FATORES DE VIRULÊNCIA DE

E. COLI

Prof. Dr. Cláudio Roberto Nóbrega Amorim

Orientador: Prof. Dr. Cláudio Amorim

 Escherichia coli é um dos agentes etiológicos mais freqüentemente isolados em casos de
diarréia no homem e em diferentes espécies animais, principalmente bovinos e suínos jovens
(SAVADORI et al., 2003).

 A diarréia em bezerros é uma síndrome que ocorre em muitos países do mundo, principalmente
subdesenvolvidos, e é uma importante causa de perdas econômicas (BARRAGRY,1997).

 Os fatores de virulência são constituídos por componentes lipopolissacarídeos – LPS - da

estrutura bacteriana (endotoxinas), ou são representados por diferentes cito ou exotoxinas
(hemolisinas, fator necrosante citotóxico - CNF, toxina Shiga-like - STx e enterotoxinas – ST e LT),
assim como propriedades que permitem a colonização celular (adesinas) (GONZÁLES & BLANCO
et al., 1987)

 Com isso, a pluralidade dos fatores de virulência de E. coli desperta a preocupação com o
envolvimento destes mecanismos em amostras isoladas de bezerros diarréicos.
 As diferentes linhagens de E. coli responsáveis principalmente por distúrbios entéricos podem
ser agrupadas em seis tipos, de acordo com a capacidade de produção de determinadas toxinas,
de invasão celular ou de manifestação de sintomas clínicos no homem e/ou animais, sendo elas:
ETEC, EIEC, EPEC, EHEC, EAEC e DAEC (NATARO & KAPER, 1998).

 Dentre as linhagens de E. coli relacionadas a distúrbios entéricos, a ETEC é um dos principais

agentes causadores de diarréia em bezerros até 60 dias (MENEZES et al. 2003). As ETEC podem
produzir toxinas termo-lábeis (LT-1 e LT-2) e toxinas termo-estáveis (STa e STb).

 Embora as amostras que causam infecções em humanos estejam bem caracterizadas, existem
informações limitadas acerca daquelas que causam doenças em animais.

 A Bahia possui o maior rebanho bovino do nordeste e está se credenciando a exportar carnes
para a Europa e Oriente e não há, até o presente momento, estudos epidemiológicos acerca da
prevalência de colibaciloses no Estado.
 A Escherichia coli

 A Escherichia coli pertence à família Enterobacteriaceae, que são bacilos Gram-negativos,

isolados ou em pares, não esporogênicos, catalase-positivos, oxidase negativos e podem ser
móveis pela presença de flagelos peritríqueos. Podem ter crescimento aeróbico ou anaeróbico e
utilizam como fontes o carbono simples e o nitrogênio (FERREIRA & KNÖBL, 2000).
 Características bioquímicas de E. coli

 As E. coli possuem polissacarídeos capsulares (antígenos K) que protegem a membrana externa

da parede do ataque do sistema complemento e impedem a fagocitose. Possuem adesinas que
mediam a aderência aos alvos celulares no trato gastrintestinal e às células que compõem o nicho
para a cepa.

 De acordo com Johnson & Case (1995), a utilização das provas bioquímicas EPM (L-Triptofano
desaminase, Urease, H2S, Glicose, Gás e Ácido), MILI (Motilidade, Indol e Lisina) e Citrato de
Simmons classificam a E. coli com base nos seguintes resultados dos testes: L-Triptofano
desaminase (-), Urease (-), H2S (-), Glicose (+), Gás (+ ou -), Ácido (+), Motilidade (+ ou -), Indol (+
ou -), Lisina (+ ou -) e Citrato (-).
 
Escherichia coli patogênica

Patogenicidade em E. coli é um mecanismo multifatorial e complexo que envolve vários fatores

de virulência variando de acordo com o sorotipo.

