PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOPRODUTOS E BIOPROCESSOS

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO CAMPUS BAIXADA SANTISTA

Yessotoxina, uma toxina marinha, exibe atividades

antialérgicas e antitumorais, inibindo o crescimento de
tumores de melanoma em um modelo pré-clínico

RAYSSA FANNY FRANCO

 INTRODUÇ
ÃO
• Yessotoxinas  toxinas poliéter, lipossolúveis
• Dinoflagelados; Fonte: nordicmicroalgae.org

• Protoceratium reticulatum;
• Lingulodinium polyedrum e 
• Gonyaulax spinifera

Bioluminescência
 Yessotoxinas

Origem da cepa

Fonte: Alfonso, A.; Vieytes, M.R.; Botana, L.M. Yessotoxin, a Promising

Therapeutic Tool. Mar. Drugs 2016, 14, 30. https://doi.org/10.3390/md14020030
 Morte
Celular
Doença de
Alzheimer Autofagia

Metabolismo
Da Glicose YTX Efeito
Citotóxico
in vitro
Citoesqueleto e
adesão celular
Sistema
imune

Adaptado de: Alfonso, A.; Vieytes, M.R.; Botana, L.M. Yessotoxin, a Promising
Therapeutic Tool. Mar. Drugs 2016, 14, 30. https://doi.org/10.3390/md14020030
 Efeito Biologia dos mastócitos (MCs)
Antialérgico

Efeito
Citotóxico
in vivo
Materiais e
Métodos
Reagentes
• YTX (pureza ≥ 99%) dissolvido em metanol
• 4-Nitrofenil N-acetil-β-D-glucosaminida
(pNAG);
• Solução de iodeto de propídio;
• DNP-albumina de soro humano (DNP-HSA)
;
• 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]- Brometo de 2,5-
difeniltetrazólio (MTT);
• Anexina V-FITC e Tampão de Ligação de
Anexina V 10X;
• HEPES (agente tamponante de Ácido
Sulfônico);
• Cloreto de Sódio (NaCl);
• Cloreto de Magnésio (MgCl2 );
• Glicose;
• Triton X-100 (surfactante não iônico)
• Cloreto de Cálcio (CaCl2)
• Albumina de soro bovino (BSA) 
• Anti-DNP-IgE monoclonal de camundongo
• Cepa C57/BL6 foi criada e mantida nas instalações de animais do Centro de Pesquisa em Inflamação.
• Experimentos feitos de acordo com o Comitê de Ética

Gaiola:
Local livre de Ciclo:
30x20x13
patógenos 12h luz/12h escuro
(CxLxA)

Camundongos Alimentos e água

estéreis (a vontade)

• Grupo Não Tratado

• Veículo
• Yessotoxina
 Células e linhas celulares
Medula ó ssea de Mastócitos Derivados de
medula óssea (BMMCs) IMDM
camundongos C57BL/6.

• 15% de soro fetal bovino (FBS)

CO2
• 1 mM de piruvato de sódio
• 100 μM de aminoá cidos nã o essenciais
• 100UI/mL de penicilina; 100μg/mL
Camundongos
de estreptomicina
• 0,05mM de 2-mercaptoetanol ≥ 99%
• Suplementado com 10 ng/mL de
• Atmosfera de 5% de CO2 interleucina-3 e 10 ng/mL de Fator de
• 5 semanas  95% MCs foram Células-Tronco
avaliadas (azul toluidina)
 Células e linhas celulares
MEC1 (linhagem
Linha melanoma Linha melanoma B16F10
celular humana LFC)
(linhagem celular de
RBL-2H3 camundongo

•  37°C em meio DMEM- •  37°C em meio DMEM-Glutamax •  37°C em meio RPMI-Glutamax;

Glutamax High High Glucose; • 10% de FBS, 100UI/mL de
Glucose; • 10% de FBS,; penicilina ;
• 10% de FBS; • 100UI/ mL penicilina; • 100μg/ mL de estreptomicina;
• 100UI/ mL penicilina; • 100μg/mL estreptomicina;
•  1mM de piruvato de só dio;
• 100μM de aminoá cidos nã o
essenciais;
Atmosfera 5% de CO2
• 0,05mM de 2-mercaptoetanol ≥
99% 
 Medição de liberação de β-hexosaminidase

Incubação Fluido anti-DNP Ressuspensão 500μL de

Células 1:10.000 IgE monoclonal *Tampã o Tyrode Células
1h antes

Metanol YTX
100% (30 min) (30 min)
*Composição Tampão Tyrode:
• 20mM HEPES pH 7,2,
• 137mM NaCl, 0,5% de Triton
• 5mM KCl, 1mM X-100
• MgCl2 , 1,8mM CaCl2 , 
• 5,6mM glicose, Citfluorometria Gelo (10min) DNP-HSA
• 0,5mg/mL BSA) de fluxo (45min)
 Determinação da viabilidade celular

