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BioquímicaUSP PDF
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INSTITUTO DE QUMICA
BIOQUMICA QBQ220N
Biologia Noturno
Professores
2006
NDICE
APRESENTAO................................................................................................................................5
AVALIAO.........................................................................................................................................7
MDULO 2: AMINOCIDOS.............................................................................................................12
2
MDULO 9: GLICLISE ...................................................................................................................40
MDULO 16 E 17 FOTOSSNTESE...............................................................................................62
MICROPIPETADORES ......................................................................................................................76
II. OBJETIVOS............................................................................................................................80
I. FUNDAMENTOS ....................................................................................................................84
II. OBJETIVOS............................................................................................................................87
I. FUNDAMENTOS ....................................................................................................................90
II. OBJETIVOS............................................................................................................................93
I. FUNDAMENTOS ....................................................................................................................97
II. OBJETIVOS............................................................................................................................99
V. APNDICE...........................................................................................................................104
I. FUNDAMENTOS ..................................................................................................................107
II. OBJETIVOS..........................................................................................................................109
4
APRESENTAO
PROFESSORES:
Prof. Dr. Hugo Aguirre Armelin (coordenador) Bloco 9 Inf., Sala 924
Prof. Dr. Alexander Henning Ulrich Bloco 8 Sup., Sala 858
MONITORES:
5
NORMAS E RECOMEDAES NO LABORATRIO
6
AVALIAO
PGs + Rs
x 2 + P1x 2,5 + P 2 x3,0 + P3x 2,5
11
MdiaFinal =
10
Haver uma nica prova substitutiva para substituir uma das provas individuais de avaliao.
Reposies de PG ou relatrio de laboratrio esto vetados. A presena em todas as
atividades obrigatria. Uma lista de presena ser passada em todas as aula. Alunos que
alcanarem a mdia final 5,0 e mostrarem freqncia 70% estaro aprovados. Aqueles cuja
mdia for no mnimo igual a 3,0 e apresentarem freqncia 70% podero fazer a prova de
recuperao.
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
Contudo, outros excelentes textos de Bioqumica, em geral em ingls, podero ser usados com igual
proveito:
MDULO/
DATA TTULO
ATIVIDADE
JULHO 31 1 GUA; REAO CIDO-BASE, pH E SISTEMA TAMPO.
AGOSTO 3 2 AMINOCIDOS: Estrutura, Propriedades Qumicas.
4 3 PROTENAS: Estrutura Primria.
7 - PROTENAS: Estrutura 3D e Conformao.
10 4 PG-1.
11 5 INTRODUO CINTICA E TERMODINMICA QUMICA.
14 6 CINTICA ENZIMTICA.
17 7 MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA.
18 - PG-2.
21 - AVALIAO 1.
24 8 AUCARES ESTRUTURA E FUNO.
25 9 GLICLISE.
28 10 ACETIL-CoA E CICLO DE KREBS
31 11 CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA
SETEMBRO 1 12 GLICONEOGNESE
4-8 - SEMANA DA PTRIA.
11 - .PG-3.
14 - AVALIAO 2
15 13 CIDOS GRAXOS:ESTRUTURA, FUNES E METABOLISMO.
18 14 LIPDEOS, MEMBRANA E TRANSPORTE.
21 - PG-4.
22 15 CICLO DAS PENTOSES.
25-29 - SEMANA TEMTICA DA BIOLOGIA.
OUTUBRO 2 16 FOTOSSNTESE 1.
5 17 FOTOSSNTESE 2.
6 - PG-5
9 18 METABOLISMO DO GLICOGNIO.
12 - FERIADO
13 - RECESSO
16 19 CONTROLE HORMONAL DO METABOLISMO.
8
19 20 METABOLISMO DE AMINOCIDOS.
20 21 CICLO DO NITROGNIO.
23 - PG-6.
26 - AVALIAO 3.
L1-A MTODOS COLORIMTRICOS E ESPECTRO DE ABSORO.
LABORATRIO* 27
B AULA.
L1-B MTODOS COLORIMTRICOS E ESPECTRO DE ABSORO.
30
R1-A RELATRIO.
NOVEMBRO 2 FERIADO
3 .RECESSO
L2-A TITULAO E SEPARAO DE AMINOCIDOS.
6
R1-B RELATRIO
L2-B TITULAO E SEPARAO DE AMINOCIDOS
9
R2-A RELATRIO.
L3-A CINTICA ENZIMTICA, INVERTASE.
10
R2-B RELATRIO.
L3-B CINTICA ENZIMTICA, INVERTASE.
13
R3-A RELATRIO.
L4-A FRACIONAMENTO DE PROTENAS.
16
R3-B RELATRIO.
L4-B FRACIONAMENTO DE PROTENAS.
17
R4-A RELATRIO.
L5-A MECANISMOS DE CATLISE, TRANSAMINASES.
20
R4-B RELATRIO.
L5-B MECANISMOS DE CATLISE, TRANSAMINASES.
23
R5-A RELATRIO.
A AULA.
24
R7-B RELATRIO.
27 AVALIAO INDIVIDUAL DO LABORATRIO.
DEZEMBRO 7 - SUBSTITUTIVA.
18 - RECUPERAO.
* L = laboratrio; R = relatrio; A e B = turmas.
9
MDULO 1: REAO CIDO-BASE, pH E SISTEMA TAMPO
1. A molcula de gua, H2O, apresenta um ngulo de 104,5 graus entre as duas ligaes O-H,
dando-lhe um carter altamente polar. Alm disso, o tomo de O possui 2 pares de eltrons
livres, permitindo a formao de ligaes (ou pontes) de H entre molculas vizinhas. Esta
estrutura d gua propriedades fsicas e qumicas de enorme importncia biolgica.
2. A gua se ioniza atravs de uma reao cido-base:
H2O + H2O H3O++ OH-
A reao cido-base se caracteriza pela troca de prtons entre pares conjugados de cidos e
bases. A gua pode se comportar como cido e como base:
AH + H2O H3O+ + A-
B + H2O BH + OH-
Estas so reaes de equilbrio, s quais correspondem constantes de equilbrio definidas.
Por exemplo: K = [H3O+] [A-]
[AH] [H2O]
K mede a afinidade relativa das bases, de cada par cido-base conjugados (AH/ A- e H3O+/
H2O), por prtons. Fala-se comumente em constante de dissociao de um cido (Ka),
significando: Ka = K [H2O] = [H+] [A-], onde [H2O] essencialmente constante (55 M).
[AH]
3. [H ] a concentrao hidrogeninica e os valores de [H+] para a maioria das solues so
+
muito baixos e difceis de serem comparados. Um valor mais prtico conhecido como pH:
pH = - log [H+].
como 1/[H+] = 1/K x [A-]/[AH]
pode-se obter pH = - logK + log [A-]/[AH]
por analogia - log K = pK
e pH = pK + log [A-]/[AH]
Conclui-se que pK numericamente igual a pH da soluo na qual as concentraes
molares do cido e sua base conjugada so iguais (ie log [A-]/[AH] = 0).
A igualdade pH = pK + log [A-]/[AH] conhecida como Equao de Henderson-
Hasselbach.
4. cidos so classificados de acordo com sua fora relativa, ou seja, de acordo com sua
capacidade de transferir um prton para a gua. cidos com constantes de dissociao
menores do que aquela de H3O+ (que, por definio, igual a 1 em solues aquosas (v se
consegue confirmar porqu!)) so s parcialmente ionizados em solues aquosas e so
conhecidos como cidos fracos (K < 1). J os cidos fortes tm constantes de dissociao
maiores que a de H3O+, sendo quase completamente ionizados em solues aquosas (K>1).
10
5. Tampes so sistemas aquosos que tendem a resistir a variaes no seu pH quando
pequenas quantidades de cido (H+) ou base (OH-) so adicionadas. Um sistema tampo
consiste de um cido fraco (o doador de prtons) e sua base conjugada (o aceptor de
prtons). comum encontarr os seguintes smbolos para representar um cido (AH ou BH+)
-
e sua base conjugada (A ou B:)
6. A adio de cido forte (H+) ou base forte (OH-) a uma soluo aquosa de um cido fraco,
por exemplo, cido actico (pKa = 4,76), causa pequenas variaes de pH, se a soluo
estiver a um pH prximo do pK do cido. Este comportamento define um tampo cido-base.
Grupos de discusso 1
2) a) Qual o pH das solues 0,1 M dos cidos fortes HCl e HNO3? b) Usar a equao Henderson-
Hasselbach para calcular o grau de dissociao dos cidos fracos i) H2S (Ka=1x10-7) e ii) cido
actico (Ka=2x10-5) em solues 0,1 M. Qual o respectivo pH dessas solues?
3) Esquematize a curva de titulao de 1 L de uma soluo de 0,1 M H3PO4 com uma soluo de 10
M NaOH, colocando pH (eixo y) em funo de volume de base adicional (eixo x). Indicar os
pontos na titulao (volumes de NaOH) em que o pH equivale cada um dos pKas do cido.
4) Indique como se pode preparar 1 L de um tampo a pH=7,0, capaz de manter o pH estvel com
adio de 10 mL de HCl 0,1M, dispondo-se das solues:
a) 1M H3PO4
b) 1M cido actico
c) 1M NaOH
5) Desenhe a estrutura do gelo, mostrando pontes de hidrognio entre molculas de gua. O que
acontece quando o gelo derrete? Porque a gua lquida 4oC mais densa do que o gelo 0oC?
6) Desenhe a estrutura do NaCl no estado slido e tambm no estado aquoso, neste ltimo,
destaque suas interaes com gua.
11
MDULO 2: AMINOCIDOS
Grupo de discusso 2
1) Quais dos aminocidos tm dois carbonos quirais e qual deles no possui isomeria ptica?
12
3) O etanol no tem carter cido em gua, enquanto fenol e cido actico se dissociam em soluo
aquosa, sendo o cido actico (pK=4,8) mais forte que o fenol (pK=10). Como se pode explicar o
comportamento destes trs compostos em gua a partir de suas estruturas moleculares?
4) Esquematize a curva de titulao da glicina com NaOH a partir de pH=1 e do cido asprtico com
HCl a partir de pH=11. Coloque o pH na ordenada e, na abscissa, a quantidade de equivalentes
de cido ou base forte.
5) a) Quais os pontos isoeltricos de: glicina (pKs=2,5 e 9,5), cido asprtico (pKs=2,5; 4,0 e 9,5),
lisina (pKs=2,5; 9,5 e 10) e histidina (pKs=2,5; 6,0 e 9,5)? b) Calcular as cargas lquidas
(aproximadas) do cido asprtico, lisina ou histidina nos seguintes pHs: pH 1, pH 8, pH 11.
6) Tentar classificar os aminocidos em termos da natureza qumica dos seus grupos radicais: a)
ionizveis ou no ionizveis, b) cidos ou bsicos, c) polares ou no polares, d) hidroflicos ou
hidrofbicos, e) alifticos ou aromticos, f) lineares ou ramificados e g) pequenos e grandes.
7) Na Tabela 1 indicar: a) O cdigo de letra nica para cada aminocido e b) os pKR dos
aminocidos com grupos radicais ionizveis.
13
14
MDULO 3: ESTRUTURA PRIMRIA DE PROTENAS
Esta reao, como esta escrita, jamais ocorre nos seres vivos. A unio dos aminocidos por
ligao peptdica no feita por reao direta entre eles, mas atravs de um complexo
aparato de sntese protica, que inclui ribossomos, cidos ribonuclicos, vrias protenas e
enzimas num processo chamado traduo. A equao mostra apenas o resultado liquido do
processo.
3. As propriedades da ligao peptdica impem restries ao dobramento do polmero formado.
A ligao peptdica apesar de ser representada por um nico trao de ligao, tem
caractersticas intermediarias entre uma ligao simples e uma dupla ligao, devido as
interaes entre duas formas de ressonncia.
que os dois carbonos alpha (C) vizinhos de cada ligao peptdica tambm se encontram o
plano.
