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CHECKPOINT MITTICO

Eduardo Montagner Dias (Adaptao do texto de Niara Oliveira)

Durante o ciclo celular a clula passa por uma srie de eventos seqenciais, onde um passo tem de ser completado antes que o prximo seja iniciado. Essa progresso linear alcanada de duas maneiras: cada etapa requer um produto da etapa anterior para seu incio ou h um mecanismo regulatrio de feedback, que assegura que a etapa subseqente do ciclo celular no seja iniciada antes que um evento crucial tenha sido completado corretamente. As clulas eucariticas desenvolveram mecanismos de controle de qualidade, coletivamente chamados de checkpoints, que asseguram a correta execuo dos eventos do ciclo celular, garantindo, dessa forma, a estabilidade gentica. O checkpoint um mecanismo de feedback que monitora a execuo do ciclo celular e inibe o incio de eventos subseqentes at que os processos da etapa anterior sejam executados com sucesso. Atualmente, h trs checkpoints descritos: checkpoint de dano do DNA, que est apto a bloquear o ciclo celular nas fases G1, S, G2 e mitose; checkpoint de replicao do DNA, que monitora a progresso atravs da fase S; checkpoint do fuso mittico (mitotic spindle checkpoint), que monitora a ligao dos cromossomos aos microtbulos (descrito pela primeira vez em 1991). ESTRUTURA Em geral, todos os checkpoints apresentam uma estrutura comum composta de trs componentes essenciais: - um sensor, que monitora o processo; - um transdutor, que sinaliza quando um processo no se completa adequadamente; - um alvo, que responde ao sinal, inibindo eventos subseqentes. PRINCIPAIS COMPONENTES Diversas molculas tm sido descritas como componentes do checkpoint. As primeiras anlises genticas foram feitas em fungos (Saccharomyces cerevisiae) e posteriormente foram descobertos genes homlogos no genoma humano. H duas principais famlias de protenas envolvidas nesse mecanismo: - famlia MAD (mitotic arrest deficient), composta por MAD1, 2 e 3. Destaca-se entre elas a MAD2, uma pequena protena composta por 205 aminocidos, codificada pelo gene de mesmo nome localizado no cromossomo 4q27. A MAD2 encontrada, em grandes quantidades, associada aos cinetcoros no-ligados aos microtbulos durante a metfase. A interao entre a MAD2 e outros componentes adicionais do checkpoint com os cinetcoros noligados permite o bloqueio do incio da anfase, prevenindo a segregao cromossmica desigual. - famlia BUB (budding uninhibited by benzimidazole), composta por BUB1, 2 e 3. Ateno especial para BUB1, uma protena com atividade GTP-ase, codificada pelo gene de mesmo nome localizado no cromossomo 2q12-14. A BUB1 interage diretamente com a MAD2, na sinalizao para o atraso da anfase. COMO FUNCIONA O checkpoint do fuso mittico monitora a ligao dos cromossomos aos microtbulos durante a diviso celular e est apto a impedir a progresso desse processo, a fim de que possa garantir a segregao idntica do material gentico entre as clulas-filhas e preservar a integridade do genoma em nvel cromossmico.

