01/12/2022

Identificação de Patógenos
CURSO DE APERFEIÇOAMENTO
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS E PROCESSOS PCR
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS REAÇÃO EM
CADEIA DA
POLIMERASE
- PCR -

Microbiologia Ambiental

Farmacogenômica
REAÇÃO EM CADEIA DA

Agricultura
POLIMERASE

Filogenética
Lorena Carnielli, PhD

Genética
Forense
lcarnielliqueiroz@gmail.com

PCR – REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PCR – A SÍNTESE DE DNA IN VITRO

1993 – Karry Mullis recebe o

Prêmio Nobel de Química.
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Polymerase_chain_reaction.svg

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ROTEIRO PCR – COMPONENTES DA REAÇÃO

 COMPREENSÃO DOS PARÂMETROS

 SELEÇÃO DA SEQUÊNCIA
 DESENHO DOS PRIMERS: PRIMER3PLUS
 EXTRAÇÃO DNA/RNA H2O TAMPÃO
 PCR
 ELETROFORESE
 RESULTADOS

PCR – TEMPERATURA DOS CICLOS PCR – A SÍNTESE DE DNA IN VITRO

 Ciclos são repetidos de forma a
obter-se quantidade suficiente
de DNA alvo amplificado

Taq Polimerase
 25 a 40 ciclos em média

 Milhares de cópias do DNA alvo

ao final do processo

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DESENHO DE PRIMERS

TAMANHO DO PRIMER TEMPERATURA DE MELTING (Tm)

Determina especificidade e afeta seu anelamento com o DNA molde!  A temperatura na qual 50% da dupla fita de DNA se dissocia para fita
 Muito curto = baixa especificidade, resultando em amplificação
não específica simples.
 Muito longo = diminui a eficiência de ligação ao DNA molde devido Tm = 2(A+T) + 4(G+C) °C
à maior probabilidade de formação de estruturas secundárias.
 Tamanho da molécula

Comprimento ideal:  CG (em relação a AT): Mais energia

18-25 pb

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TEMPERATURA DE ANELAMENTO (Ta)
Ta = 0.3 x (Tmprimer) + 0.7 x (TmPCR product) – 25
Regra geral: Ta = Tm-5°C
 Ta ótima = 55°C - 63°C
 ↓TA: ↑ eficiência ↓ especificidade
 Primers podem anelar em alvos similares
 ↑TA: ↓ eficiência ↑ especificidade
 probabilidade do anelamento diminui
 TA > 65°C: recomendado ↑ GC.
 Diferenças de Ta entre o par de primers > 5°C
ESTRUTURAS SECUNDÁRIAS DOS PRIMERS
 Grampos: Formados por interações intramoleculares no mesmo primer
 Auto-dímero (homodímero): Formado por interações intermoleculares
entre dois iniciadores iguais
 Cross-dímero (heterodímero): Formado por interações intermoleculares
entre o par de primers
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TEMPERATURA DE ANELAMENTO (Ta)
>>>DICA
 Para determinar a Ta ótima sempre testar os primers pela 1ª vez em
pelo menos 3 diferentes temperaturas (ex. a Ta indicada pelo
fabricante ou calculada +/- 2°C) e correr gel.
Escolher a máxima temperatura em que
há apenas 1 banda do tamanho esperado
com amplificação satisfatória.
CONTEÚDO GC E REPETIÇÕES
Conteúdo G/C
 Ideal de G/C: 40-60%
 Conteúdo semelhante para o par de primers
 Recomendado C ou G na extremidade 3’ (aumentar estabilidade da ligação)
 Nas últimas 5 bases não ter mais que 3 CG (ligação inespecífica)
 Repetições de base única (aaaaaaaaa) ou de di-nucleotídeos
consecutiva (acacacac)
 Repetições longas aumentam o potencial de anelamento inespecífico
 O número máximo aceitável é de 4 pb
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• NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• Primer3PLus: https://www.primer3plus.com/
• Netprimer: http://www.premierbiosoft.com/netprimer/

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Escala: Qtde de bases utilizadas na manufatura = rendimento

 Dessalinização: PCR
 Cartucho: PCR, qPCR, sequenciamento, microarray, blotting e clonagem
 HPLC: sondas, oligos marcados, oligos longos e para fins que exigem oligos muito puros EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

DNA: EXTRAÇÃO EXTRAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

 Obtenção de DNA a partir de uma cultura pura ou amostra
Numerosos métodos que variam em complexidade
 Aplicação final
 Maximizar a qualidade do DNA
 Localização do DNA na célula
 Eliminar possíveis inibidores de PCR que podem (a) inativar a Taq  Tipo de tecido, material, micro-organismo
polimerase (b) degradar ácidos nucleicos
 Complexidade do genoma

 Maximizar a recuperação de DNA

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EXTRAÇÃO: PRINCIPAIS ETAPAS MEMBRANAS

CELULARES
1- Lise da parede e membranas (celular e núcleo)

2- Inativação de proteínas (incluindo DNAses ou RNAses)