15
Marzzocco & Torres, Bioqumica Bsica.
O polmero formado pode, portanto, ser visualizado como uma cadeia constituda por
unidades planares (unidades peptdicas), unidas entre si com uma articulao flexvel: o
carbono . Esta cadeia chama-se cadeia polipeptdica. As protenas podem ser formadas por
uma ou mais cadeias polipeptdicas.
4. Todavia, existem pontos de dobramento entre as unidades peptdicas rgidas, graas a
possibilidade de rotao em torno das ligaes com o carbono alfa (N-C e C-C), que so
ligaes efetivamente simples (vide figura acima). Estas ligaes so chamadas phi () e psi
() respectivamente.
5. A cadeia polipeptdica pode ser dividida entre a cadeia principal e as cadeias laterais
(grupos R) ligados aos carbonos alfa.
Grupo de discusso 3
1) Defina estrutura primria, secundria, terciria e quaternria de uma protena, dando exemplos.
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3) a) Desenhar o tripeptdeo Ala-Asp-His. b) Calcular o seu pI. c) Calcular sua carga lquida em pH
1, pH 6 e pH 12.
4) Com os dados abaixo, defina a seqncia do peptdeo analisado: a) hidrlise cida total resultou
em: Arg, Tyr, Leu, Ala, Glu Lys, Ser e Pro; b) dansilao e hidrlise produziram: dansil-Leu; c) dois
ciclos consecutivos de degradao de Edman liberaram, respectivamente Leu e Tyr; d) tripsina
liberou 2 peptdeos cujas composies, aps hidrlise cida total, foram, respectivamente (Tyr, Leu,
Arg) e (Ser, Glu, Pro, Ala Lys); e) carboxipeptidase A no liberou nada, mas carboxipeptidase C
liberou Ser; f) endopeptidase V8 liberou o tripeptdeo Lys-Pro-Ser e um pentapeptdeo que, tratado
com carboxipeptidase C, liberou Glu.
2. H duas estruturas secundrias principais: -hlice (Figura 2) e folha pregueada (Figura 3),
que so estruturas organizacionais regulares e repetitivas. Estas duas estruturas podem ser
caracterizadas por combinaes de angulos phi e psi (Figura 1) adotadas pela cadeia principal.
Alm de -hlice e folha , as protenas globulares mostram tambm alas de formas definidas,
mas irregulares e no repetitivas.
3. A estrutura terciria descreve o arranjo tridimensional da cadeia principal da protena, incluindo a
disposio espacial das cadeias laterais dos aminocidos. H muitas possibilidades de arranjos
tridimensionais para a estrutura terciria das protenas.
a. As propriedades bioqumicas e biolgicas de uma protena so determinadas pelo arranjo
tridimensional de sua cadeia, isto , pela sua estrutura terciria. Logo, nas condies
fisiolgicas a protena adquire uma estrutura terciria bem definida e necessria sua
funo, que conhecida como estrutura nativa. O desarranjo da estrutura terciria leva
perda de funo da protena, processo que genericamente chamado de desnaturao.
b. Em protenas pequenas da estrutura primria define a estrutura terciria nativa da protena.
Nestes casos os processos de desnaturao e renaturao da estrutura da protena so
reversveis. A estrutura nativa a conformao da protena de menor nvel de energia livre
(G) e alcanada espontaneamente (processo exergnico). O exemplo clssico desse
comportamento dado pela protena Rnase A, uma enzima que no seu estado nativo
catalisa a hidrlise de RNA. Para protenas grandes o processo de desnaturao
irreversvel e o fenmeno de alcance da conformao nativa complexo e ainda mal
entendido.
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c. A estrutura tridimensional das protenas mantida por ligaes fracas como pontes de H,
ligaes inicas e interaes hidrofbicas. A exceo a ponte de dissulfeto (-S-S-) que,
apesar de covalente, importante na manuteno da conformao nativa de protenas.
d. Protenas possuem muitos grupos ionizveis atravs de reao cido-base, cujos pKs variam
enormemente. O pI de uma protena definido como pH da soluo na qual a carga lquida
da molcula de protena nula.
4. Existem muitas maneiras diferentes para apresentar estruturas tridimensionais de protenas.
Topografia
de superfcie
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Grupo de discusso 4
2) Descreva -hlice e folha pregueada. Aponte as diferenas essenciais entre estas formas de
estrutura secundria encontradas em peptdeos.
5.) Duas protenas, apesar de terem diferenas quanto a alguns de seus aminocidos, so capazes
de desempenhar a mesma funo. Explique como isto possvel.
6.) Pesquisar informaes sobre a estrutura de hemoglobina. Descrever a sua estrutura terciria e
quartenria. Descrever as mudanas na estrutura quartenria que acontecem devido ligao
de oxignio.
7) O que efeito hidrofbico e qual o seu papel na manuteno da estrutura terciria das protenas?
Qual o fator preponderante no efeito hidrofbico: o entlpico ou o entrpico? Explique
qualitativamente sua resposta.
20
MDULO 5: CINTICA E TERMODINMICA
21
Estado de Transio
Energia
Livre
(G)
G*
G'
Coordenada de Reao
Para que a reao ocorra, necessariamente tem-se Gfinal < Ginicial, isto , G negativo. Um ponto
importante a ser destacado que o valor de G permite prever se a reao pode ocorrer, mas
no a velocidade com que a reao atinge o equilbrio. A velocidade de reao depende da
energia livre do Estado de Transio que maior que do que o dos reagentes no Estado Inicial,
isto , G* positivo. Quanto maior o valor de G*, menor ser a velocidade de reao.
22
da ordem de 3kcal/mol. Estas classes de compostos esto ilustradas na Tabela 2. O principal
composto fosforilado da clula o ATP; cuja frmula estrutural est na Figura 5. O ATP possui
fosfato em ligaes anidrido e ester, aos quais correspondem G0 de hidrlise de,
respectivamente, -8kcal/mol e -3,5kcal/mol. Todas estas reaes so, portanto, muito
voltadas para os produtos de hidrlise, sendo praticamente irreversveis. No entanto,
nenhuma destas reaes ocorre na clula a velocidade significante se no houver catlise
por uma enzima especfica, da classe das fosfatases.
NH2
N C
C N Ad e n i n a
HC
C C H
N
N
O- O- O-
- O- P - O- P - O- P - O- C H
2 O
O O O
H H H
H Ri b o s e
HO OH
A MP
ADP
AT P
FIGURA 2
23
Tabela 2. Compostos fosforilados.
R R
C O P + H2O C O + Pi Go' = - 13.000 cal/mol
CH2 CH3
R R
C O P + H2O C OH + Pi Go' = - 8.000 cal/mol
O O
Anidrido fosfrico cido cido
Como esta reao no ocorre sem catlise, seu controle pela clula feito atravs de uma
enzima quinase especfica.
24
11. Alm das quinases que catalisam a transferncia de grupo fosfato do ATP para metablitos,
existem as quinases que tem como substratos protenas, genericamente referidas como
quinases de protena ou, simplesmente, protena-quinases.
H alguns milhares de protena-quinases diferentes em um organismo, que catalisam a
transferncia de fosfato de ATP para o grupo OH da cadeia lateral de resduos especficos de
serina e treonina formando um ster de fosfato. As reaes deste tipo so genericamente
chamadas de fosforilaes e so modificaes covalentes que causam mudana de
conformao das protenas, alterando sua atividade biolgica. Por exemplo, um grande nmero
de enzimas so fosforiladas para sofrer uma transio do estado inativo ao ativo ou vice-versa.
Mais raramente as protenas so fosforiladas no grupo enlico de resduos de tirosina.
Grupo de discusso 5
1) Defina reaes exotrmicas e endotrmicas. Qual a relao entre estes conceitos e a funo
termodinmica entalpia?
2) Defina reaes exergnicas e endergnicas. Qual a relao destes conceitos com G0.
5) Ainda para a reao AB (questo 4) proponha uma condio na qual a reao inversa seja
espontnea. Mostre que a sua proposta possvel calculando o respectivo G. Esta questo
possui mltiplas respostas ou apenas uma resposta nica?
6) Para a reao AB (questo 4), se a constante de velocidade de primeira ordem, k1 for igual a
10, qual deve ser o valor da constante k-1 para a reao inversa? Para um mesmo K, constante
de equilbrio, pode haver mltiplos valores de k1 e k-1 ? Qual a interpretao termodinmica para
a sua resposta?
25
7) Considerando a equao G0 = -2,3 RT log K, sendo: R = 1,98 x 10-3 kcal/mol K; T = 298K e
2,3 RT = 1,36 kcal/mol. Calcule os valores de G0 quando K varia de 105 a 10-5. Faa uma
tabela.
8) Porque a hidrlise de ATP necessita catlise enzimtica, sendo este um composto rico em
energia? Utilize-se do grfico esquemtico de variao de G (energia livre) em funo de
coordenada de reao para responder a esta questo, definindo estado de transio e energia
de ativao.
1. Enzimas so catalisadores biolgicos cuja natureza qumica proteica. A natureza proteica das
enzimas lhes proporciona alto grau de especificidade.
2. A grande maioria das reaes biolgicas no ocorre, ou ocorrem a velocidades baixssimas nas
condies fisiolgicas de pH e temperatura. Logo, as reaes biolgicas, em geral, necessitam
de catlise para ocorrer, isto , necessitam de enzimas. Para cada reao h uma enzima
especfica.
3. Na reao genrica A B a direo espontnea da reao dada pela variao de energia
livre, .G0, conforme esquematizado no grfico da Figura 5.
* Estado de transio da
Energia reao no catalisada
Livre (G)
G10# G0#-1
* Estado de transio da
reao catalisada
Estado Inicial
G0#1cat
(S) G0#-1cat
G0
Estado Final
(P)
Coordenada de Reao
26
G0 uma constante que se relaciona com a constante de equilbrio da reao pela expresso -
G0=2.3 RTlogK. Por outro lado, as velocidades das reaes AB e BA ou, respectivamente,
as constantes de velocidade k1 e k-1 no dependem do G0 da reao, mas dos, respectivos,
G10 e G-10, que por sua vez s dependem da energia livre (G) do estado de transio
(energias de ativao). A enzima (catalisador) no muda o G0 da reao, pois
catalisadores no interferem com os estados inicial e final das reaes, mas mudam o
caminho da reao e, por conseqncia diminuem a energia do Estado de Transio.
4. Uria uma substncia muito estvel em gua, mas que pode ser rapidamente decompostas
por hidrlise se a reao for catalisada pela enzima urease:
H2N UREASE
1 0 0
2 2 0.084
3 4 0.168
4 6 0.252
5 8 0.336
6 10 0.420
27
Os dados da Tabela 4 permitem medir experimentalmente duas constantes importantes das
reaes enzimticas Vmax (velocidade mxima) e Km (constante de Michaelis) atravs da
equao v = Vmax[S] / (Km + [S]).
k1 kcat
E + S ES E + P
k-1
28
Concentrao
Velocidade mxima
Velocidade do substrato
naquela [S]
Kdiss aparente do
Complexo enzima-substrato Frao de Etot na forma de ES =
[S]/(Kdiss + [S])
29
5. Substncias que reduzem a atividade de uma enzima so chamadas inibidores. Em termos
gerais, inibidores podem atuar em vrias maneiras. Aqui vamos focalizar em inibidores que
ligam reversivelmente com a enzima com constantes de dissociao KI. Estes tipos de
inibidores podem atuar em duas maneiras diferentes: a) Eles podem competir com o substrato
para o mesmo stio de ligao na superfcie da enzima livre. Neste caso so chamados
inibidores competitivos ou b) Eles podem ligar em outro stio na enzima livre (E) e/ou no
complexo enzima-substrato (ES). Estes inibidores so chamados inibidores mistos/no-
competitivos se podem ligar a E e ES e so chamados acompetitivos se ligam somente ao
complexo ES.