No incio da diviso celular, uma protena especializada, denominada cinetcoro, localizada em cada cromtide na regio centromrica, captura os microtbulos que vm de cada um dos plos opostos da clula. A duplicao do material gentico e a separao em duas clulas-filhas so eventos crticos na diviso celular. Para a manuteno da integridade do genoma, todas as cromtidesirms tm que estar ligadas, atravs de seus cinetcoros, a microtbulos do fuso oriundos de plos opostos da clula. A separao concomitante das cromtides permite a herana de um conjunto idntico de cromossomos para cada clula-filha. Se a clula inicia a anfase e comea a segregao cromossmica sem que todos os pares de homlogos tenham estabelecido conexes com ambos os plos do fuso, algumas clulas iro herdar duas cpias de um cromossomo, enquanto outras, nenhuma. Um nico cinetcoro que no esteja ligado adequadamente ao microtbulo correspondente gera um sinal inibitrio, que atrasa a progresso da mitose, at que haja ligao correta. Tambm, se o microtbulo ligado ao cinetcoro no estiver exercendo tenso adequada neste, ativado o mecanismo de controle. IMPORTANTE! O cinetcoro, antes visto apenas como o local de ligao dos microtbulos, agora considerado essencial pois a principal estrutura que sinaliza para a ativao do checkpoint! atravs desse mecanismo de vigilncia que atua o checkpoint mittico. Para que a clula entre na anfase, duas condies devem ser satisfeitas: (1) o conjunto completo de microtbulos deve estar ligado aos cinetcoros, garantindo a captura de todos os cromossomos pelo fuso, e (2) deve haver ligao adequada entre os cinetcoros das cromtides-irms, garantindo que o cromossomo esteja alinhado na placa metafisria. CONTROLE MOLECULAR DA MITOSE Para entendermos como se d em nvel molecular a regulao da mitose pelo checkpoint, precisamos saber como o controle molecular de uma mitose normal. A permisso para o incio da mitose dada pelos checkpoints do DNA da fase G2 do ciclo celular. Essa permisso traduzida bioquimicamente pela ativao do complexo MPF (mitosis promoting factor). Este complexo responsvel por desencadear eventos celulares caractersticos da mitose: quebra da membrana nuclear, separao dos centrossomos, formao do fuso mittico, condensao dos cromossomos e fragmentao do complexo de Golgi. No final da metfase, h ativao do complexo APC (anaphase promoting complex), um dos principais elementos da maquinaria proteoltica celular. O complexo APC controla a separao dos homlogos e sua migrao para plos opostos da clula atravs da degradao de protenas que mantm as cromtides-irms unidas. Protenas responsveis pela manuteno das cromtides-irms unidas: Coesina: une as cromtides-irms; Separase: lisa subunidades de coesina; Securina: associada separase, inativando-a. Para a progresso da anfase, o APC conjuga ubiquitina s securinas. Assim, as securinas perdem sua funo e no iro mais inativar a separase. A separase, ento, estar livre para lisar as subunidades de coesina, permitindo a separao das cromtides-irms e migrao das mesmas para plos opostos da clula, com finalizao da mitose. Deve-se salientar que a ubiquitinao da securina pelo APC requer a ligao deste complexo protena Cdc20, porque esta ativa o APC e permite a sua interao com a securina.

Intrfase: ativao do Fator Promotor da Mitose (MPF)

Incio da Mitose (prfase metfase)

Ativao do Complexo Promotor da Anfase (APC/Cdc20)

Incio da Anfase e progresso da diviso celular

Fim do ciclo de diviso Intrfase

MECANISMO MOLECULAR DO CHECKPOINT MITTICO Quando no h ligao dos microtbulos aos cinetcoros correspondentes ou quando no h tenso adequada na ligao, os cinetcoros produzem continuadamente um sinal que ativa o mecanismo de checkpoint. A sinalizao bioqumica culmina em interaes moleculares entre MAD, BUB e o APC, atrasando a segregao cromossmica. MAD e BUB inativam o APC atravs de ligao direta ao Cdc20. O complexo MAD2/BUB1/Cdc20 que formado constitui o MCC (Mitotic Checkpoint Complex) e impede o funcionamento do APC, retardando o incio da anfase at que todos os cinetcoros estejam adequadamente ligados aos microtbulos. Abaixo, esto esquematizadas duas formas de inativao do APC por meio de sinal bioqumico emitido pelo cinetcoro no ligado a microtbulos.

Sinal catalisa unio MAD-BUBCdc20, que inativam APC.

ou

Sinal fosforila APC e promove sua associao com MAD-BUB-Cdc20.

Quando h ligao do ltimo cinetcoro aos microtbulos, cessa a sinalizao bioqumica e tambm a produo de MCC, permitindo ao Cdc20 se dissociar de MAD2 e BUB1 e se ligar ao APC. O resultado final desse processo a ativao do APC com conseqente degradao das securinas, dando continuao ao ciclo celular entrada em anfase.

