Alessandra Baub

Katherinne Lima
Lucas Calimrio
Nlio Jnior
Cromatografia de Afinidade
Purificao de protenas
recombinantes

O que ?
uma tcnica que utiliza as
propriedades fsicas e qumicas para a
separao dos componentes de uma
mistura proteica. Baseada na capacidade
de uma protena/componente se ligar
especificamente a outra partcula.
As colunas contem esferas ligadas
covalentemente a anticorpos especficos
da protena interesse.
As partculas so depois eludas por uma
soluo concentrada ligando, pH
diferente do de ligao.



Como funciona?
Se baseia numa especificidade
biolgica da protena que se
pretende analisar, tal como a
afinidade de enzima a um
substrato ou a ligao entre
antgeno anticorpo.
No que consiste?
Consiste na separao de
protenas de uma mistura e
dividida em duas fases: uma
estacionria, aonde a protena a se
analisar se liga a polmeros com
ligantes especficos contidos na
parede do tubo; e outra, aonde h a
eluio das protenas indesejadas
restando somente aquela a ser
estudada.
Fase estacionria
Na fase estacionria, a protena de interesse se
liga ao composto contido no tubo. Por exemplo:
numa mistura de protenas A, B, C e D,
desejamos estudar a protena A, que se liga
facilmente com glicose. Portanto, a parede do
tubo aonde essa mistura ser despejada conter
glicose, que logo atrair a protena A para si,
consequentemente separando-a das demais, que
sero filtradas do tubo.

Eluio
Aps restar no tubo apenas os ligante comas
protenas de interesse, despejado no tubo uma
soluo contendo os mesmos ligantes contidos na
parede do tubo ou reagente desnaturantes (uria,
guanidina, etc) desprendendo a protena da parede
do tubo. No exemplo, adicionado uma soluo de
resduos de glicose que fazem com que a protena
A se desprenda da parede do tubo, sendo
despejada, em meio a soluo, em outro tubo para
estudo
CONCLUSO
Um dos mtodos mais
eficientes para a
purificao de
protenas,
possibilitando um alto
rendimento com
nmero reduzido de
etapas.

A separao de
molculas tem como
base a interao
especfica do analito
(molcula-alvo) com
um ligante imobilizado
na matriz. Foras
envolvidas nessa
interao podem ser
no covalentes
(eletrostticas,
hidrofbica, pontes de
H) ou covalentes (p.e.,
ponte dissulfeto).

Tipos de ligantes da cromatografia
de afinidade
1- Mono especficos:
- ligao especfica da molcula-alvo
-anlogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antignicos de
anticorpos
- ligantes com tag ou marcao
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina

2- Ligantes para separao de grupos

ligante para protenas com
afinidade por cAMP ou cGMP)
Stios de ligao das
protenas A, G e L
imunoglobulina, que
permitem a purificao de
anticorpos por
cromatografia de afinidade