6. A presena de um inibidor competitivo se manifesta em uma mudana no valor do Km:
Km obs = Km(1+[I]/KI) = Km onde = (1+[I]/KI)
7. A presena de um inibidor misto/no-competitivo se manifesta em uma mudana nos valores do
Km e no valor do Vmax:
Km obs = Km(1+[I]/KI)/(1+[I]/KI) = Km /
Vmax obs = Vmax /
8. A presena de um inibidor acompetitivo se manifesta em uma mudana nos valores do Km e no
valor do Vmax:
Km obs = Km / (1+[I]/KI) = Km /
Vmax obs = Vmax /
Grupo de discusso 6
Os grficos de, respectivamente, V em funo de [S] e 1/V em funo de 1/[S] podem servir para
determinar Km e Vmax? Como?
30
2) Numa reao enzimtica, o valor de Vmax, mas no o de Km diretamente proporcional
concentrao da enzima? Justifique.
31
MDULO 7: MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA
32
Figura 7. Catlise da ribonuclease pancretica bovina A (RNase A).
33
2. Catlise covalente envolve a acelerao da taxa de reao atravs da formao transiente
de uma ligao covalente substrato-catalisador. A descarboxilao do acetoacetato um
exemplo deste processo:
No primeiro estgio desta reao, a amina faz um ataque nucleoflico ao grupo carbonila do
acetoacetato formando uma base de Schiff (ligao imina).
-
OH
Grupo de discusso 7
1) Examine a reao de hidrlise de RNA catalisada pela RNase A para verificar que se trata de um
mecanismo de catlise cido-base.
34
2) Faa o grfico da velocidade de uma reao enzimtica em funo do pH para uma enzima
estvel entre pHs 3 e 12, considerando que o substrato no possui grupos ionizveis e a
atividade enzimtica exige no centro ativo uma carboxila (pKa = 5) desprotonada e um grupo
amino (pKa = 9) protonado.
3) Definir catlise eletrosttica. Procure um exemplo de uma enzima que utiliza esta estratgia.
4) Descrever o mecanismo empregado pelas serina proteases (tripsina, quimiotripsina, elastase, etc)
para hidrolisar ligaes peptdicas. Descrever todas as etapas da reao. Quais tipos de catlise
so empregados em cada uma das etapas?
35
Figura 10. Famlia D derivada do D-gliceraldedo.
36
O aumento da cadeia do monossacardeo leva ao aparecimento de novos Cs assimtricos e,
portanto mais ismeros estruturais, tambm chamados estereoismeros. O nmero de
ismeros dado pela expresso 2n onde n o nmero de carbonos assimtricos. Por
exemplo, em aldoexoses h 4 Cs assimtricos, logo o nmero de ismeros 24 =16, sendo 8
da forma D e 8 da forma L. Mas, as estruturas lineares como representadas na Figura 10
tanto para pentoses como para hexoses so poucos estveis em soluo, formando
estruturas cclicas segundo a reao mostrada na Figura 11. Esta uma reao bem
conhecida da qumica orgnica, pela qual um lcool (OH) faz uma adio nucleoflica a
carbonila de um aldedo, formando um composto de condensao da conhecido como
semiacetal. No caso do exemplo da Figura 11 a hexose a D-glicose e, como a figura
mostra, a ciclizao leva ao aparecimento de uma outra isomeria estrutural devido s duas
posies possveis do OH do C1 em relao ao plano do anel, gerando os ismeros e .
importante enfatizar que o OH do C1 no quimicamente equivalente aos demais OHs que
so alcolicos, sendo por isso chamado de OH glicosdico. A existncia do OH glicosdico
permite que todos os monossardeos sejam oxidados em condies brandas pelo reagente
de Fehling, uma reao de oxido-reao na qual os OHs alcolicos no participam.
37
2. Conforme exemplificado na Figura 12 h uma nomenclatura especificamente designada para
distinguir pares de estereoismeros. Enantimeros possuem estruturas isomricas que so
uma imagem especular da outra, por exemplo, cada membro da famlia D de hexoses
mostrada na Figura 10 tem um, e, somente um, enantimero na famlia L. So epmeros
pares de estereoismeros que diferem apenas pela configurao de um C assimtrico. So
anmeros os dois ismeros resultantes da posio do OH glicosdico do C1 na estrutura
cclica da hexose. E, finalmente, so denominados diastereoismeros pares de ismeros que
no caem em nenhuma das categorias anteriores.
Caso a ligao glicosdica envolva a condensao dos dois OHs glicosdicos como o caso
da trealose, uma 1-1-diglicose, o dissacardeo no pode ser oxidado pelo reagente de
Fehling (dissacardeo no redutor). J a maltose, que possue um OH glicosdico livre um
dissacardeo redutor, sendo oxidado pelo reagente de Fehling.
38
Figura 13. Glicognio Poli (1-4) (1-6) glicose.
Grupo de discusso 8
39
pode produzir uma maior variedade de estruturas: oligopeptdeos compostos de cinco resduos
de diferentes aminocidos ou oligossacardeos compostos de cinco resduos de diferentes
monossacardeos? Explique.
7) Frutose, o principal acar do mel, comumente usada como adoante de alimento. Este acar
na forma -D-piranose provavelmente a substncia mais doce conhecida. A forma -D-
furanose muito menos doce.
a) Quais so as estruturas da -D-frutopiranose e -D-frutofuranose?
b) A doura do mel diminui ao deix-lo em repouso e ao mesmo tempo aumentando a temperatura.
Explique.
MDULO 9: GLICLISE
41
HOCH2
O
HO
OH
OH
GLICLISE Glicose
OH
ATP ATP
ADP ADP
P -OCH2
O
OH Glicose 6-fosfato
HO OH
OH
P -O-CH2 O CH2OH
HO Frutose 6-fosfato
OH
HO
ATP
ATP
ADP
ADP
P -O-CH2 O CH2O- P
HO OH
Frutose 1,6 bisfosfato
HO
H2C-O- P HC=O
ADP ADP
ATP ATP
O=C-O-
HC-OH 3-Fosfoglicerato
H2C-O- P
COO-
HC-O- P
2-Fosfoglicerato
H2C-OH
H2O
COO-
C-O- P
Fosfoenolpiruvato
CH2
ADP
ADP
ATP
ATP
COO- COO-
HC-OH C=O
Lactato Piruvato
CH3 NAD+ NADH CH3
NAD+ NADH
42
Grupo de discusso 9
3) Na reao do item 2) parte da energia utilizada para produzir ATP. Mostre como isso possvel,
equacionando as etapas relevantes da reao. Defina fosforilao ao nvel do substrato.
5) Examine uma tabela com as 10 reaes da via glicoltica que contenha, respectivamente, o G0
e o G das reaes. Quais so as reaes irreversveis da gliclise?
6) Porque os valores de G0 e de G da mesma reao podem ser diferentes? Para decidir se a via
glicoltica numa determinada clula reversvel ou irreversvel, que valor mais relevante, G0
ou G?
7) Uma pessoa incapaz de executar exerccios fsicos intensos e prolongados teve suas enzimas
analisadas. Todas as enzimas da via glicoltica estavam em concentrao normal, com excesso
da fosfoglicerato mutase muscular.
a) Como ser afetada a produo de energia metablica em uma clula que apresenta baixos nveis
desta enzima?
b) Como ser afetada a produo de Lactato na ausncia desta enzima? [Referncia: Di Mauro, S.;
Miranda, A.F.; Kahn, S.e Gitlin, K. - Human muscle phosphoglycerate mutase deficiency Science
1981, vol. 212, 1277-1279.
8) Calcular a porcentagem de energia armazenada pela clula ao degradar glicose pela via
glicoltica. Sabe-se que:
o
Glicose 2 lactato G ' = - 47.000 cal/mol
43
MDULO 10: CICLO DE KREBS
44
Piruvato
CoASH + NAD+
CO2 + NADH
Acetil-CoA
H2O
CoASH
Oxaloacetato Citrato
NADH + H+
NAD+ H2O
L-Malato cis-Aconitato
H2O
H2O
Fumarato
Ciclo de Krebs Isocitrato
FADH2
NAD+
FAD
NADH + H+
Succinato
GTP Oxalosuccinato
CO2 CoASH CO2
GDP + Pi
Succinil-CoA a-Cetoglutarato
NADH NAD+
+ H+
Grupo de discusso 10
45
4) Equacione a descarboxilao oxidativa de -cetoglutarato a succinato, respeitando a
estequiometria da reao. Mostre as etapas que compem esta reao com as respectivas
enzimas e coenzimas.
5) Quais so as enzimas do ciclo de Krebs sujeitas a regulao? Explique como cada uma delas
regulada.
7) Dispondo das enzimas necessrias, a adio de que compostos far aumentar a concentrao de
oxaloacetato em um sistema in vitro que contm mitocndrias: acetil-CoA, piruvato, glutamato,
citrato ou cidos graxos?
8) Uma suspenso de mitocndrias, suplementada com acetil-CoA marcada com C14, produz CO2
marcado apenas quando suprida de oxignio. Em condies anaerbias, a adio de azul de
metileno restaura a produo de CO2 marcado, observando-se tambm a descolorao do
corante (azul de metileno reduzido incolor). Explique estes dados.
produzidos na gliclise e ciclo de Krebs, ocorre acoplada produo de ATP, a partir de ADP +
Pi. Este processo se d na cadeia respiratria ou cadeia de transporte de eltrons, que
compreende um conjunto ordenado de enzimas e transportadores de eltrons inseridos na
membrana interna da mitocndria.
2. A cadeia respiratria contem 4 complexos, I,II, III e IV, ordenados por ordem crescente de
potencial redox, indo do potencial padro de NAD+/NADH (E0= -0,315V) ao do O2/H2O (E0=
+0,815V). Os eltrons so transferidos do complexo I ou II para o complexo III pela coenzima
Q (ou ubiquinona), e do complexo III para o complexo IV pelo citocromo C para chegar ao O2.
NADH e FADH2 , cedem eltrons, respectivamente, aos complexo I e II. A transferncia
exergnica de eltrons do nvel redox de NADH para o de O2 (E0= 1,130V) envolve uma
diferena de energia livre liberada (G0= -218kJ/mol) que em parte retida pelo transporte de H+
46
do lado interno para o externo da membrana, criando o gradiente eletroqumico de prtons que
permitir empurrar o processo endergnico de fosforilao de ADP por Pi para gerar ATP,
atravs da bomba de prtons que constitui a ATP sintase (tambm conhecida com F1F0-
ATPase).
2 H+
Espao 4 H+ 2 H+
Intermembranar
Cit C
Matrix
Mitocondrial
NAD+
NADH + H+ 1/2 O2 + 2H+
H2O
Complexo II
FADH2
47
6. A sntese de ATP a partir de ADP e Pi na mitocndria, que catalisada pela ATP sintase,
dirigida pelo processo de transporte de eltrons. Mas como a ATP sintase fisicamente separada
das protenas do transporte de eltrons, a energia livre liberada no transporte de eltrons deve
ser conservada em uma forma que possa ser utilizada pela ATP sintase. A energia livre do
transporte de eltrons conservada pelo bombeamento de H+ da matriz mitocondrial para o
espao intermembranar, criando um gradiente de H+. A volta dos prtons ao interior da
mitocndria termodinamicamente favorvel. A membrana interna da mitocndria impermevel
a prtons em toda sua extenso, exceto na ATP sintase; e ento por este canal que os prtons
atravessam a membrana, de volta matriz mitocondrial. A variao de energia livre associada ao
transporte de um prton atravs da membrana interna da mitocndria pode ser determinada
atravs de medidas da diferena de pH e do potencial de membrana estabelecidos em
mitocndrias consumindo oxignio.