Em suma, o processo o seguinte:

ERROS NO PONTO DE CHECAGEM DO FUSO Erros no ponto de checagem do fuso, por mutaes em genes que codificam elementos que participam desse processo (ex: Mad2, Bub1), produzem elevadas taxas de eventos de segregao cromossmica desigual, formando clulas portadoras de um conjunto cromossmico alterado. As mutaes que comprometem o ponto de checagem do fuso durante o processo mittico contribuem para a instabilidade cromossmica, gerando anomalias cariotpicas. Se a clula inicia a anfase e comea a segregao cromossmica sem que todas as cromtides tenham estabelecido conexes com ambos os plos do fuso, algumas clulas iro herdar duas cpias de um cromossomo, enquanto outras, nenhuma. Rearranjos cromossmicos e aneuploidias so marcadores de clulas tumorais, sugerindo que a falha no ponto de checagem do fuso um passo fundamental na converso de uma clula normal em um cncer. Alm disso, perdas momentneas de funo do checkpoint em mitoses ps-zigticas podem produzir mosaicismos cromossmicos para determinada trissomia (ex: Sndrome de Down). Apesar do maior interesse cientfico ao estudo do checkpoint mittico (pela conseqente produo de clulas neoplsicas), esse mecanismo tambm est presente durante a meiose. E, da mesma forma, erros no ponto de checagem do fuso produzem alteraes cariotpicas que, nesse processo de diviso celular, determinam a formao de gametas cromossomicamente alterados. Esses gametas aneuplides podero dar origem a crianas sindrmicas ou ser a possvel causa de abortamentos espontneos, pois o zigoto formado possui malformaes incompatveis com a vida (ex: 47, XX+16).

MIO E SE

Estudos sobre a funo do checkpoint durante a meiose mostraram que a inativao do ponto de checagem por uma mutao na MAD2, por exemplo, leva a um grande aumento na taxa de segregao cromossmica desigual durante a meiose I, mas parece no aumentar significativamente a taxa de erro para a meiose II. Uma possvel explicao para o fato da ausncia do ponto de checagem do fuso ntegro comprometer a meiose I diferentemente da meiose II que os cromossomos so mantidos unidos de maneiras diferentes nos dois processos. Na meiose II, as cromtides-irms esto conectadas diretamente umas as outras pelos seus centrmeros, o que pode evitar que ambos os cinetcoros se liguem a microtbulos provenientes do mesmo plo do fuso. Na meiose I, devido aos locais de recombinao, o par de homlogos mantido unido pelos quiasmas ao longo de seus braos, em locais especficos. Quanto maior o cromossomo, maior a distncia entre o centrmero e o local de recombinao, criando uma ligao mais flexvel entre os cinetcoros dos dois homlogos. Essa flexibilidade pode fazer com que os cinetcoros dos dois homlogos se tornem funcionalmente mais independentes, aumentando, assim, a incidncia de eventos onde ambos os pares de cromtides se liguem a microtbulos provenientes do mesmo plo do fuso. IMPLICAES CLNICAS As alteraes no ponto de checagem do fuso esto relacionadas: - ao incio do processo neoplsico: altos nveis de instabilidade cromossmica relacionados a alteraes no mecanismo do checkpoint mittico foram encontrados em diversos tipos de clulas tumorais, entre elas, adenocarcinoma e carcinoma de pequenas clulas de pulmo, adenocarcinoma colorretal, hepatocarcinoma e carcinoma ductal invasor de mama. - formao de zigotos com conjunto cromossmico alterado, levando a abortos espontneos ou nascimento de crianas sindrmicas. CATSTROFE MITTICA Processo de morte celular que ocorre durante a mitose (precisamente na metfase) e que resulta de uma combinao de checkpoints ineficientes (particularmente do checkpoint de dano do DNA e do checkpoint do fuso mittico) e de dano celular. Este dispositivo molecular de morte da clula danificada previne a aneuploidia e, conseqentemente, a oncognese. A base molecular da catstrofe mittica contempla a ativao de caspases pelo citocromo c. As caspases so responsveis por interferir na permeabilidade da membrana mitocondrial, com desestruturao dessa organela. H, ento, falta de energia para a clula, que tem conseqente retrao do citoplasma celular, fragmentao nuclear e cromatinlise.

O mecanismo de catstrofe mittica tambm est sujeito a erros. Existem inibidores das caspases e agentes que inibem o aumento na permeabilidade da membrana mitocondrial que podem impedir o processo de catstrofe mittica. No havendo morte celular por meio deste mecanismo, estar favorecido o desenvolvimento neoplsico.