3- Precipitação de ácidos nucléicos

4- Ressuspensão da molécula

Molécula livre de DNA ou RNA, proteínas, carboidratos

MEMBRANAS CELULARES: ROMPIMENTO LISE

Técnica Exemplo Efeito nas membranas Tipos de células  Ruptura mecânica
Orifícios originando
Enzimático Lisozima
estado hipotônico
Bactérias  Nitrogênio líquido
Ambiente hipotônico –
Solução Solução salina hipertônica rompe membranas Bactérias  Tissue lyser
celulares
Solubiliza camada lipídica Bactérias, células animais
Detergente SDS, CTAB
Desnatura nucleases em cultura ou solução

Alta frequência -
Sonicação Ondas sonoras Bactérias
rompimento

Tecidos, materiais
Ruptura mecânica Nitrogênio líquido Força física - rompimento
complexos, fungos

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INATIVAÇÃO DE PROTEÍNAS EXTRAÇÃO: SOLVENTES ORGÂNICOS

Após lise: mistura de macromoléculas - tampão de extração Separação do DNA de outras macromoléculas
 Extração por solvente, centrifugação/precipitação
• Fragmentos de membranas lipídicas
 Extração com fenol - clorofórmio
• Proteínas intracelulares (atenção: DNases e RNAses)
• RNA: importante inibição de nucleases exógenas e endógenas
Camada aquosa (DNA e RNA)
• Baixas temperaturas: reduz atividade Proteínas
Fenol
Inativação de proteínas (componentes hidrofóbicos)
Agentes quelantes aos cátions divalentes Citrato/ EDTA
Dissociação DNA-proteína Perclorato
1. Homogeinização (emulsão) 2. Centrifugação
Desnaturação Solução: fenol/CHCl3/ álcool isoamílico 3. Repetir (?)
Enzimas proteolíticas Proteinase K (estável: pH, 65oC, EDTa, SDS)

PRECIPITAÇÃO DO DNA/ RNA ETAPAS

 RNA: rRNA e mRNA – cloreto de lítio (ppt)
 DNA/RNA: etanol (70 – 100%) Lise celular (SDS, Agentes quelantes
Proteinase K
Extração com fenol
Precipitação com
álcool (ETOH 70%/
enzimas, físico) (EDTA, citrato) (fenol/clorofórmio)
Ressuspender: 100%)
TE ou H2O estéril

Sobrenadante 1- Add acetato de sódio

2- Add etanol Tratamento de
3- Agitar cuidadosamente Precipitação com
materiais, Lise celular (SDS, Proteinase K, ou Extração com fenol
álcool (ETOH 70%/
por inversão bancadas. Uso de enzimas, físico) sais de guanidina (fenol/clorofórmio)
100%)
água DEPC, gelo

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KIT BASEADO EM EXTRAÇÃO POR SOLVENTE KIT BASEADO EM EXTRAÇÃO POR FASE SÓLIDA (SÍLICA)

Easy-DNA (Invitrogen)

IMPORTÂNCIA DOS TESTES COMERCIAIS EXTRAÇÃO DE RNA

 Disponível para tipos específicos de matrizes (sangue, solo, cultura,  Similar à extração de DNA
alimento e ração)
 Protocolo bem mais cuidadoso
 Métodos não tóxicos
 Molécula muito mais instável
 Tempos curtos de incubação e centrifugação
 Amostra pode ser bem conservada em reagentes comerciais
 Etapas fáceis de procedimento
 Capaz de se livrar de inibidores  É preciso separá-la do DNA

 Prontos para automação  DNAse

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APÓS EXTRAÇÃO cDNA

DNA: -20oC ou
RNA: -80oC ou
temperature de
converter para cDNA
refrigeração (períodos
e manter a -20oC
mais curtos)

QUANTIFICAÇÃO DE DNA ESPECTROFOTÔMETRO

Quantificação espectrofotométrica: Comprimento de onda de 260nm
NanoDrop
Pequenos volumes: 0,5 - 2 µL de DNA, RNA e amostras de proteínas.
Faixa de concentração (0,4 - 15.000 ng/µL DNA)
Quantificação fluorimétrica (Qubit)
• Corante intercalante fluorescente
• > sensibilidade
• Concentrações de amostra iniciais de 10 pg/µL a 100 ng/µL
• A quantificação é feita por comparação com uma curva padrão
Ac. Nucléico: Absorbância máxima em 260nm
• A260/280 = ~1.8-2.0 (DNA)
• A260/280 = ~1.9-2.1 (RNA)
Razão A260/280 < 1,7 = proteínas ou outros contaminantes que absorvem em
280 nm
A260/230 < 1,7 = presença de solventes orgânicos (ex. Fenol) ou sais

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POSSÍVEIS CONTAMINAÇÕES INIBIDORES DA PCR

 Contaminação por fenóis: coloração marrom/ escura do DNA DNA/RNA

 Contaminação por polissacarídeos: DNA com aspecto gelatinoso/

viscoso.
 DNA degradado: contaminação por DNAses, quebra mecânica
durante a extração com clorofórmico ou contaminação com RNA.
 Verificar “arraste” vertical no gel.