Grupo de discusso 11
48
7) A relao entre energia livre padro de uma reao e o potencial redox :
1. O fgado humano precisa manter nveis mnimos da glicose circulante, porque crebro e
hemcias dependem quase exclusivamente de glicose para produo de energia. No entanto, a
reserva de glicognio heptico no suficiente para essa finalidade. Por isso, o fgado sintetiza
glicose de novo a partir de lactato, piruvato, glicerol, intermedirios do ciclo de Krebs e
aminocidos, atravs de uma via anablica chamada de gliconeognese. No jejum, mesmo o
jejum de poucas horas, a gliconeognese a principal fonte da glicose liberada pelo fgado na
circulao.
2. A gliclise, como j foi visto, um a via catablica com a finalidade de produzir energia na forma
de 2 NADH + 2 ATP a partir da degradao de glicose a piruvato de acordo com a equao
qumica seguinte:
A gliconeognese tem a finalidade de sintetizar glicose a partir de piruvato, isto , faz o caminho
metablico inverso ao da gliclise. Mas, a gliconeognese, contrariamente gliclise, muito
49
endergnica. Para produzir glicose a partir de piruvato necessitam-se 2 NADH + 4 ATP +2 GTP,
conforme a estequiometria indicada na equao abaixo:
Grupo de discusso 12
3) A reverso da reao de PEP + ADP piruvato + ATP no pode ocorrer por um processo
relativamente fcil como a reverso de glicose + ATP G6P + ADP. Qual a soluo
bioqumica que os sistemas biolgicos utilizam para ir de piruvato a PEP?
50
4) Qual o consumo de energia na sntese de glicose a partir de piruvato, medido em equivalentes
de ATP. Indique as reaes onde h consumo. Compare o rendimento da via glicoltica com o
consumo da gliconeognese, so iguais ou diferentes?
a) succinato,
b) glicerol,
c) acetil CoA,
d) piruvato e
e) butirato.
7) O nvel de frutose 2,6 bisfosfato nos hepatcitos varia com a disponibilidade da glicose: baixo
no jejum e alto aps as refeies. Como isso se explica em termos das reaes catalisadas por
fosfofrutoquinase-2 e frutose 2,6 bisfosfatase.
51
2. cidos graxos so cidos carboxlicos com longas cadeias hidrocarbonadas, encontrados na
forma de tri-esteres de glicerol. A maioria possui um nmero par de C, predominando os de 16 C
(cido palmtico) e os de 18 C (cido olico). Grande parte apresenta dupla ligao (insaturado)
e muitos so poli-insaturados.
3. As propriedades fsicas dos cidos graxos dependem do grau de insaturao da cadeia
hidrocarbonada. As molculas dos cidos graxos saturados so muito flexveis, facilitando a
atrao e coeso entre si. Duplas ligaes entre C impe rigidez cadeia, tornando-a menos
flexvel e limitando a coesividade entre as molculas do cido graxo. Em conseqncia disso, a
temperatura de fuso (transio de fase slido/lquido) diminui com o grau de insaturao dos
cidos graxos.
4. Os triacilglicerdeos desempenham um papel de reserva de energia metablica. Algumas de
suas propriedades fsico-quimicas so ideais para essa funo: a) elevado grau de reduo de
seus C, maximizando a quantidade de energia livre liberada na oxidao e b) alta
hidrofobicidade, permitindo estocagem livre de gua (estoques anidros). No por acaso que os
triglicerdeos compe cerca de 90% da reserva de energia metablica e tambm da dieta lipdica
dos humanos.
5. A reserva de triacilglicerdeos do tecido adiposo mobilizada atravs da hidrlise a glicerol e
cidos graxos livres, catalisada por lpase especfica. Os cidos graxos livres so carregados
pela corrente sangunea na forma de complexos com albumina, que representa 50% da protena
do plasma. cidos graxos livres so muito insolveis, a ~1microM formam micelas, que so
altamente txicas.
6. A via catablica de degradao de cidos graxos para produo de ATP ocorre na matriz
mitocondrial e se chama beta-oxidao. Esta via leva clivagem sequencial da cadeia do cido
graxo em pares de C, liberando a cada ciclo: 1 acetilCoA, 1 NADH e 1 FADH2 (ver reaes
abaixo), que alimentaro, respectivamente, o ciclo de Krebs e a cadeia respiratria. Mas, a beta-
oxidao exige previamente uma ativao inicial que consome 1 ATP e libera o cido graxo na
forma de acilCoA. Esta etapa preliminar de ativao se d associada membrana externa da
mitocndria e, a transferncia da acilCoa para dentro da mitocndria, mediada pela carnitina.
52
Reaes de um ciclo de beta-oxidao:
O
R CH2 CH2 CH2 C S-CoA (acil-CoA)
oxidao FAD
FADH2
H O
R CH2 C = C C S-CoA (enoil-CoA)
H
hidratao H2O
HO H O
R CH2 C C C S-CoA (L-hidroxiacil-CoA)
H H
oxidao NAD+
NADH
O O
R CH2 C CH2 C S-CoA (ceto acil-CoA)
tilise CoA
O O
R CH2 C S-CoA + H3C C S-CoA (acetil-CoA)
7. A oxidao completa de uma molcula de palmitato (16 C) a CO2 e H2O, atravs da beta-
oxidao, ciclo de Krebs e cadeia respiratria, rende 129 ATP. importante destacar que este
rendimento, medido em ATP/mol-oxidado, muito superior ao da oxidao completa de
aucares e protenas, pois a oxidao de um cido graxo leva liberao de 37,6 kJ/g de
energia livre, enquanto oxidao de aucares ou protenas libera apenas 16,7 kJ/g.
8. Os cidos graxos so sintetizados no citosol por via anablica prpria que adiciona
seqencialmente unidades de 2 C cadeia em crescimento. Esta via alimentada por
acetilCoA, mas s a primeira unidade de 2 C entra como acetilCoA, as subseqentes so na
forma de malonilCoA. Portanto, o acetilCoA precisa ser previamente ativado a malonilCoA, por
carboxilao e consumo de 1 ATP, para permitir a reao de condensao, levando ao
crescimento da cadeia do cido graxo de uma unidade de 2 C, por ciclo de sntese. A ativao
de acetilCoA catalisada pela acetilCoA-carboxilase, uma enzima sujeita a controle complexo,
53
envolvendo regulao alostrica e ativao / desativao por modificao covalente (fosforilao
/ desfosforilao).
9. A sntese de palmitato (16 C) altamente endergnica, obedecendo a sequinte estequiometria:
A elongao da cadeia alm de 16 C e a insero de duplas ligaes feita por outros sistemas
enzimticos especializados, que se localizam na membrana do retculo endoplasmtico. Mas,
mamferos no possuem enzimas para introduzir duplas ligaes em cadeias de cidos graxos
acima do C9. Por isso, linoleato (18:2) e linolenato (18:3), so cidos graxos essenciais que
precisam ser adquiridos pela dieta.
10. importante destacar que animais degradam eficientemente glicose at acetilCoA pela gliclise
e assim podem converter C de acar em cadeias de lipdeo de reserva. Mas, estes organismos
no podem fazer o caminho de volta de cadeias de cido graxo para glicose, pois no possuem
reaes que convertam acetilCoA em piruvato ou oxalacetato.
Grupo de discusso 13
1) Ponto de fuso dos cidos graxos. Os pontos de fuso de uma srie de cidos graxos de 18
tomos de carbono so: cido esterico (69,9oC), cido olico (13,4oC), cido linolico(-5oC) e
cido linolnico (-11oC). Que aspecto estrutural destes cidos graxos de 18 carbonos pode ser
correlacionado com o ponto de fuso? Fornea uma explicao molecular para esta tendncia
do ponto de fuso.
2) Mostre como os cidos graxos so ativados antes de serem degradados. Em que compartimento
celular isso ocorre?
3) Aonde e sob que forma so estocados os cidos graxos? Como os cidos graxos da reserva
metablica so mobilizados para serem oxidados na matriz mitocondrial?
4) Explique os passos da -oxidao dos cidos graxos, partindo de uma molcula de palmitato.
Calcule o rendimento energtico da oxidao completa de palmitato a CO2 e H2O.
54
6) Equacione as etapas que compem o conjunto de reaes que permitem adicionar acetil-CoA
cadeia de cido graxo crescente durante a sntese de palmitato. Mostre que etapa torna o
processo favorecido termodinamicamente.
1. Molculas anfiflicas, como lipdeos com uma nica cauda hidrofbica, cidos graxos livres e
detergentes, quando em soluo aquosa e acima de um limiar de concentrao
(concentrao micelar crtica ou cmc) formam agregados globulares chamados micelas.
2. Por outro lado, lipdeos com duas caudas hidrofbicas, como glicerofosfolipdeos e
esfingolipdeos, tendem a formar bicamadas lipdicas, que so a base estrutural das
membranas biolgicas.
Micela Bicamada
55
para as membranas biolgicas, que foi plenamente confirmado por resultados experimentais
estruturais e funcionais.
56
5. Um exemplo clssico de transporte a tomada de glicose pela hemcia mediada por um
transportador especfico, cuja velocidade depende da concentrao externa de glicose e
obedece a uma curva hiperblica de saturao j bem conhecida da cintica enzimtica,
sendo Kt anlogo a Km:
Esta forma de transporte conhecida como transporte passivamente mediado ou difuso
facilitada. Trata-se de um processo exergnico, pelo qual o soluto, no caso a glicose,
atravessa espontaneamente a membrana indo do compartimento de maior para o de menor
concentrao.
6. Existem 5 transportadores conhecidos que mediam a difuso facilitada de glicose em
humanos: GLUT1 a 5, cujos Kts so diferentes para atender as necessidades funcionais dos
tecidos nos quais so expressos. GLUT1 o transportador em hemcias, j GLUT2
expresso no fgado e clulas beta do pncreas, enquanto GLUT4 aparece no msculo
esqueltico, tecido adiposo etc.
7. Mas, no epitlio do intestino a glicose obtida da dieta transportada para dentro da clula
contra o gradiente de concentrao, portanto atravs de um processo endergnico que exige
consumo de energia metablica para ocorrer e referido como transporte ativo. Neste caso o
transportador chamado simport, pelo qual a glicose transportada junto com Na+ e
termodinamicamente possvel porque existe um gradiente eletroqumico de Na+ de fora para
dentro da clula. H mltiplas formas de transporte ativo, das quais este exemplo da glicose
apenas uma delas. Grande parte da energia metablica consumida pelas clulas se deve
manuteno da enorme diversidade de transportadores que promovem a transferncia de
metabolitos e ons contra gradientes de concentrao.
57
Grupo de discusso 14
1) O que concentrao micelar crtica. Como varia tamanho e forma de micelas formadas por
anfiflicos de uma nica cauda hidrocarbonada? Explique.
2) Uma hiptese central na pesquisa de membranas que os lipdeos da membrana devem ser
fludos (em oposio a "congelados") a fim de que a membrana possa desempenhar suas
funes. O apoio para esta hiptese fornecido pela observao de que a composio de cido
graxo das membranas pode ser alterada pelas condies nas quais a bactria cresce. Por
exemplo, se a bactria est crescendo em temperatura menor que a normal, as quantidades
observadas de cidos graxos insaturados (relativas ao contedo de cido graxo saturado) esto
acima do normal.
Contrariamente, se a bactria est crescendo em temperatura acima da normal, as quantidades
observadas de cidos graxos insaturados nos lipdeos da membrana (relativas aos cidos
graxos saturados) esto abaixo do normal.
a) Sugira razes para o fato de que o contedo lipdico na membrana bacteriana deve ser fluido
para que a membrana intacta opere apropriadamente.
b) Explique como a alterao observada nos nveis dos cidos graxos insaturados relativa aos
nveis dos cidos graxos saturados, em diferentes temperaturas de crescimento, apia a
hiptese da fluidez da membrana.