 Segundo Hirsh & Zee (2003), fatores de virulência como cápsula, adesinas, fatores necrosantes
citotóxicos (CNF1 e CNF2), hemolisinas (alfa e beta), citotoxinas STx1, STx2 e as enterotoxinas,
STa, STb, LT1 e LT2 podem estar presentes nas cepas patogênicas de E. coli isolada de bovinos.
 Descrição das toxinas de Escherichia coli

 O grupo constituído pelas enterotoxinas termoestáveis do tipo I (ST-I ou STa) e tipo II (ST-II ou
STb) são proteínas estáveis a 100C por 30 minutos, de baixo peso molecular, pouco
imunogênicas e codificadas por gene localizado em plasmídio (BLANCO et al., 1993). Estas
proteínas contêm vários resíduos de cisteína, cujas pontes dissulfeto as tornam estáveis ao calor
(NATARO & KAPER, 1998).

 O grupo das enterotoxinas termolábeis do tipo I (LT-1) e II (LT-2), é constituído por proteínas
inativadas quando aquecidas a 60C por 15 minutos e são codificadas por genes plasmidiais; são
imunogênicas, com alto peso molecular (DYKES et al.,1985; YAMAMOTO et al., 1987). As LTs de
E. coli são toxinas oligoméricas que estão intimamente relacionados na estrutura e função com a
enterotoxina colérica (CT) expressa por Vibrio cholerae (NATARO & KAPER, 1998).

 As toxinas Shiga like (STx) são classificadas em 2 grupos denominados de STx-1 e STx-2. Os
genes estruturais para estas toxinas apresentam 58% de homologia na sequência de nucleotídeos.
São sorologicamente distintas, mas possuem ação biológica semelhante (TONI et al., 2004).
Ensaio com células Vero, de rim de Macaco Verde Africano, é muito utilizado na detecção dos
efeitos citotóxicos de STx (YANO et al., 1986).

 A α–hemolisina é uma proteína citolítica formadora de poros capaz de se inserir na membrana

de várias células eucarióticas, incluindo eritrócitos, granulócitos, monócitos e células endoteliais.
 Descrição das toxinas de Escherichia coli
 Descrição das Fímbrias

 Foi demonstrado em cepas de ETEC que infectavam suínos e bovinos, que a sua capacidade
patogênica é decorrente de seu mecanismo enterotóxico e de um segundo fator do tipo adesivo,
sem o qual essas amostras não conseguiam desencadear os processos diarréicos (SMITH &
GYLES, 1970; SMITH & LINGOOD, 1971).

 As ETEC aderem às células da mucosa intestinal pelas estruturas presentes na superfície

conhecidas como fatores de colonização (CFA). Os fatores de colonização geralmente são
estruturas filamentosas de natureza protéica, imunogênicas, as quais se projetam da superfície
celular e reconhecem receptores específicos (TRABULSI, 2004). Os CFAs mais importantes
descritos na literatura para as amostras de ETEC isoladas de bezerros são: F5 (K99), F41 e F17.
 Descrição das Fímbrias
 A importância da colibacilose em bezerros

 A ocorrência de doenças entéricas de bezerros pode causar perdas diretas por mortalidade, mas
também tantas outras perdas indiretas como baixo desempenho, animais-reservatórios de
patógenos, aumento da resistência a antimicrobianos na propriedade, gastos de medicamentos e
outros (OLIVEIRA, 2000).

 No Brasil, a colibacilose em bezerros é muito comum, embora necessite de mais estudos para
se ter uma idéia de sua prevalência e a identificação dos fatores de virulência.

 Do ponto de vista epidemiológico, as E. coli enterotoxigênicas (ETEC) constituem um dos

enteropatógenos de maior importância em diarréia. Após sua penetração via oral, as ETEC
atravessam a barreira gástrica e se estabelecem no intestino delgado por meio dos CFAs, onde
proliferam e produzem toxinas
 Cultivo e identificação bacteriana

Amostras fecais diluídas em Semeadas em MacConkey por

tampão fosfato pH 7,4 24hs a 37°C

120 colônias Lac + Isolamento das colônias Lac +

semeadas em BHI

Série bioquímica: EPM, MILi e

Citrato
 Análise genotípica através da PCR das amostras isoladas
 Extração do DNA
 
