exame ginecológico
 em equinos: para cada doadora, deve-se ter 3 receptoras
 para bovinos: para cada doadora, deve-se ter no mínimo 10 receptoras

5.4 sincronização da ovulação

 primeira etapa da TE
 pode ser feita com protocolos hormonais
 ruminantes: nas fêmeas doadoras são utilizados hormônios que estimulam a
superovulação sendo realizada IA em horário pré-determinado permitindo a coleta de
mais de um embrião por lavado; nas receptoras devemos saber apenas a data da
ovulação (sem superovulação e sem IA)
 equinos: utilização de hormônios que reduzem a fase lútea e indutores de ovulação para
sincronização da doadora com a receptora (a doadora será inseminada, a receptora
não); coleta de 1 embrião por lavado, normalmente 7 dias após a inseminação

5.5 coleta do embrião

 em bovinos e equinos a coleta pode ser feita por via transcervical através da introdução
de uma sonda uterina conectada a um filtro coletor, do qual o embrião é resgatado
durante a lavagem uterina
 procedimento em bovinos e equinos: reto esvaziado e área perineal lavada e seca >
transposição da cérvix com o dedo indicador > posicionamento da sonda uterina > após
passar a cérvix deve-se inflar o balonete e tracioná-lo caudalmente até obstruir o óstio
cervical interno > introdução da solução de lavagem no lúmen uterino através da sonda
> recuperação do embrião juntamente com a solução de embrião diretamente no copo
coletor específico > procedimento de rastreamento e classificação
 em ovinos a coleta é realizada por via cirúrgica, pois a cérvix não permite a passagem
de sonda
 procedimento: laparotomia > exposição do útero > introdução da sonda até o lúmen
uterino > lavagem > conteúdo do filtro deve ser avaliado sob uma lupa procurando o
embrião e classificado

5.6 classificação do embrião

 quanto ao estagio de desenvolvimento e qualidade
 influencia diretamente na chance de gestação da receptora
 o estágio de desenvolvimento inclui: oócito não fertilizado, mórula e blastocisto em suas
diferentes fases
 a qualidade inclui: excelente, bom, regular e pobre
 após o classificado, o embrião é lavado com solução apropriada conforme a espécie
 o embrião pode ser transferido imediatamente, resfriado ou criopreservado

5.7 inovulação (transferência imediata)

 é a deposição do embrião no útero da receptora
 para isso o embrião é aspirado para uma palheta ou pipeta estéril
 em bovinos e equinos a inovulação é realizada por via transcervical (técnica semelhante
a de IA) (fêmea em diestro = maior dificuldade de transpassar a cérvix)
 em equinos o embrião pode ser depositado em qualquer local do útero, pois o embrião
migra entre os cornos e o corpo
 em ruminantes o embrião precisa ser depositado no corno ipsilateral a ovulação
(mesmo lado do corpo lúteo)
 em ovinos a inovulação é cirúrgica (laparotomia) no corno ipsilateral a ovulação

5.8 etapas
 sincronização da ovulação entre doadora e receptora > IA da doadora > coleta de
embrião da doadora > procura do embrião > classificação embrionária > manipulação e
lavagem do embrião > inovulação da receptora
 após a inovulação deve-se esperar alguns dias para realizar o diagnóstico de gestação