3) Fornea uma explicao termodinmica para o fato de que molculas de fosfolipdeo difundem
rapidamente no plano da bicamada, mas muito lentamente mudam de uma face oposta.
5) Explique porque soda funciona bem para desentupir pias entupidas com gordura animal.
6) Para saber se uma bactria tomava leucina e etileno glicol por transporte mediado ou no
mediado, foram feitas medidas de velocidade inicial de tomada em funo da concentrao de
ambas substncias, resultando na tabela fornecida abaixo. O que voc conclui do exame dessa
tabela? Explique e calcule Kt e Vmax se encontrar evidncias de transporte mediado.
58
Componente Concentrao [M] Velocidade Inicial (unidades arbitrrias)
-6
Leucina 1 x 10 110
-6
2 x 10 220
-6
5 x 10 480
-5
1 x 10 830
-5
3 x 10 1700
-4
1 x 10 2600
-4
5 x 10 3100
-3
1 x 10 3200
-3
Etileno glicol 1 x 10 1
-3
5 x 10 5
0,01 10
0,05 50
0,1 100
0,5 500
1,0 1000
59
MDULO 15: CICLO DAS PENTOSES
1. Muitas funes celulares que envolvem reaes endergnicas so efetuadas graas hidrlise
exergnica de ATP. Outras reaes endergnicas, como a sntese de cidos graxos e colesterol
e a fotossntese, requerem NADPH, que tem um grande poder redutor.
2. O grupo fosforila no carbono 2 de uma das unidades de ribose do NADPH o diferencia de NADH.
NADH oxidado pela cadeia respiratria para gerar ATP, enquanto que NADPH serve como um
doador de eltrons em reaes biossintticas redutoras.
3. Na via das pentoses, NADPH gerado quando a glicose-6-fosfato oxidada a ribose-5-fosfato,
que um acar de 5 carbonos, componente de vrios compostos importantes, como ATP, CoA,
NAD+, FAD, RNA e DNA.
4. A via das pentoses tambm catalisa a interconverso de acares de 3, 4, 5, 6 e 7 carbonos, em
uma srie de reaes no oxidativas que ocorrem no citosol.
5. As reaes da via das pentoses so as seguintes:
glicose-6-fosfato desidrogenado e convertido a ribulose-5-fosfato, em trs reaes,
produzindo 2 NADPH + H+.
ribulose-5-fosfato isomerizada a ribose-5-fosfato.
Nestas reaes, 2 NADPH + H+ e uma ribose-5-fosfato so gerados para cada glicose-6-fosfato
oxidada.
ribose-5-fosfato convertida a gliceraldedo-3-fosfato e frutose-6-fosfato pela transcetolase e
transaldolase. A transcetolase catalisa a transferncia de unidades de C2 de uma cetose para
uma aldose. A transaldolase transfere unidades de C3 de uma aldose para uma cetose.
As reaes de transcetolase e transaldolase criam uma ligao reversvel entre a via das
pentoses e a via glicoltica. O resultado dessas reaes a formao de 2 hexoses e 1 triose a
partir de 3 pentoses:
C5 + C5 C3 + C7 Transcetolase
C7 + C3 C4 + C6 Transaldolase
C5 + C4 C3 + C6 Transcetolase
6. O excesso de ribose-5-fosfato formado pela vias das pentoses pode ser completamente
convertido em intermedirios da via glicoltica.
7. A primeira reao da via das pentoses, a desidrogenao da glicose-6-fosfato, praticamente
irreversvel. E essa a reao em que a via das pentoses controlada. O fator regulatrio mais
importante o nvel de NADP+, o receptor de eltrons na oxidao da glicose-6-fosfato a 6-
fosfogluconolactona. Alm disso, NADPH compete com NADP+ pela ligao enzima. A parte
no oxidativa da via das pentoses controlada principalmente pela disponibilidade de substratos.
60
8. A via percorrida pela glicose-6-fosfato depende da necessidade celular de NADPH + H+, ribose-5-
fosfato e ATP:
Quando muito mais ribose-5-fosfato requerida que NADPH + H+, a maior parte de
glicose-6-fosfato convertida a frutose-6-fostato e gliceraldedo-3-fosfato pela via
glicoltica, a transaldolase e a transcetolase convertem esses em ribose-3-fosfato.
Quando a necessidade de NADPH + H+ e ribose-5-fosfato esto balanceadas, a reao
predominante a formao de 2 NADPH e uma ribose-5-fosfato de glicose-6-fosfato pela
fase oxidativa da via das pentoses.
Quando muito mais NADPH + H+ requerido que ribose-5-fosfato, a glicose-6-fosfato
completamente oxidada a CO2, ou convertida a piruvato.
Grupo de discusso 15
1) Mostre a parte oxidativa do ciclo das pentoses com as equaes das reaes envolvidas,
indicando os agentes oxidantes e a origem do carbono presente no CO2 liberado.
3) Quando h necessidade de NADPH, o ciclo das pentoses pode funcionar dando um resultado
lquido que equivale oxidao total de glicose a CO2. Explique este processo atravs das
respectivas reaes estequiometricamente equilibradas.
4) Ribose 5-fosfato pode ser obtida para a sntese de nucleotdeos atravs da via das pentoses, com
ou sem oxidao da glicose. Mostre como isso possvel com as respectivas equaes
qumicas.
4.) Explique como a via da pentosefosfato controlada, tendo em vista que grande parte das
reaes dessa via reversvel.
61
MDULO 16 E 17 FOTOSSNTESE
62
eltrons para a reduo de NADP+. Como resultado temos a oxidao do FS II e a reduo do
FS I. A reposio de eltrons em PS II feita por eltrons provenientes da oxidao de gua e,
em PSI, por eltrons emitidos por PSII.
10. Os componentes envolvidos no transporte de eltrons de H2O para NADP+ com produo de
NAPDPH + H+ esto organizados em trs partculas, que esto ligadas a membrana tilacide: (1)
fotossistema II; (2) complexo do citocromo b6f; (3) fotossistema I (fotofosforilao no-ciclica).
11. Os cloroplastos geram ATP de maneira muito semelhante da mitocndria, ou seja, atravs do
acoplamento da dissipao de um gradiente de prtons sntese de ATP.
12. Na fotofosforilao cclica, os eltrons emitidos por P700 (PSI) so transferidos ao complexo
citocromo b6f, retornando finalmente a P700. No h sntese de NADPH + H+, nem liberao de
oxignio.
13. Na fase clara da fotossntese, ATP e NADPH + H+ so sintetizados, e esses so utilizados na
fase escura para a sntese de carboidratos. A via pela qual as plantas incorporam CO2 em
carboidratos denominada de Ciclo de Calvin.
14. O ciclo de Calvin engloba duas fases: (1) a fase de produo, na qual 3 molculas de ribulose-5-
fosfato reagem com 3 molculas de CO2, gerando 6 molculas de gliceraldedo-3-fosfato, com o
gasto de 9 ATPs e 6 NADPH + H+; (2) a fase de recuperao, na qual os tomos de carbono de 5
gliceraldedo-3-fosfato entram em uma srie de reaes para dar origem a 3 ribulose-5-fosfato,
com as quais o ciclo recomea.
Grupo de discusso 16
63
4) Porque a descoberta da reao de Hill, em 1939, deu apoio hiptese anterior de Van Niel,
propondo que o O2 da fotossntese vem da gua?
Grupo de discusso 17
6) Quando uma suspenso de algas verdes iluminada na ausncia de CO2 e depois incubada no
escuro com CO2 radiomarcado [14CO2], o 14
CO2 convertido em [14C]-glicose por um curto
tempo. Qual o significado dessa observao e como ele est relacionado com as reaes
14
luminosas da fotossntese? Por que cessa a converso de CO2 depois um curto intervalo de
tempo?
64
MDULO 18: METABOLISMO DO GLICOGNIO
65
8. A glicognio fosforilase e glicognio sintase formam um ciclo que, respectivamente, libera e
deposita glicose-1-P no estoque da glicognio:
UTP + H2O 2 Pi
Glicose-1P UDPG
Glicognion
Fosforilase SintaseI
Pi Glicognion+1 UDP
fcil notar que se estas enzimas funcionarem concomitantemente o ciclo ser FTIL, cujo
nico resultado lquido ser dissipao de energia atravs da reao:
UTP + H2O UDP + Pi
Conclui-se que, necessariamente, no hepatcito estas enzimas so coordenadamente
reguladas, isto , quando a fosforilase ativada para mobilizar glicose-1-P, a sintase
desativada, e vice-versa, conforme a necessidade celular.
9. Ambas fosforilase e sintase so reguladas por fosforilao (modificao covalente) em resduos
especficos de serina, reaes catalisadas pela mesma protena-quinase que possui dupla
especificidade, sendo por isso chamada de sintase-fosforilase quinase. A fosforilase e a sintase
so espcies fosforiladas, portanto a fosforilao, catalisada pela sintase-fosforilase quinase,
causa ativao da fosforilase e inativao da sintase.
10. A fosforilase a e a sintase I (formas ativas), por um lado, e a fosforilase b e a sintase D (formas
no ativas), por outro, so, respectivamente interconversveis. Para tanto necessrio que
fosforilase a e a sintase I sejam desfosforiladas, atravs de uma reao que requer catlise. A
principal enzima, catalisadora comum destas desfosforilaes, a fosfoprotena fosfatase 1.
11. A integrao metablica requerida pelo bom funcionamento do organismo faz com que as
interconverses coordenadas da fosforilase e sintase do glicognio no fgado, por fosforilao,
sejam controladas extracelularmente por hormnios especficos, principalmente: adrenalina,
glucagon e insulina.
12. As formas inativas fosforilase b e sintase D so intracelularmente estimuladas por fatores
alostricos positivos, por razes de economia interna do metabolismo celular,
independentemente de controle hormonal. So estimuladores alostricos da fosforilase b e
sintase D, respectivamente, 5-AMP e glicose-6P.
66
Grupo de discusso 18
2) Qual a finalidade das reservas de glicognio do fgado e msculo? Qual a principal diferena
bioqumica entre esses tecidos?
67
2. Pode se controlar a sntese ou degradao enzimtica; tambm se pode modular a atividade
enzimtica atravs de mudanas conformacionais da prpria enzima provocada atravs da
ligao de compostos ou grupos na cadeia peptdica: regulao alostrica e regulao por
modificao covalente. A concentrao enzimtica tambm pode variar conforme a oferta do
substrato; alterao mediada atravs de hormnios.
3. Hormnios so sinais qumicos que permitem a comunicao entre clulas. So sintetizados em
clulas glandulares para atingir clulas alvo atravs da circulao sangunea. As clulas alvo
respondem a hormnios especficos por possurem os respectivos receptores hormonais. A
ligao do hormnio ao receptor segue uma reao de equilbrio semelhante interao
enzima-substrato: H + R [RH]: a constante de dissociao de RH (KD), correspondente
reao inversa muito baixa - (10-12 a 10-9 M) - devido alta afinidade entre hormnio e
receptor.