PCR – REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

ELETROFORESE

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ELETROFORESE ETAPAS ELETROFORESE

 Usada para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA;

 Bastante sensível, capaz de detectar até 20 pg de DNA;

1)Preparo do Gel
 Permite a recuperação dos fragmentos após a separação 2)Migração
 Separação de moléculas mediante migração durante a aplicação de
3)Visualização dos
uma diferença de potencial
 De acordo com o seu tamanho, sendo que as de menor massa fragmentos
migram mais rapidamente

TIPOS DE GÉIS GEL DE AGAROSE

 Agarose: polímero linear composto por resíduos de galactose unidos por ligações glicosídicas.
A escolha da matriz de separação usada depende principalmente do  A agarose não é solúvel em temperatura ambiente e precisa ser aquecida e resfriada para
tamanho dos fragmentos analisados. formação do gel (Gelificação)
 80 - 95°C
1. Agarose: Separa fragmentos de tamanhos muito distantes (100  32 - 45°C

– 3.000 pb)

2. Poliacrilamida: Maior resolução. Separa fragmentos com até 1 pb

de diferença.

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GEL DE AGAROSE TIPOS DE TAMPÕES

Solução Tampão
 Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na
Concentração do Faixa de separação
gel ( w/v %) de DNA (kb) carga líquida da molécula)
 Maior força iônica (carrega mais corrente que a
0.3 5 – 60 água)
0.6 1 – 20
0.7 0.8 – 10
 Tris-Acetato e EDTA - TAE
0.9 0.5 – 7
 Melhor resolução para fragmentos maiores
1.2 0.4 – 6
Gel-Loading Buffer: usado para
1.5 0.2 – 3 1% 0,3%  Tris-Borato e EDTA - TBE aumentar a densidade da
2.0 0.1 – 2 amostra e dar cor a amostra
Sambrook et al., “Molecular Cloning” 3 ed - 2000  Tris-Fosfato e EDTA - TPE

CORRIDA CORRIDA
 Voltagem: 80-150V
 Corrida: 75-80% do gel
Os ácidos nucleicos apresentam  1 – 1,5h (depende da cc do gel, tamanho das bandas)
uma carga líquida negativa.

Com aplicação de uma corrente

elétrica eles migram em direção ao
polo positivo

Corrente elétrica

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ESQUEMA - ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE VISUALIZAÇÃO DOS FRAGMENTOS

Intercalantes de DNA
 Moléculas que se inserem entre os pares de bases do DNA
 Fluorescência mais visível quando ligados ao DNA
 Como emitem fluorescência? Absorvem luz em um comprimento de onda e emitem em um
comprimento menor (menos energia)
Preparo do gel Aplicação da amostra de DNA no
Gel (Aplicar 3 – 10 μL de amostra e
marcador de peso molecular + corante ou Brometo de Etídio
loading dye)
 Intercalante muito utilizado para visualização do DNA
Posicionar o  Pico de excitação em 285 nm (luz UV)
Ligar à cuba à gel na cuba e
cobrir com  Pico de emissão em 605 nm (luz laranja/vermelho)
uma fonte de
energia TBE  É considerado tóxico
para aplicação do
potencial

VISUALIZAÇÃO DOS FRAGMENTOS INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS

 Transiluminador ultravioleta

PCR
Presença de fragmentos de
diferentes tamanhos
Eletroforese

Visualização Presença ou ausência

500 pb
Expressão diferencial de determinado gene
300 pb

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LIMITAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR

1. PADRONIZAÇÃO INTENSA 5. SEM AUTOMATIZAÇÃO

APLICAÇÕES
2. BAIXA SENSIBILIDADE 6. PÓS PROCESSAMENTO

3. CONTAMINAÇÃO 7. RESULTADOS NÃO

4. DISCRIMINAÇÃO BASEADA EXPRESSOS EM NÚMEROS

NO TAMANHO DO

AMPLICON

https://doi.org/10.1186/s12896-015-0168-2

https://www.mdpi.com/2304-8158/10/6/1381

Neste manuscrito, duas estratégias

foram usadas para projetar primers
oligonucleotídicos com diferentes
níveis de especificidade para a
detecção simultânea de coliformes
totais e E. coli por PCR
multiplex. Uma sequência de
consenso de lacZ e o gene
yaiO foram escolhidos como alvos
para amplificação, produzindo
produtos de PCR de 234 pb e 115
pb, respectivamente.

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10.1016/j.ecoenv.2021.112317
Nossos resultados propõem que as
aves aquáticas servem como um
reservatório de E. coli carregando
múltiplos ARGs e vários VAGs
associados a ExPEC. Portanto, este
estudo fornece informações
necessárias sobre a ocorrência e
possíveis associações de ARGs e Este estudo relata a prevalência de sorotipos de
VAGs em aves aquáticas saudáveis Salmonella e genes de virulência em isolados
clínicos e em alimentos de rua. Isso mostra que
os alimentos podem ser uma fonte significativa
de transmissão de Salmonella para
humanos. Nossos resultados podem ajudar na
tomada de decisões da autoridade de saúde de
Burkina Faso na luta contra doenças relacionadas
à comida de rua, em particular treinando donos
de restaurantes em higiene alimentar.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC8052391/

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