Cultivo das amostras em TSB Amostras semeadas em TSA
por 24hs a 37°C por 24hs a 37°C

Fervura em banho-maria a Suspensão das amostras em

100°C por 10 min. 300 μl de tampão TE

Centrifugação da suspensão a Obtenção do sobrenadante

12000 rpm por 3min. (DNA bacteriano)
 Análise genotípica através da PCR das amostras isoladas
 Eletroforese em gel de agarose
 
6 L do produto da PCR foi Aplicação da mistura nos
misturado a 1 L de azul de poços do gel de agarose a 2%
bomofenol

Identificação da banda em Corrida realizada a 100V por

solução de brometo de etídio. 1h.

Visualização das bandas em

luz UV
Figura 2 – Gel de agarose representativo do perfil
genotípico de virulência obtido através da PCR para o gene
LT-2. M. padrão de peso molecular de 100pb; 1. E. coli K12
(controle negativo); 2. E. coli PCD(LT-2+) controle positivo;
3 a 7. amostras positivas para LT-2. Figura 3 – Gel de agarose representativo do perfil
genotípico de virulência obtido através da PCR para o gene
STx-1. M. padrão de peso molecular de 100pb; 1. E. coli
K12 (controle negativo); 2. E. coli O26:11(STx-1+) controle
positivo; 3 pool de amostras positivas para STx-1.

Figura 4 – Gel de agarose representativo do perfil

genotípico de virulência obtido através da PCR para o gene
K99. M. padrão de peso molecular de 100pb; 1. E. coli
O101:K- (K99) controle positivo; 3. E. coli K12 (controle
negativo); 2,4,5,6 e 7. amostras positivas para K99.
 Detecção de citotoxinas em cultura de tecidos.
 Preparo da cultura celular
 
Descongelamento das célula
Lavagem em meio Eagle
Vero

Transferência das células para

Formação do tapete celular
a garrafa de cultura com Eagle
por 48hs a 37°C
e suplementada com 10% de
SBF

Descolamento do tapete Supensão em Eagle acrescido

celular com ATV de 10% de SBF

Distribuição das células em

microplacas de 96 cavidades
em atmosfera de 5% de CO2
por 24hs a 37°C
 Análise do efeito citotóxico e citotônico em células Vero
 

Amostras cultivadas em TSB a Cultura centrifugada a 10000

37°C por 18hs rpm por 15 min.

Aplicação do sobrenadante na
Filtração do sobrenadante em
monocamada de células Vero
membrana Milipore 0,22 µm
em MEM.

Incubação das placas em

atmosfera de 5% de CO2 por Análise do efeito citotóxico e
24hs a 37°C citotônico após 12 e 24hs em
microscópio invertido
Figura 6 – A. controle negativo; B. célula apresentando efeito citotóxico de Stx após 12hs; C. célula
apresentando efeito citotóxico de Stx após 24hs; D. célula apresentando efeito citotônico de LT após 24hs.
 Produção de hemolisinas 

α-Hly E-Hly

Amostras semeadas em meio

A mostras semeadas em Ágar
de Beutin com CaCl2 e
sangue por 18hs a 37°C.
eritrócitos de carneiro lavados
 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os resultados desta pesquisa mostraram que cepas de E. coli isoladas de bezerros

diarreiogênicos da região de Feira de Santana, são produtoras de toxinas e fatores
de colonização. Também foi detectada uma prevalência da toxina LT-2, tendo esta,
apresentado efeito citotônico em células Vero, podendo pertencer ao subtipo c,
descoberto recentemente. Estes resultados sugerem que é necessário um estudo
mais aprofundado e com uma amostragem maior para a identificação da
prevalência dos fatores de virulência associados à colibacilose bovina na região.
Figura 6 – A. controle negativo; B. célula apresentando efeito citotóxico de Stx após 12hs; C. célula
apresentando efeito citotóxico de Stx após 24hs; D. célula apresentando efeito citotônico de LT após 24hs.
 REFERÊNCIAS
 

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OBRIGADO!!!