4. Uma parte importante dos receptores hormonais so protenas integrais de membrana, muitas
da quais tem, atualmente, sua estrutura primria conhecida e sua estrutura tridimensional
modelada, em conseqncia da clonagem e seqenciamento dos seus respectivos genes. Por
exemplo, o receptor -adrenrgico do hormnio adrenalina, encontrado em hepatcito e outros
tipos celulares, possui um peso molecular de 64 kD, compreendendo uma nica cadeia
peptdica que, de maneira serpentiforme, atravessa a membrana 7 vezes, deixando do lado
extracelular, a extremidade N-terminal e 3 alas, e do lado intracelular, outras 3 alas mais a
extremidade C-terminal. A poro extracelular do receptor contm o stio de ligao da
adrenalina, enquanto a poro intracelular se associa a um trmero de protenas conhecidas
como protena-G, por ter um stio especfico para ligao do nucleotdeo GTP. So hoje
conhecidos mais de 1000 receptores, de mltiplos hormnios, com esta estrutura bsica
formando a superfamlia chamada dos receptores associados a protena-G. A funo deste
receptor transduzir o sinal adrenalina de fora para dentro da clula, processo que mediado
pelas protenas-G. H tambm receptores presentes no citoplasma nuclear e citoplasmtico e
neste caso, o hormnio precisa ter alta solubilidade a lipdeos, atravessando a membrana
plasmtica como os hormnios esterides para encontrar o seu receptor dentro da clula.
5. Os hormnios esto envolvidos no metabolismo em dois nveis: induo ou represso gnica de
determinadas enzimas ou atravs da modificao covalente: A fosforilao mediada pelas
protenas quinases que transferem o grupo fosfato do ATP para resduos especficos de serina,
treonina e tirosina, formando uma ligao ster fosfrico ou a retirada do grupo fosfato
catalisada pela ao de fosfoprotenas fosfatases atravs da hidrlise.
6. A ligao de adrenalina ao receptor -adrenrgico acoplado a protena G ativa a enzima
adenilato ciclase atravs da ativao da subunidade (por ligao de GTP), presente na face
interna da membrana citoplasmtica, qual ativa a adenilato ciclase, catalisando a formao de
cAMP a partir de ATP e desencadeando a transduo de sinal. A descoberta de cAMP, por
Sutherland e colaboradores h cerca de 40 anos, levou criao do conceito do segundo
68
mensageiro da ao hormonal, sendo cAMP o primeiro a ser descrito, e permitiu dar incio
progressiva compreenso dos mecanismos de ao do receptor de adrenalina. Devemos
lembrar que os primeiros mensageiros qumicos extracelulares so os hormnios. cAMP tem
efeito transiente e hidrolisada pela ao da fosfodiesterase. Na clula, o balano entre as
reaes de sntese (a) e degradao (b) regula a concentrao intracelular do cAMP.
a) ATP + H2O cAMP + 2 Pi; catalisada pela adenilato ciclase
b) cAMP + H2O AMP; catalisada pela fosfodiesterase.
7. A base da ao metablica do cAMP a ativao alostrica de uma quinase cujos substratos
so protenas, sendo conhecida como protena quinase dependente de cAMP, ou simplesmente
PKA (Protein Kinase dependent on cAMP). A PKA, uma vez ativada, catalisa a fosforilao
ativadora (modificao covalente) de uma cascata de protenas quinases que terminam na
fosforilao da fosforilase a e da sintase do glicognio, causando, respectivamente, a ativao e
a inativao dessas enzimas. O resultado final dessa seqncia de ativaes enzimticas, com
alternncia de regulao alostrica e modificao covalente, a fosforlise do glicognio
liberando glicose-1P, comandada por sinais hormonais extracelulares.
8. Os efeitos de ativao ou no da via dependem do receptor ativado, no caso dos receptores
adrenrgicos, os efeitos de 1 so mediados atravs dos ons clcio e e a ativao de 2 leva a
inibio da via de adenilato ciclase. H casos aonde a protena G do tipo Gs sendo ativadora
de adenilato ciclase e do tipo GR inibindo a adenilato ciclase. Algumas toxinas podem ativar ou
bloquear a via de transduo de sinal: toxina da clera e a toxina da coqueluche.
9. Dois hormnios so os principais responsveis pelo equilbrio da concentrao da glicose
circulante: glucagon e insulina.
10. O glucagon um hormnio que tem efeitos equivalentes aos da adrenalina no controle do
metabolismo do glicognio: possui um receptor da famlia dos receptores acoplados a protena-
G e ativa a cascata que se inicia com cAMP/PKA. Este liberado em condies de hipoglicemia
ativando processos degradativos para manuteno da glicemia sangunea. A PKA (protena
quinase ativada por cAMP) fosforila a fosforilase quinase tornando-a ativa. A fosforilase quinase
fosforila agora glicognio fosforilase. A glicognio fosforilase ativada (quando fosforilada,
glicognio fosforilase b a) catalisa a hidrlise de resduos de glicose do glicognio liberando
grupos de glicose-1-fosfato. No mesmo tempo, a fosforilase quinase, ativada pela cascata do
receptor de glucagon-protena-G, cAMP/PKA, fosforila a glicognio sintase, a qual se torna
inativa quando fosforilada (sntase I sintase D).
11. A insulina tem efeito oposto, promove a absoro de glicose pelo fgado e msculos e usa
deposio nas reservas de glicognio. Mas importante notar que a insulina tem mecanismos
de ao totalmente diferentes da adrenalina e do glucagon. Os receptores de insulina no
pertencem famlia dos receptores acoplados a protena-G e no tm ao sobre a adenilato
ciclase. Seus receptores so do grupo de receptores cujo domnio intracelular apresenta
atividade intrnseca de protena-quinase de tirosina. A insulina estimula fosfoprotenas
69
fosfatases. Para reverter a ao do glucagon, a insulina promove a ativao da fosfoprotena
fosfatase que catalisa a desfosforilao da glicognio fosforilase e da glicognio sintase, levando
a inativao da primeira (fosforilase a b) e ativao da segunda (sntase D sintase I). Desta
forma o fluxo glicoseglicognio favorecido. O transporte da glicose no interior das clulas
com a atuao da insulina um processo passivo mediado por uma famlia de permeases
denominadas GLUT (glucose transporter).
12. Respostas celulares rpidas desencadeadas por hormnios s podem ser obtidas atravs da
ativao, ou da inibio, de enzimas pr-existentes. Hormnios esterides (por exemplo cortisol)
quando secretados difundem-se pela membrana citoplasmtica e ligam-se ao seus receptores
intracelulares os quais, quando ativados, promovem no ncleo a regulao do metabolismo pela
induo da transcrio de genes que codificam enzimas especficas, levando sntese de novo
das protenas correspondentes, fenmeno conhecido como induo enzimtica. Mas o
mecanismo de induo enzimtica desencadeado por hormnios resulta necessariamente numa
resposta celular lenta, uma vez que os RNAs mensageiros (mRNAs) precisam ser transcritos,
processados, transportados para o citoplasma e finalmente traduzidos para produzir as
protenas enzimticas exigidas.
13. A adrenalina estimula uma resposta local no msculo. A liberao de adrenalina induzida por
estmulo nervoso autnomo em situaes de perigo, exerccio fsico, e hipoglicemia e induz a
degradao do glicognio com os fins de fornecer glicose-1-fosfato como fonte de energia para
atividades musculares que permitem ao animal reagir a estas situaes.
14. Regulao da gliclise e gliconeognese. A gliclise uma das vias metablicas principais para
o fornecimento de energia. No fgado, encontra-se tambm a gliconeognese, a qual , de forma
geral, uma via antagnica da gliclise. A regulao das duas vias feita de forma reciproca, isto
, quando uma delas est ativa, a outra est inibida. H trs vias sob controle metablico: as
converses reversveis de: (i) glicose para glicose-6-fosfato (hexoquinase e glicose-6-fosfatase);
(ii) frutose-6-fosfato e frutose-1,6-bisfosfato (fosfofrutoquinase e frutose-1,6-bisfosfatase; e (iii)
fosfoenolpiruvato e piruvato (piruvato quinase e fosfoenolpiruvato carboxiquinase, piruvato
carboxilase). A fosfofrutoquinase o principal ponto de regulao da gliclise. AMP e frutose-
2,6-bisfosfato agem como efetuadores alostricos positivos. A formao de frutose-2,6-bisfosfato
est sob controle hormonal. Em condies de hipoglicemia, o glucagon estimula a produo de
cAMP no fgado. Isso ativa a PKA a fosforilar e inativar a fosfofrutoquinase e ativar a frutose-
bisfosfatase-2, diminuindo a concentrao de frutose-2,6-bisfosfatase. Como resultado, o
equilbrio entre as reaes de fosfofrutoquinase alterado, em favor da sntese de frutose-6-
fosfato, aumentado o fluxo gliconeognico e a sntese de glicose-6-fosfato. Ao contrrio, em
condies de hiperglicemia, as concentraes de cAMP diminuram, e o conseqente aumento
de frutose-2,6-bisfosfato ativa a fosfofrutoquinase e promove a gliclise.
70
Grupo de discusso 19
1) Os hormnios podem ser de natureza qumica muito diferente, por exemplo, adrenalina, uma
catecolamina, e glucagon, um peptdeo. Apesar disso, desencadeiam o mesmo processo
metablico no fgado, isto , mobilizao de glicose da reserva de glicognio. Se um hormnio
um sinal qumico, como possvel que substncias quimicamente to diferentes transmitam a
mesma sinalizao metablica para o hepatcito?
3) As vias metablicas clssicas como, por exemplo, a gliclise e a via de biossntese de cidos
graxos, cuidam da grande massa do trabalho metablico, como, respectivamente, produo e
armazenamento de energia. H, no entanto, vias ou circuitos, quantitativamente insignificantes,
mas fundamentais, para o controle das vias metablicas massivas. Os circuitos, ou vias
regulatrias, acionados pelos hormnios pertencem a este grupo. Que circuito regulatrio
permite adrenalina promover a gliclise no msculo e a gliconeognese no fgado?
6) A concentrao de ATP na clula est em torno de 5 mM. A quantidade total de ATP pequena
e fonte primria de energia para o funcionamento celular. Por outro lado, o ATP tambm o
reagente que permite gerar cAMP, um dos mais importantes sinais qumicos intracelulares de
regulao metablica. Alm disso, cabe lembrar que todos os efeitos regulatrios do cAMP
decorrem da ativao da enzima quinase de protena dependente de cAMP, conhecida como
PKA. Tendo em conta todos estes fatos conhecidos, qual deve ser a ordem de grandeza da
constante de ativao (Ka, semelhante a Km) de PKA por cAMP? Justifique sua resposta.
71
MDULO 20: METABOLISMO DE AMINOCIDOS
Por outro lado, glutamina e glutamato podem ser desaminados em reaes catalisadas pela
glutaminase e desidrogenase glutmica, respectivamente:
O ction amnio txico, sendo utilizado para a sntese de glutamina ou convertido em uria no
ciclo correspondente, para fins de excreo.
7. Aminocidos como alanina, aspartato e glutamato so ditos glicognicos porque podem ser
convertidos em, respectivamente, piruvato, oxalacetato e alfa-cetoglutarato, que, por sua vez,
podem ser transformados em fosfoenolpiruvato para sntese de glicose. J os aminocidos
leucina e lisina so chamados cetognicos por produzirem exclusivamente acetilCoA como
produto de degradao, portanto servindo sntese de corpos cetnicos, mas no de glicose.
72
Grupo de discusso 20
2) A amnia pode ser txica para a mitocndria heptica? Como se explica bioquimicamente esta
toxidez? Que reaes e respectivas enzimas protegem a mitocndria da toxidez de amnia?
3) Uma das duas principais reaes de entrada de NH3 no metabolismo a reao catalisada pela
glutamina sintetase. Mostre a equao dessa reao. Qual a importncia da glutamina para o
metabolismo? D exemplos.
5) Humanos sintetizam parte dos aminocidos que precisam, o restante obtido da dieta e por isso,
chamados essenciais. Mostre, com as reaes pertinentes, porque e como alguns aminocidos
so sintetizados por humanos e qual a limitao que impede a sntese dos essenciais.