Incubação Lavagem Incubação

500μL de MTT
Células YTX
*Tampã o Tyrode 30 min/37°C
1:10.000
Centrifugação/
Ressuspensão
100μL de H2O

Densidade óptica 0,5% de Triton

X-100
 Determinação da apoptose/necrose

Incubação Lavagem Ressuspensão

500μL de 100μL 1X AttachinV
Células YTX
*Tampã o Tyrode 30 min/37°C Binding Buffer
1:10.000

2,5μg/mL de iodeto
de propídio (PI)

Resultados: 5μL de AnnexinV-FITC

(15min)
• Negativos para Anexina V-FITC/PI  Células vivas
• Positivas para Anexina V-FITC e Negativas para PI  Apóptóticas
• Positivas para Anexina V-FITC e para PI  Apoptóticas tardias Citometria de
• Negativas para Anexina V-FITC e Positivas para PI  Necróticas fluxo
 Modelo de camundongo B16F10 de melanoma subcutâneo

100μg/Kg de YTX YTX (20μg/Kg e 10μg/Kg) Volume do tumor sólido:

Ou veículo volume = (comprimento x largura 2 )/2
B16F10 em
100μL de PBS

• Monitoramento de sinais de toxicidade;

• Nenhum apresentou sinais;
• Parâmetros hematológicos  linfócitos,
5 a 10 dias monócitos, neutrófilos/granulócitos, eritrócitos e
depois Tumor Palpável
plaquetas
50 mm³

5 dias de tratamento
 Medição de captação de glicose em
modelo de camundongo B16F10 de Análise estatística
melanoma subcutâneo

• 100μL de RediJect 2-DG

Fluorescent Imaging Probe
• Captação de glicose – proliferação
celular = Crescimento do tumor • Análise de Variância (ANOVA)
• Imagens de luminescência foram • Probalidade 0,5
capturadas e analisadas em software

•  5mg de Ketamina + 20mg de

Xilacin diluídos em PBS e
injetados intraperitonealmente
RESULTADO
S
 + YTX Removido
- YTX Presente

Figura 1 - Efeito do YTX na liberação de β-hexosaminidase induzida por IgE/Ag em RBL-2H3 e BMMCs.
Figura 2 - Efeito do YTX na viabilidade celular de RBL-2H3 e BMMCs.
Figura 3 - O tratamento com YTX induziu apoptose e necrose na linhagem celular RBL-2H3.
Figura 4 - Efeito do YTX na viabilidade da linha celular MEC1 e B16F10.
Figura 5 - O tratamento com YTX induziu apoptose em células B16F10.
Figura 6 - O tratamento com YTX diminui o desenvolvimento do tumor no modelo de camundongo com melanoma
B16F10.
Discussão
• liberação de β-hexosaminidase  Máx 25% de inibição em BMMCs e RBL-2H3
• MCs não tumorais  Resistência – toxicidade a 100nM após 72h
• YTX induz 3 vias de morte celular  Apoptose, Paraptose e Autofagia
• Apoptose  via principal de morte celular
• B16F10 (melanoma murino agressiva) linhagem mais sensível a YTX
 • Adminstração subcutânea  redução do melanoma
em 82%
• Esquema de Administração: 100μg/Kg seguida de 4 injeções
adicionais com a dose diminuída, (20 e 10μg/Kg)

YT Atividade
anticancerígena in
X vivo
 REFERÊNCIA
S
• Tobío A, Alfonso A, Madera-Salcedo I, Botana LM, Blank U. Yessotoxin, a
Marine Toxin, Exhibits Anti-Allergic and Anti-Tumoural Activities Inhibiting
Melanoma Tumour Growth in a Preclinical Model. PLoS One. 2016 Dec
14;11(12):e0167572. doi: 10.1371/journal.pone.0167572.

• Alfonso, A.; Vieytes, M.R.; Botana, L.M. Yessotoxin, a Promising Therapeutic

Tool. Mar. Drugs 2016, 14, 30. https://doi.org/10.3390/md14020030
• Paumet F, Le Mao J, Martin S, Galli T, David B, Blank U, et al. Receptores solúveis de
proteínas de fixação de NSF (SNAREs) em mastócitos RBL-2H3: papel funcional da
sintaxina 4 na exocitose e identificação de um compartimento secretor contendo
proteína 8 de membrana associada à vesícula . J Immunol . 2000; 164 ( 11 ): 5850-7.