73
especializadas do gnero Rhyzobium, que so simbiontes de plantas leguminosas, reduzem
eficientemente N2 a NH4+, uma espcie qumica totalmente compatvel com o metabolismo de
todos os organismos. Portanto, o N2 fixado por essa simbiose entre planta e bactria garante a
disponibilidade do elemento N para todas as formas de vida terrestre. As bactrias fixadoras de
N2 possuem um complexo enzimtico singular, a nitrogenase. A reao de reduo do N2 a NH4+
(fixao de nitrognio), qual envolve um redutor poderoso a grande investimento de energia na
forma de ATP, catalisado pela nitrogenase, qual usa NADPH + H+ como doador de eltrons:
3. A volatilidade do NH4+ (NH3 + H+) no favorece sua permanncia no solo, mas existem bactrias
autotrficas de vida livre, muito abundantes e largamente disseminadas, que so especializadas
na oxidao do ction amnio a nitrito e nitrato para fins de obteno de energia metablica.
Desta maneira o elemento N estavelmente depositado no solo na forma de espcies qumicas,
sais de nitrito e nitrato, que so eficientemente absorvidas pelas razes das plantas e
prontamente reduzidas a NH4+ no interior da clula vegetal.
As etapas sumariamente mencionadas compreendem o ciclo do nitrognio na natureza: a)
reduo do N2 a NH4+; b) oxidao de NH4+ a nitrito e nitrato; c) reduo de nitrito e nitrato a
NH4+ e d) transformao do elemento N de inorgnico para orgnico com a sntese de
aminocidos a partir de NH4+, reao possvel em todas a formas de organismos biolgicos.
Grupo de discusso 21
1) CO2 e N2 existem na atmosfera e so fontes dos elementos C e N para os seres vivos. CO2
eficientemente fixado pelas plantas em geral atravs da fotossntese. N2 por outro lado, apesar
de extremamente abundante, 70 a 80% do ar, no fixado pela grande maioria das plantas, que
necessitam espcies reduzidas ou oxidadas de N2 para a sntese de compostos nitrogenados.
Somente algumas poucas formas de bactrias tm a capacidade de fixao de N2. Compare o
processo de fixao de CO2 com o de fixao de N2, e procure mostrar porque as plantas fixam
muito bem CO2, mas no N2.
74
4) Certas bactrias oxidam NH3 a nitritos e nitratos, enquanto plantas e bactrias em geral reduzem
nitritos e nitratos a NH3. Qual a funo da reduo de nitritos e nitratos na vida desses
organismos?
75
MICROPIPETADORES
76
Fonte: http://www.analiticaweb.com.br/
77
LABORATRIO 1: FOTOMETRIA E ESPECTROFOTMETRO
I. FUNDAMENTOS
mais luz),
2) do percurso que o feixe de luz percorrer na soluo e
3) da concentrao do composto nessa soluo.
A = .l.c
onde:
A = absorbncia definida pela reao seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma razo, no
possui unidade (Io intensidade de luz incidente; It intensidade de luz transmitida);
= absortividade molar (caracterstico de cada substncia), em L.(mol.cm)-1;
l = caminho ptico (percurso da luz monocromtica na soluo), em cm;
c = concentrao da substncia em mol/L.
78
l
I0 It
*
Absorbncia *
*
*
*
Concentrao (mol/L)
Esse mtodo faz uso da propriedade de ons Cu2+ em meio alcalino de formar ligaes com o
nitrognio das ligaes peptdicas. Desta reao (reao de biureto) resulta uma colorao prpura
intensa. Este fato pode ser explorado para se determinar por colorimetria a quantidade de protena
de uma soluo. A cor desenvolvida numa reao de ons de Cu2+ em meio alcalino com estas
79
protenas deve-se exclusivamente s ligaes peptdicas e a sua intensidade proporcional a
quantidade de tais ligaes. A absorbncia detectada no espectrofotmetro (figura 2).
Um outro mtodo para determinar a quantidade de protena baseado no fato que certos
aminocidos possuem anis aromticos o que os leva a absorver em comprimentos de onda
especficos na regio de UV. Bases purnicas e pirimidnicas tambm possuem estas propriedades.
II. OBJETIVOS
Adicionar no tubo 1:
Adicionar no tubo 2:
80
- 1,5 mL de gua,
- 2,5 mL de reagente de biureto.
Aps adio dos reagentes, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37oC.
Transferir contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as absorbncias nos
comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600, 630, 650, 680 e 700 nm. Usar a
soluo de biureto como branco (tubo 2).
Com isso, voc estar construindo a curva de absorbncia em funo do comprimento de
onda. Estabelecer qual o mx do produto da reao de biureto.
Tabela 1 Dados para a construo da curva padro para determinao de concentrao de protenas.
Padro de
protena reagente concentrao absorbncia (540
tubos albumina gua destilada
desconhecida biureto (mg/mL) nm)
(8mg/mL)
branco - - 1,5 mL 2,5 mL
1 0,1mL - 1,4 mL 2,5 mL
2 0,2mL - 1,3 mL 2,5 mL
3 0,4mL - 1,1 mL 2,5 mL
4 0,7mL - 0,8 mL 2,5 mL
5 1,0mL - 0,5 mL 2,5 mL
amostra
- 1,0 mL 0,5 mL 2,5 mL
desconhecida
81
2a) Determinao do mx
Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, o relatrio deve incluir
as seguintes questes respondidas:
2. Na construo de uma curva padro (absorbncia por concentrao), percebeu-se que essa no
passava pela origem das coordenadas. Aponte pelo menos uma causa para explicar esse fato.
3. Por que se deve esperar 15 minutos para ler a absorbncia aps a adio do biureto?
82
5. Na determinao da creatinina do sangue, 4,0 mL da soluo 1:10 de filtrado de sangue
desproteinizado foram tratados com 2,0 mL de uma soluo recm preparada de cido pcrico meio
saturada em NaOH 5%. Aps 5 min a leitura da cor formada em 530 nm foi de 0,085 de absoro. 4
mL de um padro contendo 0,03 mg de creatinina tratados semelhantemente mostraram uma leitura
de 0,425. Qual a concentrao de creatinina em mg por 100 mL?
a) Uma soluo de transferrina exibe uma absorbncia de 0,463 em 470 nm em uma clula de 1 cm.
Calcule a concentrao de transferrina em miligramas e a concentrao de ferro em microgramas
por mililitro.
b) Pouco tempo depois da adio de desferrioxamina (que dilui a amostra), absorbncia em 470 nm
foi de 0,424 e a absorbncia em 428 nm foi de 0,401. Calcule a frao de ferro na desferrioxamina.
Lembre-se de que a transferrina se liga a dois tomos de ferro, e a desferrioxamina se liga apenas a
um.
83
LABORATRIO 2: TITULAO E CROMATOGRAFIA DE AMINOCIDOS
I. FUNDAMENTOS
Aminocidos
As unidades constituintes das protenas so os L--aminocidos. Como o prprio nome
indica, estes compostos apresentam pelo menos um grupo amino (-NH2) e um grupo carboxlico (-
COOH). Em conseqncia deste fato, ao serem dissolvidos em gua, os aminocidos apresentam
carter anfotrico, ou seja, comportam-se como cido e como base. Os grupos amina e carboxila
podem sofrer protonaes e desprotonaes reversveis, comportando-se como eletrlitos fracos.
Se os considerarmos em suas formas de cidos conjugados: -NH3+ e -COOH, veremos que cada um
deles apresentar um valor de pKa. Assim, um aminocido apresenta pelo menos dois valores de
pKa e dependendo da natureza ionizvel ou no do grupo R (radical) ligado ao carbono a, pode
ocorrer ou no um terceiro valor de pKa. Em pH 7,0 o amino grupo apresenta-se protonado (forma
cida) e o grupo carboxila desprotonado (forma bsica) (figura 1).
Quanto mais apolar for o grupo R, maior a mobilidade do aminocido com a fase mvel.
Conseqentemente a relao (RF) entre a distncia percorrida pelo aminocido no papel e a
85
distncia percorrida pela fase mvel ser tambm maior. A Tabela I apresenta valores de RF de
alguns aminocidos nas condies descritas.
Titulao de aminocidos
Nesta titulao adicionaremos lentamente uma base ou um cido a solues de aminocidos
permitindo a obteno dos respectivos pKas.
A curva de titulao mostra como varia o pH em funo de equivalentes do titulante (cido ou
base forte) adicionados. Para um aminocido, deve-se observar no mnimo dois patamares nessa
86
curva correspondendo titulao dos grupos carboxilato e -amino, respectivamente. No meio de
cada um desses patamares h um ponto de inflexo, cujo valor de pH numericamente igual ao
pKa do grupo correspondente. Essa relao numrica entre pH e pKa facilmente compreensvel
da anlise da equao de Henderson-Hasselbalch.
II. OBJETIVOS
1) Cromatografia em papel
Tomar uma folha (23 x 16 cm) de papel Whatman n 1 e fazer um trao a lpis ao longo do
comprimento maior a 2 cm da borda. Evitar tocar no papel durante toda a operao. Deixar uma
margem de 1,5cm de cada lado. Marcar seis pontos sobre essa linha que distem 4 cm um do outro e
numer-los a lpis de 1 a 6. As amostras devem ser aplicadas nos pontos numerados (3 uL) de tal
modo que a mancha formada sobre o papel seja a menor possvel.
Nos nmeros de 1 a 4 aplicar os padres e no nmero 6, a mistura de padres. A amostra
desconhecida aplicada no nmero 5.
Enrolar o papel de modo a transform-lo em um cilindro e prender as extremidades
superiores com clips.
Colocar 25 mL de solvente de Partridge (n-butanol/cido actico glacial/gua 4:1:1), em uma
placa de Petri e mergulhar o cilindro de papel em seu interior de modo que este fique perfeitamente
na vertical. Evitar que o papel toque na parede da placa.
Cobrir o sistema com um bquer de 2 L e deixar o solvente migrar 10 cm.
Retirar o papel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente.
Secar o papel na estufa.
Mergulhar em soluo 0,1% de ninhidrina em acetona e levar estufa (80C-100C) por
alguns minutos.
Delimitar com lpis as manchas que aparecem no papel.
Determinar o RF dos padres e do aminocido desconhecido e comparar com os dados
fornecidos na tabela 1, para sua identificao.
87
Tabela 1 - RF de aminocidos determinados nas seguintes condies: solvente de Partridge, n-butanol/cido
actico glacial/gua (4:1:1), papel Whatman no1 e 20oC.
Aminocido RF Aminocido RF
2) Titulao
Colocar 50 mL da soluo do aminocido (0,10 M) em pH 1,0 em um bquer e titular com
soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 1 mL at atingir pH 11,0.
Colocar 50 mL de cido actico 0,15 M em outro bquer e titular com soluo 0,5 M de KOH
medindo o pH aps cada adio de 0,5 mL at pH 12,0.
Determinar os pKs do aminocido desconhecido e do cido actico e comparar os pKs com
os dados fornecidos na tabela 2, para sua identificao.
Tabela 2 - pK de aminocidos
88
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 2
Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, o relatrio deve incluir a
cromatografia em papel anexada e a identificao do aminocido desconhecido. Alm disso, deve
conter as seguintes questes respondidas.
1. Esquematize o grfico de titulao de 100 mL de 0,1 M de glicina, pH 1,72 com NaOH 2 M. Faa
pH em funo de equivalentes de OH- e de volume de soluo de NaOH 2 M.
2. Quais so as concentraes das vrias espcies inicas de lisina a pHs 4, 8 e 10 (0,1 M)?
89
LABORATRIO 3: CINTICA ENZIMTICA
I. FUNDAMENTOS
k1 k2
E + S ES E + P
k-1
Vmx . [S]
v =
Km + [S]
90
Figura 1 - Deduo da equao de Michaelis-Menten.
91
Vmx
( / min.l)
mol
Vel. Inicial Reao
Vmx / 2
Km
Concentrao de Substrato (M)
Figura 2 Velocidade de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima michaeliana.
A determinao da velocidade da reao (ou da atividade enzimtica) pode ser feita atravs
da dosagem dos acares redutores formados (frutose e glicose). A dosagem baseia-se na reao
entre o cido 3,5-dinitro-saliclico (DNS) e os acares redutores. Estes monossacardeos reduzem
o DNS fornecendo um produto de cor caracterstica, cuja formao pode ser acompanhada a 540
nm.
Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (mols) de acares redutores formada, por
um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (mols) de
sacarose hidrolisada. Nestas experincias as velocidades da reao sero expressas em mols de
sacarose hidrolisada por minuto.
Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com a maior exatido
possvel. Para isso, o grupo dever organizar-se de maneira a no permitir que a reao se inicie
em tempos diferentes nos vrios tubos. Para tal, importante manter os tubos em gelo durante a
adio dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nos protocolos,
92
com a enzima sendo adicionada por ltimo. Leva-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37C
para reagir. Transcorrido o tempo determinado, os tubos devem voltar, todos juntos e
simultaneamente, para o gelo. Neste ponto a reao pra.
A atividade enzimtica medida em unidade (U), sendo que 1 U a quantidade de enzima
necessria para a formao de 1 mol de produto por minuto.
II. OBJETIVOS
Aps a adio do DNS (cido 3,5-dinitro-saliclico), colocar os tubos em banho-maria fervente por 10
min. Aps este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada. Agitar com
inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540 nm contra o branco.
Construir o grfico absorbncia versus concentrao de sacarose hidrolisada. Este grfico
ser a curva padro.
93
2. Efeito da concentrao da enzima
Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes conforme tabela 2.
Manter todos os tubos no gelo.
sacarose
tampo soluo sacarose
5% em Concentrao Abs. 540
tubos pH 4,77 enzima hidrolisada por
tampo enzima (M) nm
(mL) (mL) min. (mol/min)
(mL)
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3. Efeito da concentrao de substrato
Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes segundo a tabela 3.
Manter todos os tubos no gelo.
sacarose
tampo soluo sacarose
5% em concentrao Abs. 540
tubos pH 4,77 enzima hidrolisada por
tampo sacarose (M) nm
(mL) (mL) min. (mol/min)
(mL)
95
IV. RELATRIO DE LABORATRIO 3
96
LABORATRIO 4: PURIFICAO DE PROTENAS SDS-PAGE E PONTO ISOELTRICO (pI)
I. FUNDAMENTOS
97
Solubilidade
mg/mL
pH
98
Figura 2 Esquerda: ao de peneiramento de um gel poroso de acrilamida. Direita: formao de um gel de
poliacrilamida. O tamanho do poro pode ser controlado pelo ajuste da concentrao do monmero ativado
(acrilamida, em azul) e do interligante (bis-acrilamida, em vermelho).
II. OBJETIVOS
1) Precipitao no pI
Preparar uma srie de tubos de ensaio de acordo com a tabela 1
99
Tabela 1 Preparao dos tubos em diferentes pHs.
Tubo 1 2 3 4 5
cido Actico 0,1 mM 1,0 mL
cido Actico 1,0 mM 1,0 mL
cido Actico 50 mM 1,0 mL
cido Actico 1,0 M 1,0 mL
cido Actico 2,0 M 1,0 mL
PH 6,7 5,7 4,7 3,7 2,7
Turvao (sim / no)
Adicionar, a cada um dos tubos, uma alquota (5,0 mL) de soluo de leite em p desnatado
(5%, previamente centrifugado).
Agitar os tubos e aguardar 5 minutos
Separar alquotas de 1,0 mL, distribuir em tubos plsticos pequenos e centrifugar (5000 rpm,
5 minutos, temperatura ambiente). Descartar a fase sobrenadante e ressuspender o precipitado em
NaOH 0,1M (1,0 mL) (Observao: utilizar o mesmo procedimento mesmo para os tubos que
aparentemente no apresentam precipitado)
Aps a dissoluo total do precipitado, separar uma alquota da soluo obtida (10,0 L)
para SDS-PAGE.
Montar o aparato para eletroforese conforme figura 3 (o gel de eletroforese ser preparado
previamente de acordo com o apndice 1), adicionar na cuba o tampo de corrida at cobrir os
poos do gel para eletroforese.
100
Adicionar tampo de amostra (10 L) a cada uma das amostras, e aquecer (2 minutos,
100C) para desnaturar as protenas. Resfriar (gelo) e aplicar 15 L nos poos do gel para
eletroforese seguindo a ordem da tabela 2.
Aplicar a tenso nos eletrodos do aparato de eletroforese (150 V) e aguardar (30 minutos)
at que o corante marcador (Azul de Bromofenol) se aproxime da base do gel
Interromper a eletroforese e mergulhar o gel em uma soluo de colorao: Coomassie Blue R
(0,25g) em metanol : cido actico : gua (45% : 10% : 45%). Aguardar (5-10 minutos)
Substituir a soluo de colorao pela soluo de descolorao: metanol : cido actico :
gua (45% : 10%: 45%) (15 minutos)
Verificar as protenas coradas, e estimar por comparao, a purificao da amostra.
3. A tabela abaixo mostra valores de pI para diferentes protenas, com seus respectivos valores de
peso molecular (em kDa). Observe a banda de protena purificada corada no gel de poliacrilamida e
a posio relativa ao padro de albumina bovina adicionado.
101
Protena pI Peso Molecular (kDa)
Casena 4,7 20,0-23,0
Insulina 5,4 6,0
Colgeno 6,6 130,0
Hemoglobina 7,1 64,5
Citocromo c 10,6 13,0
Histona 10,8 12,0 a 20,0
De acordo com os valores de pI e de peso molecular, qual seria a protena purificada da soluo
de leite em p?
6. Conforme a figura abaixo, uma mistura de trs protenas cujos valores de pI so 4,0; 7,0 e 11,0 foi
submetida a eletroforese. Usando-se tampes de valores de pH = 4,0; 7,0 e 11,0 esquematizar as
posies relativas das trs protenas em cada tampo. Protenas de mesma carga correriam a
mesma distncia numa eletroforese? Existe alguma possibilidade de se separar protenas diferentes
s que de cargas iguais?
102
7. A mobilidade eletrofortica em pH = 8,6 de uma protena normal e de anlogas anormais (que
tem um aminocido mutado) est representada abaixo. Identifique a que posio corresponde cada
uma das protenas e diga o porqu.
A B Normal C D
(-) (+)
8. Uma protena com 40 kDa e outra com 90 kDa foram utilizadas como padro num gel de
poliacrilamida com SDS. A motilidade relativa foi de 0,92 e 0,54 respectivamente. Qual seria a
massa aparente de uma protena neste gel, com motilidade de 0,72.
9. Apesar de uma cromatografia em coluna de gel filtrao e uma eletroforese gel de poliacrilamida
usarem princpios fsicos semelhantes, porque ao separamos uma protena de 40 kDa e outra de 15
kDa a de maior peso a primeira a ser eluda da cromatografia e a de menor peso a que mais se
move na eletroforese do gel. Em que situaes voc usaria a cromatografia? E a eletroforese?
103
V. APNDICE
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo (aplicando-a no espao entre as placas de
vidro com uma pipeta. Sero necessrios aproximadamente 4,0 mL de soluo. Aguardar a
polimerizao do gel (5 minutos). Ser necessrio deixar aproximadamente 1,0 cm de espao para
aplicar o gel de empilhamento
OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez
para aplicar a soluo no aparato de eletroforese.
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo, aplicando-a sobre o gel de resoluo (deve
preencher um espao de cerca de 1 cm de altura). Colocar um pente plstico para formar os poos
onde as amostras sero aplicadas (de acordo com a demonstrao). Sero necessrios
aproximadamente 1,60 mL de soluo. Aguardar a polimerizao do gel (15 minutos)
104
OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez
para aplicar a soluo no aparato de eletroforese.
Solues utilizadas
Soluo A: Acrilamida e bis-acrilamida
45 g acrilamida
1,2 g bis-acrilamida
gua destilada (at 100 mL)
Tampo de corrida:
Tampo de amostra:
SDS 10% (5,0 mL), 2-mercaptoetanol (0,5 mL), Glicerol (2,0 mL), EDTA 0,1M (0,1 mL), Azul
de Bromofenol 1% (1,0 mL), Soluo C (2,5 mL) e gua destilada (at 20,0 mL).
105
Figura 3 Esquema do aparato para eletroforese.
106
LABORATRIO 5: REAO DE TRANSAMINAO
I. FUNDAMENTOS
107
NH3+ O
R C COO- R C
COO-
H
-CETOCIDO
AMINOCIDO
O NH3
H
C
CH2
HO CH2 O P
HO CH2 O P
+
H3C N +
H H3C N
H
Piridoxal-fosfato Piridoxamino-fosfato
O
NH3+
-OOC CH2 CH2 C
-OOC CH2 CH2 C COO- COO-
H -CETOGLUTARATO
GLUTAMATO
108
Figura 3 Formao de -cetoglutarato e uria a partir de glutamato.
II. OBJETIVOS
109
E tambm um controle negativo (branco) contendo todos os componentes exceto a
preparao enzimtica, que substituda por tampo:
Incubar os dois tubos (reao e controle negativo) a 37C por 30 minutos. Em seguida,
inativar a reao em banho-maria fervente por 3 minutos. Centrifugar a 5000 rpm, 10 minutos
(centrfuga Eppendorf). Decantar o sobrenadante transferindo para um segundo tubo Eppendorf e
fazer a cromatografia com os padres adequados.
3. Cromatografia
Em um papel de filtro Whatman nmero 1 (10 cm X 20 cm) traar com um lpis uma linha
horizontal de 2,5 cm de altura a partir da origem (ponto de contato do papel com a soluo na cuba
de cromatografia). Marcar 7 pontos com 2,5 cm de distncia entre si.
Aplicar, com um capilar de vidro fino, sobre os pontos marcados, uma pequena alquota dos
padres de alanina, glutamato, piruvato, e -cetoglutarato, a mistura de reao, o branco (controle
negativo) e 2,4-dinitrofenil-hidrazina. Sobre os pontos onde foram aplicados os padres e as
amostras, adicionar 3 uL de 2,4-dinitrofenil-hidrazina.
O solvente utilizado para a cromatografia ser uma mistura de butanol/etanol/NH4OH 0,5 M
na proporo 70:20:30 (v/v).
Aps o solvente alcanar 1 cm do final do papel, secar o papel a 80C em estufa e marcar os
produtos coloridos formados. Revelar os aminocidos do cromatograma com a soluo de
ninhidrina, secando em seguida o papel. Marcar a posio das manchas que aparecerem.
2. Procure nos livros a reao que ocorre entre a ninhidrina e os aminocidos e tambm qual a
reao de transaminao que ocorreu em seu experimento.
a) Sugira que enzima possa estar deficiente. Proponha um tratamento para esta condio.
b) Por que a fenilalanina aparece na urina em grandes quantidades?
c) Qual a fonte do fenilpiruvato e do fenilactato?
d) Por que o cabelo da paciente apresentou pores brancas?
111
Gatos, depois de jejum por uma noite, receberam uma nica refeio de uma dieta de aminocidos
completa sem arginina. Dentro de duas horas, os nveis de amnia sanguneos aumentaram de
nvel normal de 18 mg/l para 140 mg/l e os gatos apresentaram sintomas clnicos de intoxicao
pela amnia. Um gato morreu 4,5 horas depois de ingerir apenas 8 g da dieta. Um grupo controle
alimentado com a dieta completa de aminocidos ou com uma dieta de aminocidos ou com uma
dieta de aminocidos onde arginina foi substituda pela ornitina no apresentou nenhum sintoma
clnico anormal.
112